基于間酪氨酸和鄰酪氨酸鑒定輻照海產(chǎn)品

邵宏宏，相興偉*，鄭 斌，周秀錦，周宇芳，周向陽(yáng)，傅謐妮

（1.舟山出入境檢驗(yàn)檢疫局，浙江 舟山 316000；2.浙江省海洋開(kāi)發(fā)研究院，浙江 舟山 316000）

海產(chǎn)品的新鮮度是其品質(zhì)的重要指標(biāo)，輻照作為一種新興的加工技術(shù)，因其高效的殺菌作用，在全球食品加工領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用[1]，近年來(lái)，在海產(chǎn)品加工、運(yùn)輸及儲(chǔ)存過(guò)程中利用輻照技術(shù)進(jìn)行殺菌保鮮，以達(dá)到最大限度延長(zhǎng)貨架期的目的[2-3]。目前，由于輻照對(duì)食品的品質(zhì)和安全性的影響還尚未定論[4-5]，歐盟、美國(guó)等發(fā)達(dá)國(guó)家均要求進(jìn)口輻照食品應(yīng)有國(guó)際食品輻照標(biāo)識(shí)（1999/2/EC）。我國(guó)出口歐盟及日本的海產(chǎn)品多次發(fā)生由于無(wú)輻照標(biāo)識(shí)而被退貨的事件，給企業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。

目前，關(guān)于輻照食品檢測(cè)方法研究的報(bào)道很多，但是受方法本身采用的原理所限，每種方法均適用于特定類(lèi)型的樣品[6-14]，由于海產(chǎn)品脂肪含量少，且常采用多次漂洗、蒸煮、烘烤等加工方式，采用現(xiàn)行的方法在檢測(cè)輻照海產(chǎn)品存在一定難度，如采用熱釋光法需在樣品中提取一定量的硅酸鹽，而魚(yú)肉、魷魚(yú)絲等產(chǎn)品由于受加工工藝影響，無(wú)法提取到足夠量的硅酸鹽用于檢測(cè)[15-16]。食品中苯丙氨酸經(jīng)輻照后，在氧化壓力條件下，與輻照產(chǎn)生的羥自由基反應(yīng)，產(chǎn)生酪氨酸3 種異構(gòu)體——對(duì)酪氨酸、鄰酪氨酸和間酪氨酸[17]。由于機(jī)體本身并不存在間位酪氨酸和鄰位酪氨酸，因此，可通過(guò)對(duì)其含量進(jìn)行測(cè)定作為含蛋白質(zhì)食品是否經(jīng)過(guò)輻照的判斷依據(jù)。但食品經(jīng)輻照后只產(chǎn)生微量的酪氨酸同分異構(gòu)體且較難分離，相對(duì)而言，在輻照生成的酪氨酸異構(gòu)體中，鄰酪氨酸的量最大[18]。因此在目前關(guān)于酪氨酸同分異構(gòu)體檢測(cè)的報(bào)道中，主要選用鄰酪氨酸作為檢測(cè)含蛋白質(zhì)輻照食品的探針化合物，利用高效液相色譜法應(yīng)用柱前衍生化或直接經(jīng)反相高效液相色譜分離檢測(cè)，但存在衍生化產(chǎn)物不穩(wěn)定、試劑昂貴，重現(xiàn)性差等問(wèn)題[19-21]。Chen Si等[22]利用輻照后氨基酸特異性產(chǎn)物對(duì)輻照肉類(lèi)的檢測(cè)進(jìn)行了相關(guān)研究。劉茜等[23]建立了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)檢測(cè)輻照蛋白質(zhì)類(lèi)功能食品中鄰酪氨酸和間酪氨酸的方法。但目前對(duì)海產(chǎn)品輻照研究的報(bào)道較少，此外關(guān)于鄰酪氨酸和間酪氨酸作為海產(chǎn)品輻照產(chǎn)物的特異性和穩(wěn)定性研究鮮見(jiàn)報(bào)道。

本研究采用高效、高靈敏度的超高效液相色譜-三重四極桿/線性離子阱質(zhì)譜（ultra performance liquid chromatography-quadrupole linear ion trap tadem mass spectrometry，QTRAP-UPLC-MS/MS）技術(shù)，以及精確的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)-信息關(guān)聯(lián)采集-增強(qiáng)子離子（multiple reaction monitoring information-dependent acquisitionenhanced product ion，MRM-IDA-EPI）監(jiān)控模式，對(duì)不同海產(chǎn)品中的酪氨酸同分異構(gòu)體進(jìn)行有效分離和二次定性，準(zhǔn)確測(cè)定海產(chǎn)品中輻照標(biāo)識(shí)物含量。在此基礎(chǔ)上，對(duì)不同加工方式處理后的各類(lèi)海產(chǎn)品及其加工制品中鄰酪氨酸和間酪氨酸進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)鄰酪氨酸和間酪氨酸作為輻照標(biāo)識(shí)物的特異性進(jìn)行研究；不同加工方式和前處理方式對(duì)輻照衍生物穩(wěn)定性的影響；測(cè)定不同劑量輻照后多種海產(chǎn)品中輻照標(biāo)識(shí)物的含量，確定海產(chǎn)品的種類(lèi)和氨基酸含量對(duì)輻照檢測(cè)的影響，為輻照海產(chǎn)品的鑒定檢測(cè)提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

丙酮、甲醇（均為色譜純） 德國(guó)默克公司；去離子水（電阻率18.2 MΩ?cm），經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾后使用；甲酸 德國(guó)Riedel deHaen公司；氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品：DL-酪氨酸 （CAS：556-03-6，純度≥99.0%）、間酪氨酸（CAS：775-06-4，純度≥99.0%）、鄰酪氨酸（CAS：2370-61-8，純度≥98.0%）、丙苯氨酸（CAS：150-30-1，純度≥99.0%） 美國(guó)Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UPLC-20ADXR系列液相色譜（配有溶劑脫氣裝置、自動(dòng)進(jìn)樣器） 日本Shimadzu公司；QTRAP 5500三重四極桿復(fù)合離子阱質(zhì)譜儀 美國(guó)AB Sciex公司；天平（感量0.000 1 g）；超聲波清洗器 德國(guó)Elma公司；MSI漩渦振蕩器 德國(guó)IKA公司；3-18K低溫高速離心機(jī)美國(guó)Sigma公司；恒溫干燥箱 美國(guó)Thermo Fish公司；自動(dòng)凱氏定氮儀 丹麥Foss公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品的制備

為保證樣品的新鮮度且未經(jīng)加工處理，無(wú)任何添加劑處理，選取浙江舟山及東海區(qū)域典型且出口量較大的海產(chǎn)品。海水魚(yú)類(lèi)選取鮐魚(yú)（Pneumatophorus japonicus），海水甲殼類(lèi)選取大管鞭蝦（Solenocera melantho）又稱(chēng)紅蝦，是目前浙江舟山市出口量最大的蝦類(lèi)產(chǎn)品。水產(chǎn)制品選取頭足類(lèi)的魷魚(yú)，并加工成干制魷魚(yú)絲[24]。

各類(lèi)海產(chǎn)品均來(lái)自于浙江舟山市各大水產(chǎn)加工企業(yè)，實(shí)驗(yàn)中采用的未輻照樣品為來(lái)自于水產(chǎn)企業(yè)未經(jīng)任何加工處理的水產(chǎn)樣品，干制品為加工后未經(jīng)輻照處理的樣品；輻照樣品為經(jīng)γ射線（60Co為放射源）輻照處理的樣品，用劑量計(jì)跟蹤測(cè)定樣品的吸收劑量；新鮮海捕水產(chǎn)品及制品取可食部分，凍制品等解凍后勻漿于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 樣品前處理

準(zhǔn)確稱(chēng)取0.8 g經(jīng)勻漿后的樣品于10 mL塑料離心管中，加入3 mL 體積分?jǐn)?shù)為0.1%甲酸溶液，均質(zhì)1 min，室溫超聲振蕩提取30 min，4 ℃、12 000 r/min離心20 min。將上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管中，加入8 mL丙酮，于-18 ℃靜置2 h，沉淀蛋白質(zhì)，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液5 mL置于玻璃管中。35 ℃條件下N2吹干，用1 mL 0.1%甲酸溶液溶解，用0.22 μm水相尼龍濾膜過(guò)濾，上機(jī)待測(cè)。

干制海產(chǎn)品由于含水量低，其游離氨基酸含量少，因此需通過(guò)酸水解的方式對(duì)輻照產(chǎn)物進(jìn)行提取。將待測(cè)的干制水產(chǎn)品充分混勻，用剪刀剪碎，尤其是魷魚(yú)絲，避免纏繞住粉粹機(jī)刀頭使之過(guò)載；攪碎后裝入容器內(nèi)，密封、冷藏（-18 ℃）備用；準(zhǔn)確稱(chēng)取0.5 g，經(jīng)前處理后的樣品于20 mL酸解玻璃管中，加入10 mL 6 mol/L鹽酸，充氮?dú)夂笊w緊旋蓋，于110 ℃酸解過(guò)夜。取酸解液用濾紙過(guò)濾后，置于玻璃離心管中，4 ℃、12 000 r/min離心10 min。取上清液5 mL，35 ℃條件下N2吹干，用1 mL 0.1%甲酸溶液溶解后過(guò)濾膜待測(cè)。

1.3.3 色譜及質(zhì)譜條件

1.3.3.1 色譜分離條件

采用Waters Acquity UPLC BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），流速0.4 mL/min；流動(dòng)相：A為甲醇，B為0.1%甲酸溶液；進(jìn)樣量：2 μL；柱溫：35 ℃；流動(dòng)相的梯度洗脫程序?yàn)椋?～5 min，5%～30% B，5.1～8 min 30%～5% B，對(duì)色譜柱進(jìn)行沖洗，結(jié)束整個(gè)檢測(cè)流程。

1.3.3.2 質(zhì)譜條件

離子源Turbo V，電離模式電噴霧電離，正離子模式；采集方式MRM模式，離子化溫度550 ℃；噴霧電壓5 500 V，霧化氣壓力55 psi，輔助氣壓力60 psi，氣簾氣壓力30 psi，碰撞氣壓力為 High；入口電壓10 V，碰撞室出口電壓13 V。各化合物的具體采集參數(shù)見(jiàn)表1。

采用MRM-IDA-EPI模式監(jiān)測(cè)。MRM觸發(fā)增強(qiáng)子離子掃描IDA-EPI條件：IDA觸發(fā)信號(hào)強(qiáng)度閾值5 000；EPI條件：掃描速率10 000 Da/s；掃描范圍：50～200 Da；離子源同載氣條件同MRM；DP電壓80 V；碰撞能量35 V，碰撞能量譜寬為15。

表1 優(yōu)化的質(zhì)譜條件參數(shù)Table 1 Optimized MS/MS parameters for determination of the isomers

1.3.4 其他測(cè)定方法

水分含量測(cè)定：采用GB 5009.3—2016《食品中水分的測(cè)定》中的直接干燥法[25]；脂肪含量測(cè)定：采用GB/T 5009.6—2016《食品中脂肪的測(cè)定》[26]；蛋白質(zhì)含量測(cè)定：采用GB 5009.5—2016《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》[27]；氨基酸含量測(cè)定：采用 GB/T 5009.124—2016《食品中氨基酸的測(cè)定》[28]。

2 結(jié)果與分析

2.1 主要成分及氨基酸含量

同一種海產(chǎn)品的苯丙氨酸和酪氨酸含量會(huì)隨所處環(huán)境、捕獲季節(jié)、所處的生長(zhǎng)期等多種因素的影響[29]。輻照樣品中的鄰酪氨酸和間酪氨酸由苯丙氨酸經(jīng)氧化后產(chǎn)生，為探明海產(chǎn)品中不同苯丙氨酸和酪氨酸含量對(duì)輻照產(chǎn)物的影響，對(duì)鮐魚(yú)、大管鞭蝦及干制魷魚(yú)絲中苯丙氨酸和酪氨酸及相關(guān)成分含量進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2。大管鞭蝦中水分含量最高，不同的海產(chǎn)品中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)在16.7%～26.2%之間。鮐魚(yú)中具有較高的脂肪含量，海產(chǎn)品主要成分因海產(chǎn)品種類(lèi)不同而存在差異。

表2 海產(chǎn)品成分分析（n=3）Table 2 Chemical composition of seafood (n= 3)

2.2 輻照劑量對(duì)標(biāo)識(shí)物標(biāo)準(zhǔn)品的影響

取質(zhì)量濃度為1 mg/L的苯丙氨酸、對(duì)酪氨酸、鄰酪氨酸和間酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)水溶液，分別進(jìn)行0.5～50 kGy不同劑量的輻照，與未經(jīng)輻照的苯丙氨酸標(biāo)準(zhǔn)水溶液均用QTRAP-UPLC-MS/MS進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示（圖1、2）在未經(jīng)輻照的苯丙氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液中，只檢測(cè)到苯丙氨酸，而經(jīng)不同劑量輻照后溶液中檢測(cè)到不同濃度的對(duì)酪氨酸、鄰酪氨酸及間酪氨酸（表3），產(chǎn)生的3 種酪氨酸同分異構(gòu)體含量隨接受到的輻照劑量增大而增加，呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系（表4）。

圖1 苯丙氨酸MRM圖Fig. 1 MRM chromatogram of phenylalanine

圖2 輻照后苯丙氨酸MRM圖Fig. 2 MRM chromatogram of phenylalanine after irradiation

表3 苯丙氨酸輻照后酪氨酸含量（n= 3）Table 3 Contents of tyrosine isomers after irradiation of phenylalanine (n= 3)

表4 苯丙氨酸輻照產(chǎn)物線性方程Table 4 Linear equations for tyrosine isomers

苯丙氨酸溶液用高純度的苯丙氨酸標(biāo)準(zhǔn)品與經(jīng)過(guò)高溫消毒的去離子水配制，不含其他酶及其他物質(zhì)，接受輻照后產(chǎn)生酪氨酸同分異構(gòu)體，由此可知苯丙氨酸接受輻照產(chǎn)生酪氨酸這一過(guò)程不需要酶及其余物質(zhì)的參與。

在低劑量輻照下，在3 種輻照產(chǎn)物中對(duì)酪氨酸的含量最高，鄰酪氨酸次之；隨著輻照劑量的加大，間酪氨酸含量迅速上升，當(dāng)輻照強(qiáng)度為5 kGy時(shí)，3 種同分異構(gòu)體含量最為接近；輻照劑量上升至10 kGy時(shí)，由苯丙氨酸輻照產(chǎn)生對(duì)酪氨酸、間酪氨酸和鄰酪氨酸的質(zhì)量百分比分別為0.36%、0.47%和4.9%；為當(dāng)輻照劑量高達(dá)50 kGy時(shí)，鄰酪氨酸和間酪氨酸質(zhì)量濃度分別達(dá)到19.971 μg/L和19.540 μg/L，超過(guò)對(duì)酪氨酸的13.892 μg/L。

同時(shí)，分別經(jīng)不同劑量輻照的對(duì)酪氨酸、鄰酪氨酸和間酪氨酸3 種標(biāo)準(zhǔn)溶液中無(wú)其他物質(zhì)的出現(xiàn)，其含量無(wú)變化。對(duì)酪氨酸的標(biāo)準(zhǔn)溶液即使經(jīng)高劑量的輻照也無(wú)法產(chǎn)生其他兩種同分異構(gòu)體，鄰酪氨酸和間酪氨酸亦然，因此，輻照不能使這3 種酪氨酸相互轉(zhuǎn)化，且不影響這3 種同分異構(gòu)體的穩(wěn)定性。

2.3 加工方式對(duì)輻照標(biāo)識(shí)物的影響

分別采用海產(chǎn)品加工中常用的方法對(duì)不同海產(chǎn)品進(jìn)行處理，檢測(cè)處理后的樣品中有無(wú)鄰酪氨酸和間酪氨酸產(chǎn)生，研究其他加工方式是否會(huì)導(dǎo)致這兩種同分異構(gòu)體的產(chǎn)生。實(shí)驗(yàn)中采用了3 種加工方式：100 ℃蒸煮30～60 min；150 ℃烘烤2 h及50 ℃干燥24 h。經(jīng)加工后的樣品前處理后上機(jī)檢測(cè)，結(jié)果顯示經(jīng)50 ℃干燥24 h、100 ℃蒸煮30 min和150 ℃烘烤2 h后的樣品中無(wú)鄰酪氨酸和間酪氨酸產(chǎn)生，但經(jīng)100 ℃蒸煮60 min后的部分樣品中有微量鄰酪氨酸產(chǎn)生，但未檢測(cè)到間酪氨酸。因此采用液相色譜只對(duì)食品中的鄰酪氨酸進(jìn)行測(cè)定從而判斷食品是否進(jìn)行輻照的方法易出現(xiàn)假陽(yáng)性的結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)采用同時(shí)檢測(cè)鄰酪氨酸和間酪氨酸的含量對(duì)輻照海產(chǎn)品進(jìn)行鑒定，因此對(duì)樣品進(jìn)行100 ℃蒸煮60 min的處理不會(huì)影響輻照與否的鑒定，將鄰酪氨酸和間酪氨酸作為輻照標(biāo)識(shí)物可作為輻照海產(chǎn)品鑒定的依據(jù)。

2.4 海產(chǎn)品中標(biāo)識(shí)物含量影響因素

2.4.1 海產(chǎn)品種類(lèi)與標(biāo)識(shí)物含量

苯丙氨酸經(jīng)輻照后會(huì)產(chǎn)生對(duì)酪氨酸、鄰酪氨酸和間酪氨酸，但海產(chǎn)品中本身存在高含量的對(duì)酪氨酸（表2），因此經(jīng)輻照后產(chǎn)生的對(duì)酪氨酸與自身所含對(duì)酪氨酸相比可忽略不計(jì)。因此只對(duì)經(jīng)0.5～50 kGy不同劑量輻照后的海產(chǎn)品中鄰酪氨酸和間酪氨酸含量進(jìn)行測(cè)定。由圖3可知，輻照海產(chǎn)品中鄰酪氨酸和間酪氨酸的濃度隨著接受到的輻照強(qiáng)度的增大而增加，呈現(xiàn)正相關(guān)性，但增長(zhǎng)的速率因樣品不同而存在差異；相對(duì)而言，大管鞭蝦中鄰酪氨酸和間酪氨酸產(chǎn)生速度最快且含量最高，朱珍等[20]采用液相色譜法對(duì)輻照水產(chǎn)品中鄰酪氨酸進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果顯示大管鞭蝦中鄰酪氨酸含量最高，與表3結(jié)果相似。輻照后產(chǎn)生的鄰酪氨酸含量高于間酪氨酸，與報(bào)道一致[19]。

圖3 輻照大管鞭蝦（A）、鮐魚(yú)（B）和干制魷魚(yú)絲（C）中間酪氨酸和鄰酪氨酸含量Fig. 3 Contents of o-tyrosine and m-tyrosine in irradiated S. melantho (A),mackerel (B), and dried squid (C)

2.4.2 輻照劑量與標(biāo)識(shí)物含量

輻照劑量是影響輻照標(biāo)識(shí)物含量主要因素之一，低至0.5 kGy的輻照強(qiáng)度即可使海產(chǎn)品中產(chǎn)生一定含量的鄰酪氨酸和間酪氨酸，繼而判定樣品是否經(jīng)過(guò)輻照；輻照強(qiáng)度與輻照標(biāo)識(shí)物含量呈正相關(guān)性，與劉茜等[23]對(duì)輻照蛋白質(zhì)類(lèi)功能食品的研究一致。但與圖2中針對(duì)苯丙氨酸水溶液的輻照結(jié)果不同，樣品接受的輻照劑量與輻照標(biāo)識(shí)物無(wú)顯著的線性關(guān)系，樣品基質(zhì)的復(fù)雜性對(duì)輻照標(biāo)識(shí)性產(chǎn)物鄰酪氨酸和間酪氨酸的含量產(chǎn)生了影響。

在相同劑量的輻照下，不同海產(chǎn)品產(chǎn)生的鄰酪氨酸和間酪氨酸濃度不等（大管鞭蝦＞鮐魚(yú)＞干制魷魚(yú)絲）。對(duì)這3 類(lèi)海產(chǎn)品的成分分析顯示（表2），鮐魚(yú)和干制魷魚(yú)絲中蛋白質(zhì)和苯丙氨酸含量均高于紅蝦，但同劑量輻照下鄰酪氨酸和間酪氨酸的含量卻低于紅蝦，因此，海產(chǎn)品中苯丙氨酸質(zhì)量濃度與其輻照產(chǎn)物鄰酪氨酸和間酪氨酸質(zhì)量濃度不呈正相關(guān)性，海產(chǎn)品均富含苯丙氨酸，其含量不是決定輻照標(biāo)識(shí)物質(zhì)量濃度的決定因素。

2.4.3 水分與標(biāo)識(shí)物含量

輻照標(biāo)識(shí)物的產(chǎn)生與海產(chǎn)品中水分含量密切相關(guān)。紅蝦中的水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)81.6%，是本實(shí)驗(yàn)樣品中最高（大管鞭蝦＞鮐魚(yú)＞干制魷魚(yú)絲），不論在0.5 kGy低強(qiáng)度還是在超過(guò)7 kGy高強(qiáng)度（0.5～50 kGy）輻照下紅蝦中產(chǎn)鄰酪氨酸和間酪氨酸的濃度均為最高（大管鞭蝦＞鮐魚(yú)＞干制魷魚(yú)絲）。酪氨酸同分異構(gòu)體通過(guò)在氧化壓力下羥自由基與苯丙氨酸分子反應(yīng)形成[30-31]，苯丙氨酸的氧化和酪氨酸同分異構(gòu)體的產(chǎn)生取決于羥自由基產(chǎn)生的效率，羥自由基由水分子產(chǎn)生，因此樣品中水分含量是影響輻照標(biāo)識(shí)物產(chǎn)生的重要因素。Zhang Jingjing等[17]通過(guò)表面增強(qiáng)拉曼散射技術(shù)測(cè)定苯丙氨酸溶液輻照后產(chǎn)生對(duì)酪氨酸、鄰酪氨酸和間酪氨酸3 種同分異構(gòu)體，且產(chǎn)生的含量與溶液中的羥自由基濃度相關(guān)。因此通過(guò)對(duì)輻照標(biāo)識(shí)物鄰酪氨酸和間酪氨酸含量對(duì)海產(chǎn)品所接受輻照劑量的準(zhǔn)確測(cè)定需根據(jù)其不同樣品類(lèi)別、樣品狀態(tài)判定，但可對(duì)樣品是否經(jīng)過(guò)輻照進(jìn)行準(zhǔn)確快速的鑒定，避免其他如熱釋光法、光釋光等方法的假陰性及二次輻照的狀況。

2.5 輻照標(biāo)識(shí)物穩(wěn)定性

2.5.1 貯藏條件的影響

采用0.5、1.0、5.0、7.0、10.0、20.0 kGy對(duì)樣品進(jìn)行輻照分別用PE袋單獨(dú)包裝并密封，保存條件分別為冷凍-20 ℃、冷藏4 ℃、常溫20 ℃貯藏，貯藏不同時(shí)間后進(jìn)行測(cè)定。圖4顯示：輻照大管鞭蝦未經(jīng)貯藏及在-20、4 ℃和20 ℃分別貯存90、20 d和7 d后樣品中間酪氨酸和鄰酪氨酸測(cè)定結(jié)果。在-20 ℃貯存條件下，儲(chǔ)存時(shí)間長(zhǎng)達(dá)90 d時(shí)，間酪氨酸和鄰酪氨酸含量與未經(jīng)貯存的樣品相比略有升高，這可能與長(zhǎng)期冷凍條件下，樣品的水分流失有關(guān)，但一定程度上表明在此儲(chǔ)存條件下間酪氨酸和鄰酪氨酸較為穩(wěn)定，受外界因素影響較小。在4 ℃貯存20 d后，間酪氨酸和鄰酪氨酸含量基本保持穩(wěn)定，只略有下降；在20 ℃貯存7 d后，樣品呈現(xiàn)明顯的腐敗狀態(tài)，間酪氨酸和鄰酪氨酸含量下降，但是即使是經(jīng)0.5 kGy低劑量輻照樣品中仍能檢測(cè)到一定含量的間酪氨酸和鄰酪氨酸，并與輻照劑量仍然呈現(xiàn)正相關(guān)性。因此，不同貯藏條件不影響對(duì)樣品是否經(jīng)過(guò)輻照的判定。

圖4 不同貯存條件下間酪氨酸（A）和鄰酪氨酸（B）的含量變化Fig. 4 Changes in m-tyrosine (A) and o-tyrosine (B) contents at different storage temperatures

2.5.2 加工方式的影響

圖5 不同加工方式后間酪氨酸（A）和鄰酪氨酸（B）含量變化Fig. 5 Changes in m-tyrosine (A) and o-tyrosine (B) contents after different thermal processing treatments

采用海產(chǎn)品加工中常用的3 種加工方式對(duì)不同劑量輻照后的樣品進(jìn)行處理，研究不同加工方式對(duì)本研究確立的通過(guò)間酪氨酸和鄰酪氨酸作為標(biāo)識(shí)物檢測(cè)輻照海產(chǎn)品方法的影響。分別采用漂燙（50 ℃水中5 min）、蒸煮（100 ℃、10 min）及烘烤（115 ℃、8 min）3 種方式對(duì)輻照后樣品進(jìn)行加工處理，與未經(jīng)加工處理的樣品進(jìn)行對(duì)照，測(cè)定間酪氨酸和鄰酪氨酸含量，結(jié)果見(jiàn)圖5，輻照后不同的加工方式對(duì)樣品中的間酪氨酸和鄰酪氨酸含量具有一定影響，其影響作用最大為烘烤（115 ℃、8 min）的加工方式，對(duì)海產(chǎn)品的形態(tài)影響較為顯著，其水分快速流失，蛋白質(zhì)凝固，樣品整體質(zhì)地變硬，影響間酪氨酸和鄰酪氨酸的提取，對(duì)定量檢測(cè)產(chǎn)生影響，使檢測(cè)到的間酪氨酸和鄰酪氨酸含量下降。蒸煮（100 ℃、10 min）的加工方式也會(huì)導(dǎo)致間酪氨酸和鄰酪氨酸損失，蒸煮過(guò)程一部分游離氨基酸會(huì)溶解到水中，造成游離間酪氨酸和鄰酪氨酸含量減少。影響最小加工方式為漂燙（50 ℃、5 min），對(duì)輻照標(biāo)識(shí)物的含量基本無(wú)影響。不同加工方式對(duì)間酪氨酸和鄰酪氨酸含量的影響存在差異，與海產(chǎn)品經(jīng)不同方式加工后其形態(tài)、水分含量、蛋白質(zhì)組成等發(fā)生不同程度的變化，從而導(dǎo)致間酪氨酸和鄰酪氨酸含量發(fā)生變化。

3 結(jié) 論

輻照可誘導(dǎo)苯丙氨酸產(chǎn)生酪氨酸的3 種同分異構(gòu)體即對(duì)酪氨酸、間酪氨酸和鄰酪氨酸，且無(wú)需其他酶和微生物的作用。在無(wú)基質(zhì)干擾的情況下，輻照劑量與輻照標(biāo)識(shí)物的含量呈線性關(guān)系。不同的加工方式對(duì)間酪氨酸和鄰酪氨酸輻照特異性標(biāo)識(shí)物的鑒定不產(chǎn)生影響。針對(duì)海產(chǎn)品，輻照劑量和水分與輻照標(biāo)識(shí)物產(chǎn)生的含量密切相關(guān)。在-20 ℃條件下，間酪氨酸和鄰酪氨酸具有良好的穩(wěn)定性；不同貯藏條件和加工方式對(duì)輻照海產(chǎn)品中輻照標(biāo)識(shí)物酪氨酸的間酪氨酸和鄰酪氨酸含量存在一定影響，但是仍能提取到足夠量的間酪氨酸和鄰酪氨酸用于輻照海產(chǎn)品的鑒定，該方法最低可檢測(cè)到經(jīng)0.5 kGy輻照的樣品。因此，采用QTRAP-UPLC-MS/MS技術(shù)，利用其高靈敏度及準(zhǔn)確的二次定性特點(diǎn)，對(duì)海產(chǎn)品中鄰酪氨酸和間酪氨酸作為輻照標(biāo)識(shí)物進(jìn)行鑒定，可準(zhǔn)確對(duì)輻照海產(chǎn)品是否經(jīng)過(guò)輻照進(jìn)行判定。