超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測輔助降血脂保健食品中6 種非法添加化學(xué)藥物

李曉蕾，陳 軍，楊朝芬，楊 俊

（1.昆明理工大學(xué)分析測試研究中心，云南 昆明 650000；2.中國林業(yè)科學(xué)研究院資源昆蟲研究所，云南 昆明 650000）

近年，隨著生活質(zhì)量的顯著提高，人們對自身健康越來越關(guān)注，保健品市場利益空間迅速增加。但是，隨之而來的食品藥品安全問題不斷增多，一些不法分子為獲取高額利益在保健食品中非法添加化學(xué)藥物[1-2]，使其功效顯著。此類非法添加隨意性大，劑量不明確，標(biāo)簽上又未作說明，往往會導(dǎo)致消費(fèi)者長期、超量服用而引起毒性反應(yīng)，嚴(yán)重的甚至危及生命[3]。

目前，國內(nèi)外對于保健食品中非法添加化學(xué)藥的研究很多[4-9]，但降血脂類化學(xué)藥物添加方面的研究尚不夠深入。而近年發(fā)病率逐漸上升的高血脂癥等心腦血管疾病，已成為嚴(yán)重危害我國人民健康的“隱形殺手”[10-11]，輔助降血脂保健食品市場也呈飛速上升趨勢。已有報道的檢測方法有薄層色譜法[12]和高效液相色譜法[13-14]，但存在選擇性差、定性能力弱和靈敏度低的問題；也有液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[15-16]，但檢測成分較少、檢測時間較長。國家食品藥品監(jiān)督管理局曾于2010年和2017年先后頒布了《輔助降血脂類保健食品違法添加藥物的檢測方法》[17]、《保健食品中75 種非法添加化學(xué)藥物的檢測》[18]、《食品中西布曲明等化合物的測定》[19]，方法中均含有降血脂類化學(xué)藥成分的檢測，但檢測成分較少而檢測時間較長，靈敏度也不夠高。因此研究降血脂類化學(xué)藥物的檢測方法，對促進(jìn)質(zhì)量監(jiān)督，保障食品安全和人民健康是十分有必要的。

本實驗擬選取6 種臨床上較常用，相對生產(chǎn)成本較低因而價格較低，易于非法添加的降血脂化學(xué)藥物，采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，以多反應(yīng)監(jiān)測模式（multi-reaction monitoring，MRM），建立快速、有效地定性、定量檢測輔助降血脂保健食品中6 種非法添加降血脂藥物成分的分析方法，并對20 批市售的輔助降血脂功能保健食品進(jìn)行檢測，擬為降血脂類保健食品安全監(jiān)控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

輔助降血脂功能保健食品 市售。

對照品：煙酸（批號LF80N66，純度99.5%）、普伐他汀鈉（批號8-XJZ-27-1，純度98.0%）、氟伐他汀鈉（批號7-ABY-122-1，純度98.0%）、美伐他?。ㄅ?-NYL-167-1，純度98.0%）、洛伐他汀（批號LK10O58，純度98.0%）、辛伐他?。ㄅ?1-SCC-167-1，純度98.0%） 中國食品藥品檢定研究院；實驗用水為超純水；樣品處理所用甲醇為分析純，其他試劑均為質(zhì)譜純。

1.2 儀器與設(shè)備

ACQUITY UPLC Xevo TQD液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（配有電噴霧離子源、Masslynx 4.1數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)） 美國Waters公司；Advantage-10/Elix Milli-Q超純水儀 美國Millopore公司；BP211D型電子天平德國Sartorius科學(xué)儀器有限公司；KQ-300DA型數(shù)控型超聲波提取儀 上海波龍電子有限公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Waters Acquity BEH-C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；流動相：流動相A為0.1%甲酸溶液，流動相B為乙腈；梯度洗脫：0～2.5 min，50% B，2.5～3.0 min，60% B，3.0～3.5 min，100% B，3.5～4.0 min，50% B；流速0.2 mL/min；色譜柱溫度30 ℃；進(jìn)樣量1 μL[20-22]。

1.3.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源正離子模式掃描；毛細(xì)管電壓2.68 kV；脫溶劑氣溫度500 ℃；脫溶劑氣流量850 L/h；錐孔氣流速50 L/h；碰撞氣體為氬氣；子離子掃描及MRM模式同時監(jiān)測[23-24]。經(jīng)質(zhì)譜條件優(yōu)化后，各物質(zhì)的色譜保留時間、分子離子與特征碎片離子及其采集參數(shù)[25]見表1。

表1 6 種降血脂化學(xué)藥物的質(zhì)譜采集參數(shù)Table 1 Mass spectroscopic parameters for six antilipemic chemicals

1.3.3 溶液的制備

對照品溶液：分別精密稱取煙酸、普伐他汀鈉、氟伐他汀鈉、美伐他汀、洛伐他汀、辛伐他汀適量（約1～5 mg），置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，定容，搖勻，作為各標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。各取單標(biāo)儲備液適量（0.1～1 mL），置于50 mL容量瓶，用甲醇稀釋并定容配制成混合對照品溶液，使用時進(jìn)一步稀釋。

供試品溶液：將具有輔助降血脂功效的保健食品每個品種取10～20 粒油狀樣品內(nèi)容物，混勻；或取10～20 片（丸或袋）固體樣品，置研缽中研磨均勻呈粉末狀。分別精密稱取一次推薦服用量的樣品，置于50 mL容量瓶中，加甲醇40 mL，超聲提取15 min。冷卻至室溫后，用甲醇稀釋定容，搖勻，直接作為供試品溶液，分析時上清液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后上樣。

陰性樣品溶液：取具有代表性的固體顆粒劑（和信茶）、膠囊劑（油狀大豆磷脂膠囊、粉狀三七膠囊）和片劑（阿膠含片）3 種劑型共4 種陰性樣品，分別精密稱取一次推薦服用量樣品置于50 mL容量瓶，與供試品溶液同法制成陰性樣品溶液。

2 結(jié)果與分析

2.1 6 種化學(xué)藥物的色譜及質(zhì)譜特性

色譜-質(zhì)譜條件的優(yōu)化：實驗對流動相的組成（甲醇-水、甲醇-甲酸溶液、乙腈-水、乙腈-甲酸溶液）、流速（0.1、0.2、0.4 mL/min）和柱溫（20、30、40 ℃）等條件分別進(jìn)行考察。對流動相的考察發(fā)現(xiàn)，甲醇-水體系較乙腈-水體系分析時間長，峰形差，因此選用乙腈-水體系，而乙腈-水體系在水中添加0.1%的甲酸后峰形更好，因此選用0.1%甲酸-乙腈溶液做流動相。在流速為0.4 mL/min或溫度為40 ℃時，由于煙酸、普伐他汀鈉和洛伐他汀、辛伐他汀2 組成分的保留時間比較接近，不能很好地達(dá)到基線分離，而流速低（0.1 mL/min）或溫度低（20 ℃）均會導(dǎo)致分析時間延長，故最終確定0.2 mL/min，柱溫30 ℃為實驗最佳條件。優(yōu)化得到的最佳色譜條件可在4 min內(nèi)高分離度、快速有效地分離6 種化學(xué)藥物，均優(yōu)于國家食品藥品監(jiān)督管理局發(fā)布的檢測方法[17-19]及相關(guān)文獻(xiàn)[21-24]方法。質(zhì)譜部分在正離子、MRM模式下，用1 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液手動調(diào)諧結(jié)合自動調(diào)諧，逐一選擇并確定適合各化合物的準(zhǔn)離子峰及母離子，采用子離子掃描方式進(jìn)行二級質(zhì)譜分析，對子離子進(jìn)行優(yōu)化選擇，找出滿足化合物碎裂規(guī)律的子離子，確定定量與定性離子，同時優(yōu)化毛細(xì)管電壓和錐孔電壓、碰撞能量等質(zhì)譜參數(shù)，使離子強(qiáng)度最大、分離度最佳。最后確定測定6 種化學(xué)藥物的定性和定量離子對，共12 個離子檢測通道。各化合物采集的總離子流見圖1，定量離子對的MRM離子流見圖2。

圖1 6 種降血脂類化學(xué)藥物的總離子流色譜圖Fig. 1 Total ion current chromatograms of six antilipemic drugs

圖2 6 種降血脂化學(xué)藥對照品定量離子對的MRM色譜圖Fig. 2 MRM chromatograms of quantitative ions of 6 antilipemic drug standards

2.2 基質(zhì)效應(yīng)考察結(jié)果

本實驗選取具有代表性的4 種陰性樣品基質(zhì)：固體顆粒劑（和信茶）、膠囊劑（油狀大豆磷脂膠囊、粉狀三七膠囊）和片劑（阿膠含片）進(jìn)行基質(zhì)效應(yīng)考察。基質(zhì)效應(yīng)根據(jù)基質(zhì)空白配制標(biāo)樣響應(yīng)值與同質(zhì)量濃度溶劑標(biāo)樣響應(yīng)值的比值進(jìn)行評價[26-27]，大于1時為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，小于1時為基質(zhì)抑制效應(yīng)。對于基質(zhì)效應(yīng)過強(qiáng)的樣品，應(yīng)采取相應(yīng)的處理手段以減小其對測定的干擾。從實驗結(jié)果可以看出，基質(zhì)對煙酸、普伐他汀鈉表現(xiàn)出基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，而對氟伐他汀鈉、美伐他汀、洛伐他汀、辛伐他汀表現(xiàn)出基質(zhì)抑制效應(yīng)。本實驗考察的基質(zhì)效應(yīng)在0.82～1.18之間，表明樣品基質(zhì)對目標(biāo)成分響應(yīng)干擾相對較小。

樣品處理過程中，大部分基質(zhì)較簡單，前處理時采用甲醇超聲提取過濾后即上樣分析。但個別樣品（如苦瓜洋參軟膠囊和蒼芎膠囊）基質(zhì)相對比較復(fù)雜，對出峰時間較早的煙酸和普伐他汀鈉基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)大于1.3，影響數(shù)據(jù)正確性，且易污染質(zhì)譜檢測器離子源，故先將樣品過WAX固相萃取柱凈化處理后再上機(jī)分析[28]?？喙涎髤④浤z囊和蒼芎膠囊凈化后基質(zhì)效應(yīng)降至1.12和1.15，但凈化后回收率降低至70.2%和65.4%，因此在基質(zhì)影響相對較小的情況下并未對所有樣品進(jìn)行凈化處理。

2.3 方法專屬性考察結(jié)果

取具有代表性的固體顆粒劑（和信茶）、膠囊劑（油狀大豆磷脂膠囊、粉狀三七膠囊）和片劑（阿膠含片）3 種劑型共4 種陰性樣品，按陰性樣品溶液的制備方法處理后，依1.3.1節(jié)方法進(jìn)樣，按1.3.2節(jié)方法采集圖譜，得到陰性樣品的MRM離子流色譜圖，12 個離子通道中均未見有干擾6 種目標(biāo)物的色譜峰。結(jié)果表明，具有代表性的4 種陰性樣品對所測6 種目標(biāo)物均無干擾，方法專屬性良好。

2.4 線性關(guān)系考察與檢出限（limit of detection，LOD）和定量限（limit of quantity，LOQ）測定結(jié)果

取混合對照品溶液，按1.3.1節(jié)和1.3.2節(jié)方法進(jìn)樣測定，以各組分定量離子對的峰面積（Y）對質(zhì)量濃度（X）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程和相關(guān)系數(shù)（R2），見表2。結(jié)果表明，6 種化學(xué)藥物的線性關(guān)系在線性范圍內(nèi)良好，R2均在0.995 5以上。取陰性樣品和信茶適量，置于50 mL容量瓶中，按1.0 mg/g的添加量加入混合對照品溶液，按供試品溶液同法經(jīng)逐步稀釋后進(jìn)樣，以3 倍信噪比時計算各化學(xué)藥的LOD，為10 倍信噪比時計算各化學(xué)藥的LOQ，其中洛伐他汀、美伐他汀和辛伐他汀的LOD降低至國家食品藥品監(jiān)督管理局發(fā)布檢測方法[18]的12.5%以下。結(jié)果表明方法LOD均在4～39 μg/kg之間，說明方法具有較高的靈敏度。

表2 6 種降血脂化學(xué)藥的線性方程、相關(guān)系數(shù)、回收率及LOD、LOQTable 2 Linear equations, correlation coefficients, linear ranges,LODs, and LOQs for six antilipemic drugs

2.5 進(jìn)樣精密度實驗結(jié)果

取混合對照品溶液1 μL，按1.3.1節(jié)和1.3.2節(jié)色譜、質(zhì)譜條件進(jìn)樣測定，連續(xù)測定6 次，計算煙酸、普伐他汀鈉、氟伐他汀鈉、美伐他汀、洛伐他汀、辛伐他汀定量離子對質(zhì)譜峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）分別為1.16%、5.20%、2.26%、3.88%、2.12%、6.86%，均在7%以內(nèi)，表明方法的精密度良好。

2.6 重復(fù)性實驗結(jié)果

精密稱取三七膠囊陰性樣品6 份，每份為1 次日常服用量，分別精密加入對照品儲備液適量，使含各種化學(xué)藥含量均為1.0 mg/kg，按1.3.3節(jié)方法制成供試品溶液進(jìn)樣測定，計算各成分含量及其RSD。結(jié)果煙酸、普伐他汀鈉、氟伐他汀鈉、美伐他汀、洛伐他汀、辛伐他汀的含量分別為0.97、0.99、1.02、1.01、0.95、0.96 mg/kg；RSD分別為2.46%、2.49%、3.14%、1.86%、1.50%、1.57%，表明該方法重復(fù)性較好。

2.7 溶液穩(wěn)定性實驗結(jié)果

取供試品溶液1 份，在配制后避光冷藏放置0、2、4、6、8、12 h。根據(jù)6 種化學(xué)藥的定量離子對峰面積計算其RSD分別為2.83%、1.75%、4.29%、2.58%、5.61%、1.87%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 加標(biāo)回收率實驗結(jié)果

表3 3 種不同基質(zhì)陰性樣品中6 種降血脂化學(xué)藥的加標(biāo)回收率結(jié)果Table 3 Recoveries of six antilipemic drugs in three different spiked matrixes

續(xù)表3

精密稱取陰性樣品和信茶、三七膠囊、阿膠含片各9 份，每份為1 次日常服用量，分為3 組，按1.3.3節(jié)方法制備成陰性樣品溶液，分別進(jìn)行定量限1、2、10 倍（0.1、0.2、1.0 mg/kg）3 個添加水平的回收率實驗，結(jié)果見表3。6 種化學(xué)藥物的加樣平均回收率均在80.2%～106.1%之間。

2.9 樣品測定

本實驗共收集輔助降血脂類功能性保健食品20 批，取各樣品按1.3.3節(jié)方法制備供試品溶液，按1.3.1節(jié)和1.3.2節(jié)色譜、質(zhì)譜條件進(jìn)樣測定，根據(jù)定量監(jiān)測離子對的色譜峰面積，采用外標(biāo)法計算樣品中各化學(xué)藥物成分的含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，20 批輔助降血脂類保健食品中共檢出3 批可能添加化學(xué)藥物，分別檢測出煙酸和洛伐他汀，含量分別為煙酸81.2、72.7 μg/g，洛伐他汀690 μg/g。

3 結(jié) 論

本實驗建立輔助降血脂類保健食品中6 種非法添加降血脂化學(xué)藥物（煙酸、普伐他汀鈉、氟伐他汀鈉、美伐他汀、洛伐他汀、辛伐他汀）的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，具有快速、準(zhǔn)確、靈敏度高和專屬性強(qiáng)等優(yōu)點，可為藥品監(jiān)管及規(guī)范保健品市場提供理論依據(jù)。對于如何杜絕保健食品非法添加的情況，建議一方面大力發(fā)展更先進(jìn)靈敏的檢測技術(shù)，另一方面也需建立和完善非法添加有害化學(xué)成分的各種譜庫信息，以利于對有害物進(jìn)行篩查[29-30]，此外，從多方面加強(qiáng)監(jiān)管以及增加懲罰力度也十分重要。