不同形式氧化鋅對斷奶仔豬腸道健康的影響

魏婧雅 郝麗媛 單 強 馬峰濤 孫 鵬

(中國農業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，動物營養(yǎng)學國家重點實驗室，北京100193)

腸道是飼料營養(yǎng)物質消化吸收的主要場所，又是防止腸道內有害物質侵入機體的一道天然屏障。腸道屏障可分為機械屏障、生物屏障和免疫屏障。早期斷奶使仔豬腸道屏障受損，表現(xiàn)出腹瀉、生長性能下降等應激反應[1-2]。鋅是動物機體所需的僅次于鐵的微量元素，在機體內參與營養(yǎng)物質消化吸收代謝、生物抗氧化、細胞與體液免疫、生長發(fā)育與生產性能的發(fā)揮等多種生理活動[3-4]。鋅對腸道屏障功能的發(fā)揮、維持腸道健康也具有重要作用。通常給動物補充鋅，主要是通過向飼糧中添加無機鋅(主要是硫酸鋅、氧化鋅)或有機鋅化合物(氨基酸絡合鋅、蛋白鋅、多糖鋅等)，其中以無機形式的氧化鋅對維持腸道結構功能與緩解仔豬腹瀉效果最好[5]。氧化鋅發(fā)揮緩解腹瀉作用的劑量為藥理劑量(2 000～4 000 mg/kg)，會導致大量未吸收鋅離子隨糞便進入環(huán)境，造成環(huán)境污染[6-7]。我國目前已經明令禁止使用高鋅，2017年新修訂的《飼料添加劑安全使用規(guī)范》中已經禁止使用高鋅。近年來，新型氧化鋅產品包括納米級氧化鋅、蒙脫石-氧化鋅(zinc oxide-montmorillonite hybrid，ZnO-MMT)、包被氧化鋅等的研發(fā)和使用日益受到關注。研究不同形式氧化鋅對斷奶仔豬腸道的影響在實施早期斷奶的生產實踐中具有重要實踐意義。

1 不同形式氧化鋅在飼料中的添加形式與特征

氧化鋅為白色粉末，微溶于水，易溶于酸或堿溶液中。飼料級氧化鋅中鋅含量為80.3%，成本較低，在飼料中穩(wěn)定性強，不易結塊與變性，同時對維生素的吸收影響小，因此是比較經濟的飼料添加劑。研究發(fā)現(xiàn)，氧化鋅只有以化合物形式進入腸道后才對仔豬生長有促進作用，但氧化鋅為兩性分子，易被胃酸降解為鋅離子，所以只有加大氧化鋅添加量才可發(fā)揮促生長作用。

納米氧化鋅是分子直徑在1～100 nm間的一種氧化鋅存在形式。納米氧化鋅粒徑小、表面積較大，表現(xiàn)出較好的抑菌效果，其抑菌效果與表面積呈正比關系，表面積越大，抑菌效果越好[8-9]。納米氧化鋅具有極強的電子得失能力與氧化還原性，從而增強了與細菌等的親和力，通過抑制細菌電子傳遞鏈中酶活性的方式，達到較好的殺菌效果[10]。同時，納米氧化鋅生物利用度高，可減少對環(huán)境的污染。方洛云等[11]報道，300 mg/kg納米氧化鋅與3 000 mg/kg氧化鋅均可提高平均日增重和平均日采食量，降低料重比。

ZnO-MMT是以黏土礦蒙脫石作為氧化鋅載體形成的一種復合物。蒙脫石為三層片狀結構，上下為硅氧四面體，中間為鋁氧八面體。由于蒙脫石具有較強的離子交換特性，近年來被當作藥物分子的控制釋放載體來研究[12]。Hu等[13]將溶膠凝膠法制得的ZnO-MMT應用于斷奶仔豬，結果發(fā)現(xiàn)500或750 mg/kg的ZnO-MMT能提高仔豬腸道黏膜完整性，緩解腹瀉，促進生長。

包被氧化鋅是在氧化鋅外覆蓋一層固體制劑，減少氧化鋅在胃內溶解，進入腸道后被溶解將氧化鋅釋放出來的一種存在形式[14]。因包被技術與包被材料大部分為高科技新型物質，成本高，因此在飼料添加劑中使用脂肪對氧化鋅進行包被。但由于斷奶仔豬腸道內消化脂肪的脂肪水解酶活性不高，因此受到一定的限制[15]。也有使用腸溶包衣對氧化鋅進行包被的，且經研究發(fā)現(xiàn)，較低劑量包被氧化鋅可以發(fā)揮高劑量氧化鋅的功效，發(fā)揮緩解仔豬腹瀉、促進生長的作用。

2 不同形式氧化鋅對斷奶仔豬腸道的影響

斷奶仔豬腹瀉可分為感染性腹瀉和非感染性腹瀉，均與其腸道屏障未發(fā)育完全、腸道屏障結構與功能受損有關，因此從腸道屏障入手研究不同形式氧化鋅對緩解斷奶仔豬腹瀉的作用機制十分必要。

2.1 對腸道機械屏障的影響

腸道機械屏障由腸道黏液層、腸上皮細胞和細胞間緊密連接復合體構成[16-17]。完整的腸道機械屏障黏液層厚，腸上皮細胞與細胞間通透性低，可有效阻止飼糧抗原與病原微生物等穿過腸黏膜侵入機體，減少炎癥及全身性病癥等的發(fā)生。

腸道黏液層是由腸道杯狀細胞分泌的黏蛋白進入腸道后與水、腸腔內其他物質結合形成的凝膠層，具有選擇透過性與阻止病原微生物定植的特性，是隔離腸道菌群接觸上皮細胞必不可少的[18]。Liu等[19]研究發(fā)現(xiàn)，2 425 mg/kg的氧化鋅可以增加斷奶仔豬結腸中分泌中性和酸性黏蛋白(mucins，MUC)的杯狀細胞數(shù)量，同時增加糖基化黏蛋白1、2、13、20的mRNA表達量，促進腸道黏液層的形成，抑制有害微生物接觸腸道上皮細胞。

腸道上皮細胞增殖與凋亡處于平衡狀態(tài)是腸道發(fā)揮機械屏障作用的基礎。Wang等[20]研究發(fā)現(xiàn)，藥理劑量(3 000 mg/kg)氧化鋅可增加還原型谷胱甘肽與氧化型谷胱甘肽比值，改善仔豬腸道細胞氧化還原狀態(tài)，減少氧化應激對斷奶仔豬腸道的損傷，抑制腸道上皮細胞的凋亡，維持腸道上皮的完整性，避免因斷奶造成的腸道功能紊亂。Song等[21]研究發(fā)現(xiàn)，給由乙酸引起的腸道損傷的斷奶仔豬飼喂500 mg/kg ZnO-MMT后，受損的腸道得到恢復，結腸中細胞凋亡酶半胱天冬酶(Caspase)-9和Caspase-3活性下降，上皮細胞凋亡減少。Kim等[22]研究發(fā)現(xiàn)，100 mg/kg脂質包被氧化鋅可明顯提高接受大腸桿菌攻毒斷奶仔豬回腸的絨毛高度/隱窩深度值以及十二指腸、空腸和結腸絨毛和隱窩中杯狀細胞的數(shù)量；相同劑量的脂質包被氧化鋅還可以替代高劑量氧化鋅，增加斷奶仔豬空腸、回腸絨毛高度以及小腸絨毛處杯狀細胞的數(shù)量，緩解大腸桿菌K88攻毒對斷奶仔豬的影響[23]。Tian等[24]研究納米氧化鋅對斷奶仔豬腸道影響時發(fā)現(xiàn)，同對照組相比，納米氧化鋅可明顯提高仔豬空腸絨毛高度、絨毛高度/隱窩深度值，其效果同高劑量氧化鋅相同。胰島素樣生長因子-Ⅰ(insulin-like growth factor-Ⅰ，IGF-Ⅰ)是一類促進細胞分化的調節(jié)細胞增殖的調控因子，有研究顯示，口服IGF-Ⅰ可以增加新生仔豬腸道的重量及空腸、回腸絨毛高度[25]。Li等[26]發(fā)現(xiàn)，藥理劑量氧化鋅可增加4周齡斷奶仔豬小腸黏膜中IGF-Ⅰ與其受體mRNA與蛋白的表達，促進腸上皮細胞增殖，增加小腸絨毛高度。體外研究發(fā)現(xiàn)，動物缺鋅會使腸道閉鎖小帶蛋白-1(zonula occludens protein，ZO-1)mRNA表達量下降，腸道屏障受到破壞[27]。Wang等[28]也發(fā)現(xiàn)，膠囊氧化鋅可顯著增加斷奶仔豬空腸中IGF-Ⅰ mRNA表達量，IGF-Ⅰ具有調節(jié)細胞增殖與分化的功能，可顯著增加空腸中ZO-1 mRNA表達量。上述研究結果表明，納米氧化鋅等新型氧化鋅在降低添加劑量的同時，同高劑量氧化鋅一樣均可影響腸道機械屏障。有研究顯示，高劑量氧化鋅可能是通過激活21日齡仔豬腸道的細胞外信號調節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinases，ERK)，抑制p38絲裂原激活蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinases，p38)和c-jun氨基末端激酶(c-jun N-terminal kinases，JNK)的活動，調節(jié)具有促進細胞生長和分化功能的腫瘤生長因子-β1(TGF-β1)參與的信號通路，保持仔豬腸道上皮的完整性，促進消化吸收，減少腹瀉[29]。而Song等[21]研究發(fā)現(xiàn)，ZnO-MMT可以激活腸黏膜中的ERK1/2和蛋白激酶B(Akt)，影響二者參與的信號通路，改善腸道屏障的修復，減少腹瀉的發(fā)生。

腸道上皮細胞間緊密連接復合體由上皮間緊密連接(Occludin、Claudin)與閉鎖小帶蛋白(zonula occludens protein，ZO)兩大類組成。緊密連接可以允許水和水溶性小分子順利通過，而將大分子物質阻隔在外，防止腸上皮細胞發(fā)生移位[30]。Roselli等[31]在體外培養(yǎng)的人腸道細胞Caco-2的培養(yǎng)液中加入產腸毒素型大腸桿菌(ETEC)后，Caco-2細胞間緊密連接蛋白表達下降并受到損傷，添加氧化鋅后ETEC數(shù)量雖未有變化，但其對細胞的黏附與內化被抑制，且上皮間緊密連接蛋白的表達增加，腸細胞得到保護。體內試驗顯示，高劑量氧化鋅可以增加回腸黏膜中Occludin和ZO-1 mRNA和蛋白表達，降低腸道通透性，有效降低仔豬血漿中D-乳酸含量和二胺氧化酶(DAO)活性[32-33]。納米氧化鋅等新型氧化鋅同樣可以增加斷奶仔豬腸道上皮間緊密連接復合體的mRNA表達[21、24、27]。DAO為存在于小腸絨毛中的高活性胞內酶，是反映腸道機械屏障完整性和受損程度的重要指標。D-乳酸是細菌發(fā)酵的代謝產物，正常機體組織不含有D-乳酸，因此哺乳動物不具備將其快速降解的酶系統(tǒng)。正常情況下，D-乳酸不能進入血液，但當腸黏膜受損、通透性增加時，腸道中細菌產生的大量D-乳酸就可通過受損黏膜進入血液，使血漿D-乳酸含量升高，故血漿中D-乳酸含量可及時反映腸黏膜損害程度和通透性變化[34]。因此，DAO與D-乳酸也是判斷腸黏膜通透性的指標。楊晉青等[35]研究發(fā)現(xiàn)，300 mg/kg的納米氧化鋅可以極顯著降低斷奶仔豬血漿中D-乳酸含量和DAO活性，對降低腸道屏障通透性的效果同高劑量(3 000 mg/kg)普通氧化鋅。Long等[36]的研究結果顯示，同對照組(不添加任何含鋅)相比，添加500 mg/kg的納米氧化鋅與高劑量氧化鋅的斷奶仔豬血清中DAO活性顯著下降，有效降低腸道通透性，證明該劑量的納米氧化鋅完全可以替代高劑量氧化鋅應用于緩解斷奶仔豬腹瀉的生產中。

2.2 對腸道免疫屏障的影響

腸道免疫屏障由腸道相關淋巴組織、腸系膜淋巴結和分泌型免疫球蛋白A(secretory immunoglobulin A，sIgA)組成。腸道黏膜免疫是動物機體在長期進化中不斷地與病原菌做斗爭形成的先天性免疫保護機制，可以對進入腸黏膜的內毒素、細菌等進行攝取、遞呈、處理，減少對機體造成的損害[37]。

腸道屏障受到抗原刺激后，免疫細胞會分泌細胞因子，介導免疫應答、炎癥反應，引起局部免疫反應的發(fā)生，產生多種細胞因子，主要包括白介素、腫瘤壞死因子、干擾素等。白介素-6(IL-6)、白介素-10(IL-10)、腫瘤生長因子-β(TGF-β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和干擾素-γ(IFN-γ)等是免疫細胞分泌的前炎性細胞因子，可促進免疫應答發(fā)生、免疫細胞生長發(fā)育以及炎癥反應的發(fā)生。其中IL-6、TNF-α、IFN-γ是促進炎癥發(fā)生的細胞因子，對動物腸道有損傷作用，相反IL-10、TGF-β則是抗炎癥發(fā)生的細胞因子。蔡景義等[38]研究發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)的豬腸道上皮細胞遭受脂多糖(LPS)刺激后，腸道上皮細胞TNF-α的分泌量顯著增加，IL-10分泌量不受影響；添加氧化鋅后，高濃度氧化鋅短時間與低濃度氧化鋅長時間均可有效抑制TNF-α的分泌，促進IL-10的分泌。且氧化鋅對腸道上皮細胞分泌IL-10具有劑量效應，隨氧化鋅濃度的升高，IL-10分泌量增加，發(fā)揮抗炎作用，增強動物腸道的抗炎能力。呂航[39]研究發(fā)現(xiàn)，2 250 mg/kg氧化鋅可以顯著降低斷奶仔豬空腸黏膜炎癥因子白介素-1β(IL-1β)、IFN-γ的mRNA相對表達豐度，并顯著增加抗炎癥因子TGF-β的mRNA相對表達豐度，減少腸道炎癥的發(fā)生，改善腸道健康。前炎癥因子的分泌受到細胞轉錄調控因子核因子κ增強子結合蛋白(nuclear factor kappa enhancer binding protein，NF-κB)的調控，細胞表面Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)模式識別分子與LPS結合后，激活下游髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88，MyD88)等信號分子，從而激活NF-κB，促進前炎癥因子的分泌。Hu等[40]研究發(fā)現(xiàn)，向斷奶仔豬飼糧中添加600或900 mg/kg的沸石氧化鋅(Z-ZnO)可減少空腸黏膜中TNF-α與IFN-γmRNA表達量，增加TGF-β1和IL-10 mRNA表達量。Shen等[41]研究報道，仔豬飼糧中添加570 mg/kg的包被氧化鋅可顯著降低仔豬空腸中促炎性細胞因子TNF-α與IL-6的mRNA表達量，增加抗炎性細胞因子TGF-β1和IL-10的mRNA表達量。此外，500 mg/kg的ZnO-MMT也可減少空腸黏膜中TNF-α、IL-6和IFN-γ的mRNA表達量[42]。

趨化因子也是免疫細胞分泌的一種細胞因子，可以引導中性粒細胞等免疫細胞向受損傷部位聚集，使受損部位被免疫細胞浸潤而發(fā)生炎癥反應。Sargeant等[43]研究發(fā)現(xiàn)，藥理劑量氧化鋅可以減少大腸桿菌K88引起的斷奶仔豬腸道中炎癥反應的趨化因子生長調節(jié)致癌基因(CXCL)2、CXCL6、CCL19、CXCL13的表達，以及分泌型焦磷酸蛋白(secreted phosphoprotein 1，SPP1)等其他與炎癥反應有關的免疫分子基因的表達。肥大細胞(即嗜堿性粒細胞在消化道黏膜的別稱)是消化道黏膜層中大量存在的一種免疫細胞，可以釋放組胺等細胞因子，增加腸道血管的通透性，引起組織的炎癥反應。肥大細胞在腸道內的增殖與成熟受到干細胞因子(stem cell factor，SCF)的影響，Ou等[44]研究發(fā)現(xiàn)，給28日齡斷奶仔豬飼喂補充100和3 000 mg/kg的氧化鋅飼糧后，高劑量氧化鋅組仔豬腹瀉率顯著下降，空腸中SCF的mRNA表達量下降，十二指腸、空腸上皮細胞中組胺濃度升高，十二指腸、空腸以及回腸中肥大細胞數(shù)量減少，高劑量氧化鋅抑制小腸內SCF的表達，使小腸黏膜與黏膜下層中肥大細胞數(shù)量以及組胺濃度均減少，降低仔豬腹瀉率。

sIgA是腸道免疫細胞分泌的一種抗體，具有中和抗原、抗病毒感染和腸道抗過敏作用，是腸道適應性免疫的重要組成部分[45]。岳雙明[46]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧高蛋白質會使斷奶仔豬發(fā)生腹瀉，血清中IL-1β和IL-6含量明顯升高，而3 000 mg/kg氧化鋅能顯著或極顯著降低血清IL-1β和IL-6含量，同時極顯著增加空腸和回腸黏膜sIgA含量。研究表明，高蛋白質飼糧中添加藥理劑量氧化鋅可抑制前炎癥細胞因子的分泌，促進腸道sIgA的分泌，緩解斷奶仔豬營養(yǎng)性腹瀉。新型氧化鋅影響腸道黏膜sIgA分泌的相關文獻較少，僅Shen等[41]和王超[47]發(fā)現(xiàn)低劑量包被氧化鋅可以促進sIgA的分泌。

2.3 對腸道生物屏障的影響

正常動物腸道壁上定植著大量厭氧或兼性厭氧的有益菌群，構成了腸道的生物屏障。這些有益菌群可以分泌多種酶類，將飼料難以利用物質降解轉化為動物可利用的營養(yǎng)物質，除此之外還可通過與致病微生物競爭定植位點、分泌乳酸等降低腸道pH，競爭生存所需營養(yǎng)物質來抑制致病微生物與腸道上皮結合與生長。氧化鋅可降低仔豬的腹瀉率，而腹瀉的原因可能是由大腸桿菌等細菌引起的感染性腹瀉，所以諸多學者猜想氧化鋅可減少腸道內病原微生物的數(shù)量從而減少腹瀉的發(fā)生，并進行了大量研究。氧化鋅可以改變斷奶仔豬腸道內菌群屬組成的差異，隨著氧化鋅添加量的增加，回腸中菌群豐富度不斷增加，且大腸桿菌數(shù)量也不斷增加[48]。Starke等[49]發(fā)現(xiàn)，2 425 mg/kg氧化鋅飼糧能顯著增加斷奶仔豬小腸中的細菌多樣性，同時降低乳酸菌群多樣性，而使梭菌和大腸桿菌多樣性增加。Yu等[50]使用16S rRNA高通量測序技術對斷奶仔豬回腸與結腸中微生物多樣性進行分析發(fā)現(xiàn)，藥理劑量氧化鋅可以增加斷奶仔豬回腸中螺旋體菌、軟壁菌、廣古菌、疣微菌、TM7共5門菌群的多樣性，而結腸中菌群多樣性則減少。有關氧化鋅對腸道中菌群影響的研究結果也存在著一定分歧，如Li等[26]研究發(fā)現(xiàn)，3 000 mg/kg氧化鋅對21日齡斷奶仔豬回腸末端內容物和糞便中大腸桿菌、乳酸桿菌以及梭菌數(shù)量無顯著影響。相反，有研究顯示高劑量氧化鋅不僅不能影響大腸桿菌數(shù)量，反而使腸道內優(yōu)勢菌群乳酸菌的數(shù)量減少[51-52]。Vahjen等[53]研究發(fā)現(xiàn)，3 042 mg/kg氧化鋅可使28日齡斷奶仔豬回腸內微生物多樣性發(fā)生變化，如回腸優(yōu)勢菌群仍為乳酸菌，但魏斯氏菌、鏈球菌、明珠串菌相對豐度上升；厭氧菌如八疊球菌相對豐度下降。綜上所知，氧化鋅不僅沒有減少反而增加了可引發(fā)腹瀉的大腸桿菌等感染性病原菌的數(shù)量，這與之前的猜想有很大的出入，后有研究學者發(fā)現(xiàn)氧化鋅減少仔豬腹瀉是通過抑制病原微生物在腸道的定植來實現(xiàn)的。體外抑菌試驗結果顯示，納米氧化鋅相比氧化鋅的抑菌作用更強，在納米氧化鋅和普通氧化鋅質量分數(shù)均為5%條件下，二者對大腸桿菌的抑菌率分別達到97.9%和52.9%，對金黃色葡萄球菌的抑菌率分別達到98.8%和68.3%；納米氧化鋅對金黃色葡萄球菌的抑制作用高于對大腸桿菌的抑制作用[54]。納米氧化鋅不僅在體外抑菌試驗中表現(xiàn)出了較好的抑菌作用，動物飼喂試驗也顯示，納米氧化鋅可以顯著降低斷奶仔豬小腸和結腸內容物中梭菌和大腸桿菌的數(shù)量，而且還可以增加回腸和盲腸食糜中微生物的相對豐度[10，55]。韓萌[56]研究發(fā)現(xiàn)，斷奶仔豬飼糧中添加500 mg/kg的納米氧化鋅后，其腹瀉率降低，且回腸微生物多樣性上升，其中厚壁菌門的毛螺菌科、乳酸菌科、韋榮球菌科和紅蝽菌科比例顯著上升，變形菌門的大腸桿菌科比例顯著下降；結腸菌群多樣性雖未發(fā)生變化，但有益菌比例上升，致病菌比例下降。Hu等[42]研究發(fā)現(xiàn)，ZnO可顯著降低28日齡斷奶仔豬小腸中梭菌和大腸桿菌數(shù)量。綜上，新型氧化鋅產品對動物腸道生物屏障也有一定的影響。

3 小 結

氧化鋅可通過促進和維持腸道上皮細胞、黏液層、細胞間緊密連接蛋白的發(fā)育完善與完整，影響腸道免疫細胞分泌炎癥因子、抗炎因子和淋巴細胞增殖分泌免疫球蛋白的腸道免疫屏障，促進腸道優(yōu)勢菌群的生長，抑制病原微生物的定植，建立成熟的腸道生物屏障來抵抗、清除侵入腸道細胞的有害物質，改善腸道健康，從而降低仔豬因斷奶應激等原因造成的腹瀉發(fā)生率(表1)。但在豬生產中，藥理劑量氧化鋅因其過高的使用劑量而對環(huán)境造成一定污染，我國新修訂的《飼料添加劑安全使用規(guī)范》已禁止使用。新型氧化鋅產品的出現(xiàn)，在降低添加劑量的同時，可達到改善斷奶仔豬腸道健康與緩解腹瀉的效果，因此研發(fā)更環(huán)保的新型氧化鋅添加劑并闡明其對動物健康及腹瀉的緩解作用機制必將成為未來畜牧業(yè)生產中的研究熱點。

表1 不同形式氧化鋅對斷奶仔豬腸道屏障的影響

續(xù)表1添加劑類型與劑量Forms and doses of additives腸道機械屏障Intestinal mechanical barrier腸上皮細胞凋亡Intestinal epithelial cell apoptosis絨毛高度Villus height隱窩深度Crypt depth絨毛高度/隱窩深度Villus height to trypt depth ratio緊密連接表達Tight junction protein expressionD-乳酸含量和二胺氧化酶活性D-lactic acid content and DAO activity腸道免疫屏障Intestinal immune barrier促炎癥因子分泌Proinflamm-atory cytokine secretion抗炎癥因子分泌Anti-inflam-matory cytokine secretion分泌型免疫球蛋白A分泌sIgA secre-tion腸道生物屏障Intestinal bio-barrier腸道菌群多樣性Intestinal microflora diversity參考文獻Refere-nces蒙脫石-氧化鋅Zinc oxide-montmoril-lon-itehybrid (300～900 mg/kg)抑制抑制促進[21-23,30,41,43]包被氧化鋅Coated zinc oxide (100～400 mg/kg)增加增加增加增加抑制促進促進[27,42-43,48]