高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定嬰幼兒配方奶粉中酪蛋白磷酸肽含量

胡 蓓，張京順，柯 星，蔣易蓉，周 健，果基施銻，任一平,*

（1.浙江工業(yè)大學化工學院，浙江 杭州 310014；2.浙江省疾病預防控制中心，浙江 杭州 310051；

3.浙江大學生物系統(tǒng)工程與食品科學學院，浙江 杭州 310058；4.阿爾拉食品原料貿(mào)易（北京）有限公司，北京 100035）

酪蛋白磷酸肽（casein phosphopeptides，CPPs）是牛酪蛋白經(jīng)單一酶或復合生物酶水解后的產(chǎn)物，分布于αs1-、αs2-、β-以及κ-酪蛋白中的不同區(qū)域。CPPs已被我國批準作為添加劑，應用于各種營養(yǎng)品、保健食品，能有效提高人體對鈣、鐵、鋅等二價礦物質(zhì)的攝入及吸收利用率[1-5]；同時，CPPs還有預防齲齒[6-7]、有助于促進動物體外受精[8]、增強機體免疫力[9]和誘導細胞凋亡的生理功能[10]。CPPs生物活性的核心結(jié)構為：-Ser（P）-Ser（P）-Ser（P）-Glu-Glu-（Ser：絲氨酸，Glu：谷氨酸，P：磷酸基）[11]這一結(jié)構中，磷酸絲氨酸殘基（-Ser（P）-）成簇存在，在腸道弱堿性環(huán)境下帶負電荷，可阻止CPPs在消化酶的作用下進一步被水解，從而在小腸中穩(wěn)定存在。研究發(fā)現(xiàn)，CPPs中氮磷比越小，其肽鏈越短，磷酸基的密度越大，則促進鈣吸收作用越強[12]。此外還有研究證明CPPs的作用效果還與分子中氨基酸組成順序或磷酸基分布有關[13-14]。CPPs有較強的促進鈣吸收作用以及良好的高溫穩(wěn)定性[15]，因此，隨著鈣高效輔助吸收劑的推廣，將CPPs（以牛乳或酪蛋白制品為原料，通過酶解生產(chǎn)工藝制得的食品添加劑[16-19]）添加到各種產(chǎn)品中，如保健品、兒童營養(yǎng)食品等。GB 14880—2012《食品營養(yǎng)強化劑使用標準》對CPPs可應用于嬰幼兒配方食品、糧食和糧食制品、飲料等，并對使用量（嬰幼兒配方食品中≤3.0 g/kg）作了明確規(guī)定[20]。

目前普遍采用鋇鹽沉淀法[21]、電泳法[22-23]、高效液相色譜法[24-25]、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[26-27]測定CPPs的含量。賴奕堅等[26]采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法中SIR模式檢測鈣片中CPPs的含量，根據(jù)掃描結(jié)果選取離子m/z為454.3的特征峰作為CPPs的代表，并使用SIR模式對該特征峰進行定量，但未對該特征峰作為CPPs的代表作進一步的分析。近幾年，應用高分辨色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法對不同種屬哺乳動物乳的酪蛋白中磷酸化的具體位點[28]以及不同哺乳期中磷酸化位點的變化情況[27]作了較多報道，但對應用低分辨三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜用于樣品定量分析的方法鮮見報道。而本實驗針對嬰幼兒配方奶粉等添加CPPs食品的定量檢測方法進行分析。

本研究依據(jù)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫確定酪蛋白氨基酸序列信息，通過高分辨質(zhì)譜篩選出CPPs原料中具有特異性的肽段，再通過低分辨串聯(lián)質(zhì)譜的多重反應監(jiān)測建立定量模式。依據(jù)CPPs原料與CPPs特征肽之間的含量關系，采用同位素稀釋內(nèi)標法測定強化CPPs嬰幼兒配方奶粉中CPPs的含量。該方法具有操作簡便、靈敏度高、特異性強等特點，可滿足目前市售嬰幼兒配方奶粉中CPPs含量的測定。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

CPPs原料 丹麥Arla乳品公司；CPPs特征肽LSQSKVLPVPQK、同位素內(nèi)標肽LSQSKVL*PV*PQK（L*：Leu-OH-13C6，15N；V*：Val-OH-13C5，15N）（純度＞95%） 上海強耀生物科技有限公司；甲酸、乙腈、乙酸銨（均為色譜純） 德國Merck公司；乙酸（優(yōu)級純）、無水乙醇（分析純） 國藥集團化學試劑有限公司；鹽酸、氫氧化鈉（均為分析純） 上海凌峰化學試劑有限公司；氯化鋇（分析純） 上海泗聯(lián)化工廠有限公司；水為Millipore制備的超純水。

1.2 儀器與軟件

1290 Infinity超高壓液相色譜儀、6460系列三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀 美國Agilent公司；Q Exactive Orbitrap、Proteome Discoverer 2.1軟件 美國Thermo Fisher Scientific公司；Uniprot蛋白質(zhì)組學數(shù)據(jù)庫（http://www.uniprot.org）。

1.3 方法

1.3.1 試樣前處理

乳制品中通常蛋白質(zhì)含量較高，而其中酪蛋白又占多數(shù)，在前處理過程中對目標肽段的提取和準確測定會產(chǎn)生一定影響，因此需要采取適當?shù)那疤幚硪匀コ蟛糠值牡鞍赘蓴_。根據(jù)文獻[29]，酪蛋白的等電點為4.6，因此本實驗采用等電點蛋白質(zhì)沉淀法：稱取5 g奶粉樣品，超純水溶解，定容至100 mL，取80 μL，加入50 μL同位素內(nèi)標溶液（1 μg/mL），加870 μL乙酸銨-乙酸緩沖溶液（10 mmol，pH 4.6），8 000 r/min（4 ℃）離心5 min。取上清液用0.22 μm濾膜過濾。結(jié)果顯示，經(jīng)過蛋白沉淀后，再檢測CPPs特征肽段，方法回收率高（105.4%）、穩(wěn)定性好（相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）為1.6%）、實驗操作方便、分析效率高。

1.3.2 指標的測定

1.3.2.1 折算系數(shù)的確定

稱取CPPs原料（共8 個待測樣品）各0.1 g于試管中，用超純水將試樣充分溶解后定容至100 mL。定容后取125 μL用超純水稀釋至1.0 mL，渦旋混勻。取80 μL于2 mL試管中，加入50 μL同位素內(nèi)標溶液（1 μg/mL）、870 μL乙酸銨-乙酸緩沖溶液（10 mmol，pH 4.6），8 000 r/min（4 ℃）離心5 min，取上清液過0.22 μm濾膜。CPPs特征肽含量計算見公式（1）：

式中：Cx1為原料中CPPs特征肽的含量/（mg/100 g）；na1為根據(jù)標準曲線計算得到的原料中CPPs特征肽質(zhì)量濃度/（ng/mL）；v1為原料的定容體積/mL；m1為原料的質(zhì)量/g；F1為待測原料溶液的稀釋倍數(shù)。

折算系數(shù)即為CPPs原料中CPPs特征肽的含量。根據(jù)公式（1）計算8 批原料中CPPs特征肽的含量分別為1 071.4、1 113.4、1 043.1、983.2、1 020.4、1 038.5、1 060.0、1 020.3 mg/100 g。將計算得到的所有批次中特征肽的含量通過SPSS軟件分析，8 個批次的原料之間不存在顯著性差異（P＞0.05）。說明不同批次原料中CPPs特征肽的含量較為穩(wěn)定，因此將所有批次中特征肽段含量的平均值1 043.7 mg/100 g作為折算系數(shù)，對其進行換算，折算系數(shù)=1 043.7×10-3g/100 g=1.0×10-2。

1.3.2.2 樣品中CPPs含量的計算

樣品中的CPPs按公式（2）計算：

式中：Cx2為試樣中CPPs的含量/（mg/100 g）；na2為根據(jù)標準曲線計算得到的試樣中CPPs特征肽的質(zhì)量濃度/（ng/mL）；v2為試樣的定容體積/mL；m2為試樣的質(zhì)量/g；F2為待測原料溶液的稀釋倍數(shù)；f1為折算系數(shù)，本方法中f1=1.0×10-2；f2為CPPs原料中CPPs的百分比含量。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH 300 C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；柱溫：35 ℃；進樣量：10 μL；流速：0.3 mL/min。流動相A：0.1%甲酸溶液，B：0.1%甲酸-乙腈溶液。線性梯度洗脫程序：0～1 min，5% B；1～3.5 min，5%～27% B；3.5～4.5 min，27% B；4.5～5 min，27%～100% B；5～5.8 min，100% B；5.8～6.0 min，100%～5% B，保持2 min，等待下一針進樣。

1.3.4 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源正離子模式；毛細管電壓3.5 kV，脫溶劑溫度375 ℃，脫溶劑氣流量11.5 L/min。多離子反應監(jiān)測模式，CPPs特征肽的監(jiān)測母離子為3電荷[M＋3H]3＋，監(jiān)測離子對為m/z 442.1→372.4和m/z 442.1→568.5，碰撞能量分別為15 eV和10 eV；同位素內(nèi)標肽的監(jiān)測母離子為3電荷[M＋3H]3＋，監(jiān)測離子對為m/z 446.3→372.2和m/z 446.3→574.5，碰撞能量分別為15 eV和10 eV。

1.3.5 鋇鹽沉淀法

按照GB 31617—2014《食品營養(yǎng)強化劑 酪蛋白磷酸肽》[30]方法操作。稱取試樣1.5 g，精確至0.000 2 g，置于50 mL離心管A中，加入15 mL水使其完全溶解。用鹽酸溶液（2 mol/L）調(diào)節(jié)試樣溶液的pH值至4.6，然后置于冷凍離心機中，于4 ℃、6 000 r/min離心30 min，取上清液于預先在105 ℃干燥至恒質(zhì)量的50 mL離心管B中，用氫氧化鈉溶液（80 g/L）調(diào)節(jié)上清液的pH值至6.8，控制溶液總量在20 mL以內(nèi)，加入氯化鋇溶液（100 g/L）1.5 mL，再加入無水乙醇至50 mL，搖勻后于4 ℃冰箱中過夜。然后，從冰箱中取出置于冷凍離心機中，于4 ℃、6 000 r/min離心30 min，棄去上清液得沉淀物。沉淀物先在60 ℃干燥箱中烘1 h，再升高溫度至105 ℃烘干至恒質(zhì)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 特征肽的選擇結(jié)果

工業(yè)生產(chǎn)CPPs的工藝主要是通過對牛奶中酪蛋白的提取、酶解和富集，工藝復雜，且不同批次之間的含量存在差異，因此含量相對穩(wěn)定特征肽段的確定是本方法建立的關鍵。將CPPs原料溶解后經(jīng)色譜分離，通過高分辨質(zhì)譜（Q Exactive Orbitrap）進行全掃描/數(shù)據(jù)依賴的二級掃描（Full MS/dd-MS2）模式掃描，經(jīng)Proteome Discoverer 2.1軟件及Uniprot蛋白質(zhì)組學數(shù)據(jù)庫（http://www.uniprot.org）分析比對，確定出不同批次產(chǎn)品中都存在的肽段，如表1所示。

表1 通過蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫分析所得到的肽段信息Table 1 Peptides obtained from protein database

根據(jù)各批次間肽段含量相對穩(wěn)定的原則，連續(xù)檢測3 d，每天按照相同方法處理CPPs原料，檢測各批次原料中各肽段的含量。從中初步確定肽段含量穩(wěn)定、并且RSD小于15%的7 條肽段（表2），其氨基酸序列分別為LSQSKVLPVPQK、VLSRYPSYG、LNYYQQKP、AVPITPT、FYQKFPQY、IVPNpS*AEERLHSM、IQKEDVPSERY。

表2 候選肽段的等電點及親水性Table 2 Isoelectric point and hydrophilicity of candidate peptides

在已查找到的7 條肽段中進行第2次篩選，選擇特異性強和靈敏度高的肽段作為特征肽用于定量分析。篩選依照的原則：1）避選含有甲硫氨酸（M）的肽段，因甲硫氨酸在暴露的情況下易被氧化[31]，影響對該肽段的準確定量。2）選擇含6 個以上氨基酸的肽段。氨基酸組成個數(shù)相對越多，肽段序列越長的肽段其類同的可能性越小，其特異性越強。3）選擇應用本法檢測可獲得高靈敏度、回收率（接近100%），且穩(wěn)定的肽段。4）盡可能選擇由β-酪蛋白和αs1-酪蛋白所酶解的肽段，由于酪蛋白中β-酪蛋白和αs1-酪蛋白含量最高，易于被檢測。

根據(jù)以上原則，連續(xù)進行3 d樣品同水平加標實驗，每天按照相同方法處理CPPs原料，檢測原料中各肽段的回收率及精密度。結(jié)果顯示，肽段LSQSKVLPVPQK靈敏度高（圖1）。由表3可知，肽段LSQSKVLPVPQK的回收率最佳，并且日內(nèi)、日間精密度均小于5%。綜上，本實驗選擇LSQSKVLPVPQK作為CPPs原料的特征肽。

圖1 所選肽段在CPPs原料中的響應Fig. 1 Response of selected peptide fragments in CPPs

表3 各肽段的回收率及精密度Table 3 Recovery and precision (RSD) of each peptide

2.2 同位素內(nèi)標肽的設計

影響質(zhì)譜定量檢測最大因素在于基質(zhì)干擾，同位素內(nèi)標的使用可以排除基質(zhì)干擾，確保定量結(jié)果的準確性。鑒于多肽在電噴霧正離子模式下可產(chǎn)生雙電荷或三電荷離子；另外，碳（1.11%13C）、氮（0.37%15N）元素的天然同位素豐度較高，在質(zhì)譜檢測器中響應較顯著，若同位素標記個數(shù)過少則會存在離子干擾，同時需要考慮檢測的成本，因此選擇兩個全同位素標記氨基酸（L和V），其質(zhì)量數(shù)與原氨基酸差分別為7和6，同位素內(nèi)標的序列為LSQSKVL*PV*PQK。對得到的同位素內(nèi)標溶液進行質(zhì)譜實驗確證，待測肽段和同位素內(nèi)標具有完全相同的色譜行為，并且相互之間不存在干擾。

2.3 方法學驗證結(jié)果

2.3.1 特異性

為驗證所選擇的肽段為CPPs的特征肽段，在Uniprot蛋白數(shù)據(jù)庫進行序列分析，發(fā)現(xiàn)所選肽段只存在于?？苿游锶榈睦业鞍字校禺愋詮?。此外，選擇嬰幼兒配方粉生產(chǎn)通常涉及的乳清蛋白、全脂粉、大豆蛋白、大米蛋白等不同類型的蛋白進行特異性驗證實驗，樣品按照1.3節(jié)所述進行前處理，相同儀器條件下進行分析（圖2）。結(jié)果顯示，上述蛋白在所選肽段離子通道中均不存在干擾峰。

圖2 不同蛋白對肽段的干擾情況Fig. 2 Interference effect of different proteins on the signature peptide

2.3.2 線性和靈敏度

線性范圍為10～150 mg/100 g，CPPs的相關系數(shù)（R2）大于0.999。將前處理得到的加標樣品溶液稀釋標準品成一系列濃度梯度進樣，以信噪比為3和10分別為方法檢出限和定量限，為0.3 mg/100 g和1 mg/100 g。

2.3.3 準確度和精密度

方法準確性主要通過3 水平加標實驗來評估，每個加標水平實驗平行6 次，加標水平及回收率結(jié)果如表4所示。精密度則通過日間、日內(nèi)（連續(xù)重復3 d）RSD表示，結(jié)果顯示日內(nèi)RSD均小于7.0%，日間RSD均小于8.0%。

表4 準確度及精密度結(jié)果Table 4 Accuracy and precision of the method

2.4 方法驗證應用結(jié)果

為了驗證方法的適用性，對5 種嬰幼兒配方奶粉按照建立的方法樣品處理后進行測定。由表5可知，應用此方法測定的嬰幼兒配方奶粉中CPPs的含量與標簽標示值相近，通過T檢驗發(fā)現(xiàn)，P值為0.97（＞0.05），說明兩組結(jié)果不存在顯著性差異，此方法能準確的測定嬰幼兒配方奶粉中CPPs的含量，因此可用于嬰幼兒配方奶粉的檢測。鋇鹽沉淀法原理是鋇離子和磷酸化肽段形成穩(wěn)定的絡合物，通過干燥后稱質(zhì)量的方法定量檢測酪蛋白磷酸肽的含量。本實驗中，鋇鹽沉淀法所得樣品結(jié)果遠大于標示值?？赡艿脑蚴菢悠分衅渌M分也和鋇離子結(jié)合，從而導致檢測結(jié)果偏高。

表5 嬰幼兒配方奶粉中CPPs的含量Table 5 Actual and measured contents of CPPs in infant formulas

3 結(jié) 論

本實驗通過高分辨質(zhì)譜、Proteome Discoverer 2.1軟件和Uniprot蛋白質(zhì)組學數(shù)據(jù)庫查詢獲得了酪蛋白的詳細的肽段信息，經(jīng)過低分辨質(zhì)譜的反復實驗確定了7 條可選擇的肽段，再經(jīng)第2次精選，確定序列LSQSKVLPVPQK的肽段作為對強化CPPs的產(chǎn)品定量檢測的特異肽段。并且設計合成了可提供質(zhì)譜準確定量的同位素內(nèi)標。分別建立了適用與高含量原料和低含量強化樣品的預處理方法；經(jīng)對反復多批次的實際樣品檢測確定了特異肽段含量的折算系數(shù)和計算公式，可根據(jù)原料中CPPs的含量對嬰幼兒配方奶粉中CPPs的定量檢測。

方法學驗證實驗結(jié)果表明：方法具有良好的特異性，可排除樣品中其他蛋白質(zhì)的干擾；線性范圍為10～150 mg/100 g，定量限為1 mg/100 g，不同含量樣品的準確度與精密度結(jié)果良好。本方法相比于鋇鹽沉淀法具有前處理簡單、分析速度快、靈敏度高、定量結(jié)果準確、檢測限低等優(yōu)點，適用于低含量CPPs的檢測；本方法的建立為強化CPPs的嬰幼兒配方奶粉中CPPs的定量檢測提供了行之有效的手段。