伏馬毒素B1適配體的篩選及其 快速定量檢測(cè)方法的建立

周 妍 刁晨曦 張圓圓 陸濤峰 趙麗麗 陳洪巖**

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱150030；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所，獸醫(yī)生物技術(shù) 國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱150069；3.牡丹江師范學(xué)院 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，牡丹江157011)

伏馬毒素(fumonisins)主要是由串珠鐮刀菌和多育鐮刀菌在一定的溫度和濕度下產(chǎn)生的一類由不同多氫醇和丙三羧酸組成的結(jié)構(gòu)類似的雙酯水溶性化合物[1]，主要包括伏馬毒素B1(fumonisin B1，F(xiàn)B1)、伏馬毒素B2和伏馬毒素B3等，其中FB1毒性最強(qiáng)，污染最普遍[2]。河南省玉米樣品中FB1的陽(yáng)性率為97.71%，湖北、廣東、四川、廣西和吉林5省全部為100%[3]。歐盟規(guī)定未加工玉米及嬰兒食品中FB1的最大殘留量為200 μg/kg[4]。我國(guó)規(guī)定FB1在糧食食品中的最大殘留量為12 μg/kg[5]，低于歐盟標(biāo)準(zhǔn)。動(dòng)物毒害作用研究證明FB1可致馬腦白質(zhì)軟化病[6]、猴動(dòng)脈粥樣硬化[7]、豬肺水腫[8]、大鼠肝癌[9-10]等。

近幾年，適配體(aptamer)研究以其勢(shì)不可擋的態(tài)勢(shì)一躍成為科學(xué)家們的討論焦點(diǎn)。它是利用指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化(systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)技術(shù)，即從單鏈寡核苷酸文庫(kù)中篩選出能與靶標(biāo)高親和力和特異性結(jié)合的寡核苷酸序列。適配體是通過(guò)鏈內(nèi)堿基間的氫鍵作用折疊形成穩(wěn)定的發(fā)卡、莖環(huán)、假結(jié)、口袋、凸環(huán)和G-四鏈體等二級(jí)或三級(jí)結(jié)構(gòu)，與靶標(biāo)空間結(jié)構(gòu)匹配結(jié)合的RNA或單鏈脫氧核糖核酸(ssDNA)[11-12]。理論上任何靶標(biāo)都可以篩選到對(duì)應(yīng)的適配體，包括小分子物質(zhì)[13]。適配體一般由幾十個(gè)核苷酸組成，相對(duì)分子質(zhì)量小、易穿透細(xì)胞膜、性質(zhì)穩(wěn)定、容易制備和修飾[14]。2002年O’Sullivan[15]首次將適配體用于生物識(shí)別。隨后各類衍生SELEX技術(shù)不斷發(fā)展和完善，適配體廣泛應(yīng)用于檢測(cè)食品和飼料中重金屬[16]、生物毒素[17]、抗生素[18]、非法添加物[19]等。Shi等[20]基于金納米離子和石墨烯的信號(hào)放大作用將探針DNA和FB1適配體雜交作為FB1特定的信號(hào)識(shí)別元件進(jìn)行檢測(cè)，其線性范圍為1～1×106ng/L，檢出限為1 ng/L。適配體檢測(cè)方法具有良好的應(yīng)用前景。

國(guó)內(nèi)外已建立了多種針對(duì)FB1的檢測(cè)方法，主要包括薄層色譜法[21]、酶聯(lián)免疫法[22-23]、芯片法[24]、氣相色譜法[25]、氣相色譜-質(zhì)譜連用法[26]、高效液相色譜法[27]等。以上方法的應(yīng)用受到檢測(cè)儀器昂貴、檢測(cè)流程復(fù)雜等原因的限制。而膠體金方法具有簡(jiǎn)便、快捷、靈敏度高等優(yōu)勢(shì)，近年來(lái)得到迅速的發(fā)展[28]。目前膠體金在FB1檢測(cè)上的應(yīng)用，主要集中在抗原檢測(cè)方法上[29-30]，以適配體為基礎(chǔ)的膠體金方法還未見(jiàn)報(bào)道。

基于以上內(nèi)容，本研究旨在將篩選得到的適配體與膠體金檢測(cè)方法相結(jié)合，開發(fā)FB1膠體金快速定量檢測(cè)方法，以期為谷物和飼料中FB1含量的檢測(cè)提供準(zhǔn)確、快速、簡(jiǎn)便的檢測(cè)手段，為適配體在農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全領(lǐng)域中的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料和儀器設(shè)備

試驗(yàn)材料包括：FB1、黃曲霉毒素B1(aflatoxin B1，AFB1)、T-2毒素(T-2)、玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEN)，購(gòu)自青島普瑞邦生物工程有限公司；Taq聚合酶、4種單堿基的混合溶液，購(gòu)自北京康潤(rùn)誠(chéng)業(yè)生物科技有限公司；鏈霉親和素標(biāo)記的磁珠，購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；UNIQ-10寡核苷酸試劑盒、變性電泳染料，購(gòu)自上海生工生物工程有限公司；伏馬毒素B1偶聯(lián)牛血清白蛋白(FB1-BSA)，購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；黃曲霉毒素B1偶聯(lián)牛血清白蛋白(AFB1-BSA)，購(gòu)自上海戶實(shí)醫(yī)藥科技有限公司；T-2毒素偶聯(lián)牛血清白蛋白(T-2-BSA)，購(gòu)自上海藥巢生物工程有限公司；氯金酸(HAuCl4·4H2O)，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。本試驗(yàn)使用的ssDNA文庫(kù)及生物素修飾的DNA探針均購(gòu)自博仕生物有限公司。

儀器設(shè)備包括：超純水系統(tǒng)(Elga Ultra Bioscience，英國(guó))、電熱恒溫水槽(DK-8D，上海柏欣儀器設(shè)備廠)、臺(tái)式微量高速離心機(jī)(Eppendorf A G，德國(guó))、PCR儀(STANLEY，美國(guó))、電泳儀(DYY-11B，北京六一生物科技有限公司)、紫外連續(xù)掃描分光光度計(jì)(Thermo，美國(guó))、數(shù)顯磁力攪拌電熱套(天津市萊玻特瑞儀器設(shè)備有限公司)、一體化凝膠成像分析系統(tǒng)(SMartGel Ⅱ，美國(guó))、聚焦式多功能熒光酶標(biāo)儀(Envision，美國(guó))，超微量分光光度計(jì)(Implen，德國(guó))、自動(dòng)微板閱讀器(PerkinElmer，德國(guó))、透射電鏡(日立H-7650，日本)、高效液相色譜儀(WATERS 6000，美國(guó))。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 ssDNA文庫(kù)的固定

取10 μL鏈霉親和素標(biāo)記的磁珠，用2×Binding Buffer洗3次，重懸于500 μL的2×Binding Buffer中，加入12 μL生物素化適配體互補(bǔ)鏈B(GTC/ISP 18/GATCGAGCCTCA)，室溫孵育1 h。1×Binding Buffer清洗磁珠3次，重懸于300 μL磷酸鹽緩沖液(PBS)中。將篩選所用的ssDNA文庫(kù)(ATACCAGCTTATTCAATT-N10-TGAGGCTCGATC-N40-AGATTGCACTTACTATCT)用PBS溶解后，于95 ℃變性8 min，迅速置于4 ℃冷卻,10 min再進(jìn)行短暫的室溫靜置。將處理后的ssDNA文庫(kù)加入到磁珠懸液中過(guò)夜孵育，即將文庫(kù)固定在磁珠上。

1.2.2 FB1適配體的篩選

已固定文庫(kù)的磁珠用PBS清洗多次，磁分離棄上清。取100 μL 1 mg/mL的FB1加到磁珠中，對(duì)照組為PBS，室溫孵育5 min，磁分離取上清備用，即獲得第1輪的候選適配體庫(kù)。第2輪開始進(jìn)行反篩選，清洗固定文庫(kù)的磁珠后，先分別加入ZEN、AFB1和T-2的PBS室溫孵育10 min，去除與其他毒素結(jié)合的文庫(kù)，再加入FB1靶標(biāo)溶液，室溫孵育5 min，磁分離取上清備用，即獲得第2輪的候選適配體庫(kù)。如此反復(fù)，共進(jìn)行8輪篩選。整個(gè)篩選方案概述見(jiàn)表1。

1.2.3 PCR擴(kuò)增

PCR擴(kuò)增引物信息見(jiàn)表2。

PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為：Mix，10 μL；ssDNA，0.5 μL；引物RA(10 μmol/L)，0.5 μL；引物FF(10 μmol/L)，0.5 μL；添加適量滅菌蒸餾水達(dá)到總反應(yīng)體積20 μL。體系預(yù)變性95 ℃ 3 min后再95 ℃ 30 s、51 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s重復(fù)30個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。

1.2.4 擴(kuò)增文庫(kù)的回收與純化

采用8%的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，收集帶有羧基熒光素(FAM)的熒光條帶。切膠后8 000 r/min離心3 min收集碎膠，煮沸15 min，8 000 r/min離心3 min收集上清，反復(fù)3次。收集管內(nèi)加4 mL鹽酸胍和8 mL無(wú)水乙醇，再次煮沸15 min后冰浴3 min，3 500 r/min離心10 min，4 ℃靜置30 min。連接蠕動(dòng)泵，利用UNIQ-10寡核苷酸試劑盒進(jìn)行ssDNA的純化，-20 ℃保存。高通量測(cè)序獲得的富集序列利用Mega 6.0軟件進(jìn)行同源序列比對(duì)。

表1 篩選方案概述

表2 PCR擴(kuò)增引物信息

1.2.5 親和力和特異性的測(cè)定

通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)方法測(cè)定候選適配體序列的親和力，具體方法為：5 μg/mL FB1-BSA抗原包被熒光酶標(biāo)板，4 ℃過(guò)夜；PBS清洗3次；5%的FB1-BSA 37 ℃封閉1 h；PBS洗3次；加入90 μL 0～2 μmol/L(0、0.015 625、0.062 500、0.250 000、1.000 000和2.000 000 μmol/L)的FAM修飾的適配體，37 ℃孵育1 h；PBS洗3次，最后在490 nm處測(cè)定熒光強(qiáng)度。利用SigmaPlot 5.0軟件進(jìn)行非線性曲線的擬合，計(jì)算每條代表序列的解離常數(shù)(Kd)值。最后利用RNA Structure 3.0進(jìn)行結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，分析其可能的結(jié)合位點(diǎn)。

特異性的測(cè)定方法為：分別用5 μg/mL的FB1-BSA、AFB1-BSA、ZEN-BSA和T-2-BSA抗原包被酶標(biāo)板，4 ℃過(guò)夜；PBS洗3次；5%的BSA 37 ℃封閉1 h；PBS洗3次；加入90 μL 1 μmol/L的FAM修飾的候選適配體，37 ℃孵育1 h。PBS洗3次，熒光強(qiáng)度測(cè)定同親和力分析。

1.2.6 膠體金溶液的制備

采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金溶液[31]，配制濃度為50 mmol/L的氯金酸溶液和194 mmol/L的檸檬酸三鈉溶液，4 ℃保存；帶冷凝器的三口圓底燒瓶加入98 mL純水，放入攪拌子，加入2 mL氯金酸溶液。加熱沸騰后加入2 mL檸檬酸三鈉溶液，持續(xù)沸騰20 min后，冷卻至室溫。透射電鏡觀察金粒子的制備情況。

1.2.7 適配體保護(hù)金的濃度及最佳膠體金顯色pH的確定

1 mL膠體金溶液中分別加入0、10、20、30、40和50 μL 0.1 mol/L的K2CO3用以調(diào)節(jié)pH；適配體稀釋濃度分別為0、0.125、0.250、0.500、1.000和2.000 μmol/L，兩者進(jìn)行正交試驗(yàn)，確定適配體保護(hù)金的最低濃度以及最適pH。

1.2.8 FB1的檢測(cè)程序

按照Lu等[32]的方法，稍加改進(jìn)：添加50 μL最適濃度適配體和50 μL不同濃度(0、0.062 5、0.125 0、0.250 0、0.500 0和1.000 0 ng/mL)的FB1室溫下細(xì)胞板中孵化1 h；加入50 μL膠體金溶液靜置5 min；而后加入5 μL 2 mol/L氯化鈉并徹底混合；平衡5 min后，通過(guò)自動(dòng)微板閱讀器測(cè)量從450～750 nm波長(zhǎng)的吸收光譜。

1.2.9 添加回收試驗(yàn)

市售玉米粉碎后檢測(cè)其FB1含量，而后向其中添加不同濃度(0、50、100和150 μg/kg)FB1標(biāo)準(zhǔn)品并混合均勻再次檢測(cè)，樣品制備和實(shí)驗(yàn)提取方法參照《飼料中伏馬毒素的測(cè)定》(NY/T 1970—2010)執(zhí)行，計(jì)算添加回收率。

1.2.10 樣品檢測(cè)

隨機(jī)選取5份FB1含量在10～100 μg/kg之間的市售玉米，分別用本試驗(yàn)建立的方法和NY/T 1970—2010中規(guī)定的液相色譜法進(jìn)行檢測(cè)，比較檢測(cè)結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 篩選條件的優(yōu)化

核酸文庫(kù)在不適宜的PCR擴(kuò)增條件下會(huì)產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，本研究即對(duì)文庫(kù)擴(kuò)增的退火溫度進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果見(jiàn)圖1。退火溫度高，非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的量相對(duì)就會(huì)減少，但是特異性的擴(kuò)增產(chǎn)物的量也會(huì)減少，綜合考慮擴(kuò)增效率和非特異性擴(kuò)增的影響，選擇最佳擴(kuò)增退火溫度為61 ℃。

a～j分別為55、56、57、58、59、60、61、62、63、64 ℃的擴(kuò)增產(chǎn)物；M：DM2000。

a to j were amplification products of 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63 and 64 ℃, respectively; M: DM2000.

圖1擴(kuò)增引物退火溫度優(yōu)化

Fig.1 Annealing temperature optimization of amplification primer

2.2 篩選過(guò)程的監(jiān)控

本研究進(jìn)行了8輪篩選，對(duì)2、5和8輪文庫(kù)的富集與回收純化情況進(jìn)行PCR驗(yàn)證，第8輪結(jié)果見(jiàn)圖2和圖3。PCR擴(kuò)增得到了118 bp的特異性條帶且變性聚丙烯酰胺凝膠電泳得到了帶有FAM的熒光條帶，同預(yù)期結(jié)果一致。

M：標(biāo)記物；A、B：陰性對(duì)照；C～F：Pool8。

M: marker; A and B: negative control; C to F: Pool8.

圖28輪PCR產(chǎn)物

Fig.2 PCR product of 8 rounds

圖3 變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離制備8輪ssDNAFig.3 ssDNA of 8 rounds prepared by denaturing PAGE

2.3 同源序列的富集與比對(duì)

利用高通量測(cè)序評(píng)測(cè)每輪文庫(kù)的富集情況，共測(cè)出10 000條序列。利用Mega 6.0軟件進(jìn)行同源性序列比對(duì)得到10條相似性較高的序列見(jiàn)圖4，且F102、F98和F92的富集倍數(shù)較高，見(jiàn)表3。

2.4 親和力及特異性的測(cè)定

將獲得的10條候選適配體進(jìn)行親和力測(cè)定。表4是具有親和力的適配體的序列及相應(yīng)的親和力測(cè)試結(jié)果，圖5是適配體F102和F98的非線性擬合親和力分析結(jié)果。適配體F102對(duì)FB1的親和力Kd值為(42.1±4.0) nmol/L。適配體F102、F98和F92的特異性結(jié)果見(jiàn)圖6所示。樣品組的相對(duì)熒光強(qiáng)度比，代表的是真菌毒素分子競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合磁珠表面適配體致使構(gòu)象改變、互補(bǔ)熒光短鏈脫落的能力，因此熒光強(qiáng)度比越高，特異性越強(qiáng)。適配體F92、F102、F98的熒光恢復(fù)率分別為43.3%、80.0%和36.6%，而三者對(duì)非靶標(biāo)真菌毒素的熒光恢復(fù)率均在30%左右，表明3條適配體具有較好的特異性，其中F102特異性最強(qiáng)。本試驗(yàn)從另一方面論證了FB1適配體篩選過(guò)程中加入AFB1、T-2與ZEN等非靶標(biāo)分子的磁競(jìng)爭(zhēng)-SELEX方法是成功的。

表3 FB1候選適配體序列富集情況

圖4 富集文庫(kù)序列同源性比對(duì)Fig.4 Homology comparison of enrichment library sequence表4 適配體序列及Kd值Table 4 Aptamer sequence and Kd value

候選適配體名稱 Name of the candidate aptamer序列信息 Sequence information (5'—3')解離常數(shù)Kd/(nmol/L)F92GGCGAGATCCTGAGGCTCGATCTGACAATAGAGGTAATAGTGGTATTGGTTTTCTAGGGTGG459.5±15.2F98AGAGGGTTGTTGAGGCTCGATCCTGAGGATCGTGATATTGCTAAGTTTACTGCTCGGGTGGG168.2±8.9F102CCCGCACAATCGTAATCAGTTAGACAATCGTAATCAGTTAAGATCGGAAGAGCACACGTCTG42.1±4.0

兩端引物序列省略。Kd值測(cè)定依據(jù)ELISA試驗(yàn)，取3次平行試驗(yàn)結(jié)果的平均值。

The primer sequences at both ends were omitted. The Kdvalue was determined according to the ELISA test, taking the average of three parallel experimental results.

圖5 FB1候選適配體的親和力分析Fig.5 Affinity analysis of FB1 candidate aptamer

圖6 適配體特異性分析Fig.6 Specificity analysis of aptamer

2.5 膠體金溶液制備效果

制備的膠體金溶液通過(guò)透射電鏡觀察可以看出，金粒子分布較均勻，顆粒大小均一，直徑約為13 nm，顏色為透明的酒紅色，液體無(wú)雜質(zhì)，見(jiàn)圖7，可用于檢測(cè)方法的建立。

通過(guò)正交試驗(yàn)確定適配體保護(hù)金的最低濃度為0.25 μmol/L，以及最適K2CO3添加量為20 μL，膠體金溶液pH在7.0左右，此時(shí)膠體金的顏色適當(dāng)，適配體用量最小。

2.6 適配體對(duì)FB1的檢測(cè)

圖8、圖9和圖10是不同濃度適配體對(duì)不同濃度FB1的膠體金吸光度值。由圖8、9和10可以看出由于NaCl導(dǎo)致的膠體金的顏色變化，吸光度值發(fā)生變化，證明該適配體可用來(lái)建立檢測(cè)FB1的方法，且整個(gè)檢測(cè)過(guò)程不超過(guò)2 h，方法簡(jiǎn)便快速。

圖7 膠體金透射電鏡觀察結(jié)果Fig.7 Transmission electron microscopy observation of colloidal gold

圖8 0.500 μmol/L適配體、FB1和 膠體金混合溶液的吸收光譜Fig.8 Absorption spectra of 0.500 μmol/L aptamer, FB1 and colloidal gold mixed solutions

圖9 0.250 μmol/L適配體、FB1和 膠體金混合溶液的吸收光譜Fig.9 Absorption spectra of 0.250 μmol/L aptamer, FB1 and colloidal gold mixed solutions

圖10 0.125 μmol/L適配體、FB1和 膠體金混合溶液的吸收光譜Fig.10 Absorption spectra of 0.125 μmol/L aptamer, FB1 and colloidal gold mixed solutions

以ZEN為例檢測(cè)適配體及方法的特異性，見(jiàn)圖11。從圖中可以看出，0.500 μmol/L適配體不與ZEN結(jié)合，能夠完全保護(hù)膠體金，在與FB1相同濃度梯度的條件下，ZEN的吸光度與0 mg/mL的吸光度基本吻合，證明適配體的特異性良好。AFB1和T-2的特異性結(jié)果與ZEN的相似。

圖11 0.500 μmol/L適配體、ZEN和 膠體金混合溶液的吸收光譜Fig.11 Absorption spectra of 0.500 μmol/L aptamer, ZEN and colloidal gold mixed solutions

圖12為不同濃度FB1、適配體和膠體金混合溶液的吸光度校準(zhǔn)曲線。在520 nm波長(zhǎng)下，隨著FB1濃度的增加，0.250和0.500 μmol/L的適配體的吸光度逐漸減小。由圖可以看出，0.250和0.500 μmol/L的適配體吸光度都體現(xiàn)了良好的線性關(guān)系，線性范圍是0.062 5～1.000 0 ng/mL檢出限為0.125 ng/mL，相關(guān)系數(shù)(R2)分別為0.958 5和0.987 5。由此可以得出，0.250 μmol/L適配體滿足對(duì)以上濃度的FB1進(jìn)行檢測(cè)的要求。

圖12 FB1適配體結(jié)合膠體金的吸光度校準(zhǔn)曲線Fig.12 Absorbance calibration curve of FB1 aptamer binding to colloidal gold

2.7 添加回收試驗(yàn)結(jié)果

取玉米樣本檢測(cè)其中FB1含量，然后分別添加50、100和150 μg/kg的FB1標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算添加回收率，結(jié)果見(jiàn)表5。樣本的添加回收率在97%～121%。

表5 玉米樣本添加回收試驗(yàn)結(jié)果

2.8 樣品檢測(cè)試驗(yàn)結(jié)果

利用本方法檢測(cè)5份樣品，結(jié)果見(jiàn)表6。結(jié)果顯示，本方法的檢測(cè)結(jié)果與液相色譜法檢測(cè)結(jié)果相符，相對(duì)誤差在低于15.7%。

表6 FB1膠體金快速定量檢測(cè)方法和液相色譜法檢測(cè)結(jié)果

3 討 論

FB1分子是一類由不同的多氫醇和丙三羧酸組成的結(jié)構(gòu)類似的雙酯化合物，沒(méi)有可以固定的活性基團(tuán)，從而只能借助其他活性基團(tuán)如氨基基團(tuán)固定在篩選介質(zhì)上，但是這樣大大增加了篩選的難度且對(duì)適配體的特異性有所影響，本研究據(jù)此選擇固定文庫(kù)的篩選策略以期獲得特異性良好的適配體。篩選過(guò)程的另一大難點(diǎn)是消除非特異性干擾。非特異性DNA的干擾一方面是磁珠基底的非特異性吸附的DNA；另一方面來(lái)自于僅僅識(shí)別FB1部分分子結(jié)構(gòu)的DNA，如分子結(jié)構(gòu)上的個(gè)別基團(tuán)或者某個(gè)部位。為此引入與FB1結(jié)構(gòu)相似性化合物AFB1、T-2和ZEN進(jìn)行反篩選，而AFB1與FB1具有相似的作用位點(diǎn)，因此利用它們提高篩選效率。

SELEX過(guò)程數(shù)學(xué)分析結(jié)果表明，從理論上講，親和性最強(qiáng)的適配體其富集效果應(yīng)該最好[35-40]，但是在這是在不考慮其他干擾因素的理想狀態(tài)下。然而實(shí)際的篩選結(jié)果卻顯示富集水平最好的序列，其親和力不一定是最理想的[41-45]。實(shí)際上，微小的試驗(yàn)條件如pH和溫度變化都會(huì)影響最終的篩選結(jié)果。禹新良[46]采用數(shù)學(xué)方法對(duì)SELEX篩選適配體富集水平進(jìn)行理論分析，論證了滿足一定條件下，與靶標(biāo)親和力最強(qiáng)的適配體并不具有最高的富集水平。本文篩選得到的適配體F102富集水平并不是最高，但是它的親和力卻最好，印證了以上結(jié)論。

適配體可以選擇性地與其靶標(biāo)分子結(jié)合，高親和力可與抗體相媲美，且具有比抗體更好的抗生物降解能力[13]，這些特性使其成為一種特定目標(biāo)物檢測(cè)中非常理想的識(shí)別元件。本文獲得FB1適配體的Kd為(42.1±4.0) nmol/L，并且選擇性很好，與FB1結(jié)構(gòu)相似性化合物ZEN、AFB1和T-2的結(jié)合遠(yuǎn)低于FB1。與已有報(bào)道的FB1適配體F39[33]和F10[34][Kd分別為(100±30) nmol/L和(62±5) nmol/L]相比，本文獲得的FB1適配體的親和力更高，建立的膠體金檢測(cè)方法的適配體用量較低(0.250 μmol/L)，與玉米赤霉烯酮等霉菌毒素的交叉反應(yīng)較低，檢測(cè)時(shí)間較短，為FB1的實(shí)際應(yīng)用奠定了良好的基礎(chǔ)。李永剛等[47]建立了一種超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定玉米油中的伏馬毒素，其檢測(cè)結(jié)果為FB1在5～200 ng/mL時(shí)線性良好，檢出限分別為0.27 ng/mL。Wang等[48]用熒光微球標(biāo)記FB1單克隆抗體，建立了一種用于檢測(cè)玉米中FB1的免疫層析法，檢測(cè)限達(dá)120 ng/L，與伏馬毒素B2和伏馬毒素B3的交叉反應(yīng)率分別為1.5%和67.3%。與上述結(jié)果相比，本研究建立的檢測(cè)方法特異性更強(qiáng)，效果更好。

本文通過(guò)選擇適當(dāng)篩選方法、增加篩選壓力得到親和力和特異性強(qiáng)的FB1適配體F102，分析其二級(jí)結(jié)構(gòu)，推測(cè)其可能的結(jié)合機(jī)制，建立膠體金檢測(cè)方法，對(duì)得到的適配體進(jìn)行效果驗(yàn)證。以此為基礎(chǔ)推廣開來(lái)的適配體應(yīng)用于農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全領(lǐng)域，不僅能夠?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全領(lǐng)域真菌毒素的快速檢測(cè)提供理論參考，而且能夠?yàn)樘娲鷤鹘y(tǒng)抗體的傳感器開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

本研究利用篩選得到的適配體建立了可用于谷物和飼料中FB1含量的快速定量檢測(cè)方法。