棘孢青霉右旋糖酐酶基因克隆及其在畢赤酵母中的表達(dá)

吳 敏，張宇馨，胡雪芹，張洪斌*

（合肥工業(yè)大學(xué)生物與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，安徽 合肥 230009）

右旋糖酐酶是一種能專一性斷裂右旋糖酐α-1,6糖苷鍵的水解酶，主要催化產(chǎn)物包括低聚右旋糖酐以及低聚異麥芽糖等。低聚右旋糖酐T70、T40、T20是重要的血漿代用品，具有補(bǔ)充血容量、改善微循環(huán)等作用[1]。低聚異麥芽糖是一種功能性低聚糖，具有調(diào)節(jié)腸道菌群、改善人體內(nèi)微生態(tài)環(huán)境的作用[2-3]。除此之外，右旋糖酐酶及其衍生物還可用于糖蜜制作和飲料加工[4]、防治齲齒、保持口腔衛(wèi)生[5-6]等，具有重要的應(yīng)用價(jià)值。目前關(guān)于右旋糖酐酶的研究主要集中在產(chǎn)生菌株的挖掘以及酶學(xué)性質(zhì)的研究，但野生菌株遺傳背景不清晰、代謝復(fù)雜等缺陷[7]，極大程度限制了右旋糖酐酶在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用。為解決這一問題，國內(nèi)外學(xué)者開始在工程菌中對右旋糖酐酶基因進(jìn)行克隆表達(dá)，其中畢赤酵母以其綠色安全、表達(dá)量高的優(yōu)勢受到廣泛關(guān)注。1996年Roca等[8]首次在畢赤酵母菌株中表達(dá)了朱黃青霉右旋糖酐酶（Penicillium minioluteum IMI068219），甲醇誘導(dǎo)106 h后右旋糖酐酶產(chǎn)量達(dá)到3.2 g/L，酶活力為65.3 U/mg。梁達(dá)奉[9]分別構(gòu)建了誘導(dǎo)型、組成型2 種不同的重組酵母菌分泌表達(dá)朱黃青霉右旋糖酐酶（Penicillium minioluteum HI-4），搖瓶酶活力分別為75、60.4 U/mL。黃曾慰等[10]通過密碼子優(yōu)化進(jìn)一步提高朱黃青霉右旋糖酐酶（Penicillium minioluteum HI-4）在畢赤酵母中異源表達(dá)產(chǎn)量。青霉菌是右旋糖酐酶的主要來源菌屬，包括繩狀青霉[11]、點(diǎn)青霉[12-13]、嗜松青霉[14]、朱黃青霉、棘孢青霉[15-16]等。但目前關(guān)于青霉菌屬右旋糖酐酶的克隆表達(dá)主要集中于朱黃青霉，其他青霉屬右旋糖酐酶的相關(guān)研究鮮有報(bào)道，棘孢青霉F1001[16]是本實(shí)驗(yàn)室篩選獲得的高產(chǎn)右旋糖酐酶菌株，具有較高的產(chǎn)酶能力，所分泌表達(dá)的右旋糖酐酶是內(nèi)切型右旋糖酐酶并具有優(yōu)良的酶學(xué)性質(zhì)，對其進(jìn)行進(jìn)一步的克隆表達(dá)分析有利于加強(qiáng)對青霉屬右旋糖酐酶的認(rèn)識，也有利于提高右旋糖酐酶的工業(yè)應(yīng)用潛力。

本實(shí)驗(yàn)合成了棘孢青霉F1001右旋糖酐酶基因（GenBank登錄號KF999646.1）并對序列進(jìn)行優(yōu)化，分別將優(yōu)化前后的右旋糖酐酶基因序列克隆至畢赤酵母中進(jìn)行異源表達(dá)，特異性篩選獲得陽性菌株。對重組酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行考察并對搖瓶發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化探索。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

棘孢青霉H5、大腸桿菌DH5α為本實(shí)驗(yàn)室保存；畢赤酵母X33、質(zhì)粒pPICZαA 美國Invitrogen公司；限制性內(nèi)切酶、連接酶、聚合酶 北京全式金生物有限公司；Trizol提取試劑盒、第1鏈cDNA合成試劑盒、博來霉素 生工生物工程上海（股份）有限公司。

1.2 培養(yǎng)基

LLB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L、酵母浸粉5 g/L、NaCl 5 g/L，pH 7.0。棘孢青霉誘導(dǎo)培養(yǎng)基：右旋糖酐T70 15 g/L、蛋白胨5 g/L、K2PO4·3H2O 1 g/L、FeSO4·7 H2O 0.01 g/L、KCl 0.5 g/L、MgSO4·7 H2O 0.5 g/L，pH 5.5。BMGY培養(yǎng)基：酵母浸出物10 g/L、蛋白胨20 g/L、100 mmol/L磷酸鈉（pH 5.0）、無氨基酵母氮源YNB 13.4 g/L、生物素0.4 mg/L、甘油10 g/L。BMMY培養(yǎng)基：酵母浸出物10 g/L、蛋白胨20 g/L、100 mmol/L磷酸鈉（pH 5.0）、YNB 13.4 g/L、生物素0.4 mg/L、體積分?jǐn)?shù)1%甲醇。

藍(lán)色右旋糖酐T-2000平板：藍(lán)色右旋糖酐20 g/L、YNB 13.4 g/L、生物素0.4 mg/L，在倒置的皿蓋上加入1%（相對于固體培養(yǎng)基體積）甲醇。

1.3 方法

1.3.1 菌株培養(yǎng)

棘孢青霉培養(yǎng)：PDA平板連續(xù)活化棘孢青霉菌株，單菌落接種至棘孢青霉誘導(dǎo)培養(yǎng)基中（50 mL/250 mL錐形瓶），30 ℃，250 r/min培養(yǎng)5 d。

大腸桿菌培養(yǎng)：將大腸桿菌接入50 mL LLB培養(yǎng)基中于37 ℃、220 r/min培養(yǎng)24 h。

畢赤酵母培養(yǎng)：將重組菌單菌落接入30 mL YPD培養(yǎng)基中，30 ℃、250 r/min培養(yǎng)過夜至OD600nm值為5，然后以體積分?jǐn)?shù)1%接種量轉(zhuǎn)接至50 mL BMGY培養(yǎng)基中去葡萄糖抑制，30 ℃、250 r/min培養(yǎng)至OD600nm值為4～6時(shí)，離心，BMMY重懸菌體，25 ℃、250 r/min培養(yǎng)，每24 h添加甲醇至終體積分?jǐn)?shù)1%誘導(dǎo)產(chǎn)酶。

1.3.2 酶活力和總蛋白的測定

右旋糖酐酶活力測定采用還原糖測定方法——DNS法[17]：發(fā)酵液于4 ℃、8 000 r/min離心5 min，棄沉淀，上清液稀釋一定倍數(shù)。將4 mL 0.02 mol/L pH 5.0的醋酸鹽緩沖液配制的3%右旋糖酐T70溶液置于35 ℃保溫10 min后加入1 mL稀釋的酶液，保溫1 h后，取樣500 μL，與375 μL DNS混合，沸水浴5 min，冷卻至室溫定容至終體積5.375 mL。滅活的酶液作為對照組，每分鐘產(chǎn)生1 μmol還原糖所需的酶量定義為一個(gè)酶活力單位（U）。

總蛋白測定：利用Bradford法[18]測定蛋白含量，以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)繪制蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線。將1 mL發(fā)酵液與4 mL考馬斯亮藍(lán)G250在常溫下反應(yīng)10 min后，在595 nm波長下測定吸光度，計(jì)算蛋白含量。

1.3.3 dex基因合成

活化培養(yǎng)棘孢青霉菌，離心收集菌體，無菌水洗滌，液氮研磨，試劑盒提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成第1鏈DNA，根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中已知的右旋糖酐酶基因序列進(jìn)行分析，以朱黃青霉HI-4（GenBank號L41562.1）編碼序列為模板，設(shè)計(jì)特異性上游引物F、下游引物R（表1），以第1鏈DNA為模板進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）特異性擴(kuò)增，得到雙鏈DNA片段，即dex基因序列，通過T克隆與pMD18-T載體連接，熱擊轉(zhuǎn)入E. coli DH5α中，藍(lán)白斑篩選獲得陽性克隆子，測序獲得棘孢青霉右旋糖酐酶基因序列，并將序列提交至GenBank。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences used in this study

1.3.4 右旋糖酐酶密碼子優(yōu)化

利用軟件Gene Designer對棘孢青霉右旋糖酐酶基因dex進(jìn)行密碼子優(yōu)化，通過同義密碼子替換的方式調(diào)整目的基因GC相對含量以及密碼子偏好指數(shù)，序列文件送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行全基因合成。

1.3.5 重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建

根據(jù)右旋糖酐酶序列文件設(shè)計(jì)合成引物（表1），分別在上下游引物中添加EcoRI以及NotI位點(diǎn)（下劃線表示），并在上游引物中引入Kozark序列（加粗部分）。PCR分別擴(kuò)增dex、opt-dex序列后通過雙酶切的方式與載體pPICZαA連接，42 ℃熱擊將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入E. coli DH5α中，在含有博來霉素抗性的LLB平板上篩選重組質(zhì)粒，PCR以及雙酶切鑒定陽性克隆并測序。

1.3.6 重組畢赤酵母構(gòu)建及表達(dá)

SacI線性化重組質(zhì)粒后轉(zhuǎn)入畢赤酵母X33中，通過高質(zhì)量濃度博來霉素（100、200、300、400、500 μg/mL）連續(xù)篩選，然后將篩選獲得的單克隆點(diǎn)種在藍(lán)色右旋糖酐T-2000平板進(jìn)行特異性篩選，陽性菌落能夠分泌產(chǎn)生右旋糖酐酶水解藍(lán)色右旋糖酐T-2000，在單菌落周圍形成透明圈。選取能產(chǎn)生水解圈的單克隆進(jìn)行搖瓶表達(dá)，并根據(jù)1.3.2節(jié)測定誘導(dǎo)發(fā)酵96 h的重組酶活力，篩選產(chǎn)酶能力高的重組酵母菌株。

1.3.7 重組右旋糖酐酶分離純化

將500 mL發(fā)酵粗酶液與500 mL冰預(yù)冷丙酮混合，4 ℃靜置10 min，8 000 r/min離心15 min棄上清液，用冰預(yù)冷丙酮洗滌3 次后，取10 mL 0.02 mol/L pH 5.0醋酸鹽緩沖液溶解沉淀，粗酶液濃縮50 倍。將10 mL濃縮液與磁珠混合，在磁場作用下實(shí)現(xiàn)目標(biāo)蛋白與鎳離子的結(jié)合、雜蛋白洗脫以及目標(biāo)蛋白的分離，獲得較高純度的重組右旋糖酐酶，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）檢驗(yàn)純化效果。

1.3.8 重組右旋糖酐酶酶學(xué)性質(zhì)測定

在15～70 ℃分別測定重組右旋糖酐酶活力，考察重組酶的最適反應(yīng)溫度，并在梯度溫度下保溫1 h考察重組酶熱穩(wěn)定性，以酶活力最高為100%，計(jì)算相對酶活力；配制pH 2～9的緩沖液，測定不同pH值環(huán)境中重組右旋糖酐酶活力，考察重組酶最適反應(yīng)pH值，并在梯度pH值條件下孵育1 h后考察重組酶的pH值耐受性，以酶活力最高為100%，計(jì)算相對酶活力。

選擇含有不同鍵型的多糖，測定不同底物催化條件下的重組酶活力，考察重組右旋糖酐酶的底物特異性。然后選擇重組右旋糖酐酶的最適反應(yīng)底物，配制成不同濃度的底物溶液，測定重組右旋糖酐酶反應(yīng)初速率，計(jì)算得到重組酶的米氏常數(shù)Km值和最大反應(yīng)速率vmax。

1.3.9 搖瓶優(yōu)化單因素試驗(yàn)

為進(jìn)一步提高畢赤酵母分泌表達(dá)外源蛋白能力，對畢赤酵母搖瓶發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，基本培養(yǎng)條件同1.3.1節(jié)?？疾烀?4 h添加甲醇至終體積分?jǐn)?shù)為0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3.0%時(shí)重組酵母產(chǎn)酶能力；考察搖瓶裝液量為25、50、100、150、200 mL/500 mL時(shí)重組酵母產(chǎn)酶能力；考察培養(yǎng)基pH 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0時(shí)重組菌產(chǎn)酶能力；考察誘導(dǎo)溫度為20、25、30 ℃時(shí)重組酵母菌產(chǎn)酶能力；接著優(yōu)化非離子表面活性劑吐溫-80、吐溫-20及其不同添加量對重組酵母產(chǎn)酶影響；優(yōu)化碳源種類山梨醇、甘油及其添加量對重組菌產(chǎn)酶能力的影響。實(shí)驗(yàn)均做3 個(gè)平行，標(biāo)準(zhǔn)差在圖中以誤差線標(biāo)示。

2 結(jié)果與分析

2.1 dex基因合成結(jié)果

提取棘孢青霉總RNA，如圖1A所示，獲得28S、18S的rRNA條帶，無明顯拖尾現(xiàn)象，說明總RNA質(zhì)量良好。再以總RNA中的mRNA為模板反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，PCR擴(kuò)增得到右旋糖酐酶基因dex，如圖1B所示，基因長度為1 866 bp。

圖1 棘孢青霉右旋糖酐酶基因電泳圖Fig. 1 Agarose gel electrophoresis of the Penicillium aculeatum gene encoding dextranase

2.2 基因密碼子優(yōu)化

表2 棘孢青霉右旋糖酐酶基因優(yōu)化前后密碼子使用頻率Table 2 Codon usage frequency of dex and opt-dex in Pichia pastoris

通過同義突變，將在畢赤酵母中利用的低頻密碼子替換成高頻密碼子，右旋糖酐酶基因序列優(yōu)化前后密碼子分布如表2所示，例如編碼Ala的GCG密碼子在畢赤酵母中使用頻率極低，僅6.1%，因此優(yōu)化后的右旋糖酐酶序列中不再使用GCG編碼Ala，采用酵母偏好性較高的GCT進(jìn)行編碼。再綜合考慮基因序列的GC相對含量、酶切位點(diǎn)、不穩(wěn)定序列等因素，優(yōu)化后的基因序列的密碼子偏好指數(shù)從原始序列的0.65調(diào)整至0.92（密碼子偏好指數(shù)在0.8～1.0之間更有利于外源蛋白的表達(dá)），序列GC相對含量從49.4%降至38.3%，去除了原始序列中的TAAAT不穩(wěn)定序列。

2.3 重組畢赤酵母構(gòu)建及表達(dá)結(jié)果

分別將dex與opt-dex基因與表達(dá)質(zhì)粒載體pPICZαA連接，SacI線性化后電擊轉(zhuǎn)化至畢赤酵母X33基因組中，藍(lán)色右旋糖酐平板篩選結(jié)果如圖2所示，圖2A、2B分別表示密碼優(yōu)化后opt-dex以及密碼子優(yōu)化前dex序列在畢赤酵母中的表達(dá)情況。并且圖2A顯示甲醇誘導(dǎo)24 h后的情況，圖2B表示甲醇誘導(dǎo)72 h后才出現(xiàn)微弱的水解圈，可以初步判斷密碼子opt-dex序列在畢赤酵母中具有更高的右旋糖酐酶表達(dá)能力。

進(jìn)一步選擇圖2A中水解圈較明顯的A1、A3、A5、A6、A7、A10以及圖2B中唯一的陽性菌落B13進(jìn)行搖瓶表達(dá)，結(jié)果如圖3所示，B13的表達(dá)能力明顯低于A組菌株。其中A組中A5具有較高產(chǎn)酶活力，在搖瓶的表達(dá)酶活力達(dá)到89.56 U/mL，選擇該菌株進(jìn)行后續(xù)研究。

圖2 陽性克隆子篩選Fig. 2 Selection of positive transformants

圖3 轉(zhuǎn)化子的搖瓶發(fā)酵篩選Fig. 3 Selection of transformants producing dextranase by shake flask fermentation

2.4 重組右旋糖酐酶分離純化結(jié)果

發(fā)酵粗酶液經(jīng)濃縮后如圖4A所示，樣品中含有大量的雜蛋白條帶以及其他雜質(zhì)成分，以至于對其他泳道造成了嚴(yán)重的擠壓。磁珠純化后的重組右旋糖酐酶如圖4B所示，目標(biāo)條帶單一，說明純化后的酶液具有較高純度。SDS-PAGE同時(shí)也表明重組右旋糖酐酶大小為65 kDa，與理論蛋白大小符合。

圖4 重組右旋糖酐酶純化結(jié)果Fig. 4 SDS-PAGE analysis of purified recombinant dextranase

2.5 重組右旋糖酐酶酶學(xué)性質(zhì)分析

2.5.1 重組右旋糖酐酶最適催化條件及穩(wěn)定性

如圖5A所示，重組右旋糖酐酶最適催化溫度為35 ℃，隨著溫度升高酶活力逐漸降低，但在70 ℃的高溫條件下進(jìn)行催化反應(yīng)仍然能夠表現(xiàn)出40%的剩余酶活力。與天然棘孢青霉右旋糖酐酶相比較[16]，具有相同的最適催化溫度，以及相似的對高溫和低溫的酶活力響應(yīng)趨勢。但是在溫度穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)中，天然酶在45 ℃中保存1 h仍然保留95.67%的酶活力，而重組酶在45 ℃保溫1 h剩余酶活力僅為75%，并且在50 ℃保溫1 h后重組右旋糖酐酶剩余酶活力降低至46%，而天然酶剩余活力在80%以上[16]。說明經(jīng)過酵母表達(dá)的重組右旋糖酐酶在溫度穩(wěn)定性上與天然酶相比有一定程度的降低。

對重組右旋糖酐酶的最適催化pH值考察，結(jié)果如圖5B所示，發(fā)現(xiàn)其最適催化pH值為5.0，當(dāng)pH值大于5.0時(shí)，酶活力迅速降低，當(dāng)pH值升高到9.0時(shí)，重組右旋糖酐酶幾乎全部失活。重組右旋糖酐酶在pH 4.0～7.0緩沖液中孵育1 h后能夠保留80%以上的酶活力。重組酶的最適催化pH值以及在不同pH值條件下的穩(wěn)定性與天然棘孢青霉右旋糖酐酶一致[16]。

圖5 重組右旋糖酐酶酶學(xué)性質(zhì)Fig. 5 Enzymatic properties of the recombinant dextranase

2.5.2 重組右旋糖酐酶底物特異性

由表3可知，將重組右旋糖酐酶作用于不同的糖類底物，發(fā)現(xiàn)了與天然右旋糖酐酶相同的底物特異性，即專一性作用于α-1,6糖苷鍵，不作用于β-1,4、β-1,2以及α-1,2等其他糖苷鍵型。以右旋糖酐T70為底物，配制0.1%～1.0%的底物溶液，計(jì)算得到重組右旋糖酐酶的Km為87.56 μmol/L，vmax為428.02 μmol/（min·mg）。

2.6 搖瓶水平重組酵母發(fā)酵條件優(yōu)化結(jié)果

發(fā)酵培養(yǎng)環(huán)境對酵母分泌表達(dá)能力具有很大的影響[19]，因此可以嘗試通過改善酵母的發(fā)酵條件提高酵母分泌表達(dá)外源蛋白的能力。首先對重組酵母發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵pH值、誘導(dǎo)劑添加量、表面活性劑含量、碳源添加量、裝液量等參數(shù)進(jìn)行單因素優(yōu)化。結(jié)果表明單因素優(yōu)化后的培養(yǎng)條件使重組酶活力提高了2.6 倍，從初始的89.56 U/mL提高到了240.74 U/mL，總蛋白質(zhì)量濃度為0.068 mg/mL。

在重組畢赤酵母中甲醇誘導(dǎo)AOX1啟動子表達(dá)重組右旋糖酐酶，如圖6A所示，當(dāng)甲醇添加量為1.0%（每24 h）時(shí)重組酶活力達(dá)到122 U/mL。高于1.0%（每24 h）時(shí)，隨著甲醇添加量的增加，酶活力逐漸降低。通過搖瓶中的裝液量控制通氣量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6B所示，500 mL錐形瓶中裝液量為25 mL、50 mL時(shí)產(chǎn)酶量相當(dāng)，以50 mL時(shí)為最佳。發(fā)酵pH值優(yōu)化結(jié)果如圖6C所示，當(dāng)pH 5.0時(shí)酶活力最高，酸性堿性環(huán)境下產(chǎn)酶量急劇降低。低溫發(fā)酵能夠降低中性蛋白酶對目標(biāo)外源蛋白的降解，促進(jìn)新生肽的折疊，提高目標(biāo)蛋白的穩(wěn)定性，以及減輕發(fā)酵過程的氧氣壓力[20-21]。在20、25、30 ℃三個(gè)溫度梯度下考察右旋糖酐酶活力，如圖6D所示，25 ℃時(shí)重組右旋糖酐酶活力為30 ℃時(shí)的1.6 倍。20 ℃發(fā)酵120 h酶活力與25 ℃發(fā)酵96 h酶活力相當(dāng)，以25 ℃為最佳發(fā)酵溫度。非離子表面活性劑具有增加細(xì)胞壁滲透的作用，從而提高重組酵母的分泌能力[22]。考察吐溫-80、吐溫-20兩種常見的表面活性劑對酵母分泌的影響，如圖6E所示，當(dāng)吐溫-80添加量為4 g/L時(shí)，發(fā)酵上清液的右旋糖酐酶活力增加到230.74 U/mL。在甲醇發(fā)酵誘導(dǎo)階段，甲醇既作為碳源維持酵母生長，又作為誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)外源蛋白的合成[23]。在酵母發(fā)酵過程中以山梨醇或者甘油為協(xié)同底物提供酵母生長所需碳源，以減輕酵母代謝壓力[24-25]。如圖6F所示，以山梨醇作為碳源的效果明顯優(yōu)于甘油，當(dāng)山梨醇添加量為5 g/L時(shí)，重組右旋糖酐酶活力達(dá)到240.74 U/mL。

圖6 重組畢赤酵母發(fā)酵產(chǎn)酶水平的初步搖瓶優(yōu)化Fig. 6 Optimization of shake flask culture of the recombinant P. pastoris for dextranase production

3 討 論

目前已報(bào)道的右旋糖酐酶編碼基因主要來源于青霉菌屬、桿狀菌屬以及鏈球菌屬等，除朱黃青霉外其他青霉來源的右旋糖酐酶基因鮮有報(bào)道。因此通過對棘孢青霉來源的右旋糖酐酶的研究可以加深對青霉屬右旋糖酐酶的認(rèn)識。朱黃青霉右旋糖酐酶的最適催化溫度為55 ℃，高于天然棘孢青霉酶右旋糖酐酶的35 ℃，但其熱穩(wěn)定性差，在50 ℃條件下保溫15 min酶活力損失50%以上[9]，而棘孢青霉右旋糖酐酶在50 ℃保溫1 h后仍然能保留80%以上的酶活力，并且在最適溫度35 ℃條件下保溫2 d后仍然能保留88%的酶活力[16]。細(xì)麗毛殼菌來源的右旋糖酐酶目前已經(jīng)小規(guī)模產(chǎn)業(yè)化，該酶最適催化溫度為60 ℃、pH 5.5，專一性催化斷裂糖酐鏈中連續(xù)的α-1,6糖苷鍵，但該酶液同樣也存在溫度穩(wěn)定性差的現(xiàn)象，65 ℃時(shí)半衰期為10 min，60 ℃時(shí)半衰期為250 min[26]，而棘孢青霉右旋糖酐酶的溫度穩(wěn)定性表明在最適催化溫度條件下保藏24 h后，仍然能保留93.5%的酶活力，10 d后酶活力降至50%，說明與朱黃青霉右旋糖酐酶以及細(xì)麗毛殼菌右旋糖酐酶相比，棘孢青霉右旋糖酐酶雖然具有相對較低的最適催化溫度，但其具有更好的溫度穩(wěn)定性，更加適應(yīng)工業(yè)生產(chǎn)長時(shí)間的催化要求。

以棘孢青霉菌為模板，反轉(zhuǎn)錄合成右旋糖酐酶編碼基因，優(yōu)化序列后在畢赤酵母中進(jìn)行表達(dá)。畢赤酵母分泌表達(dá)的重組右旋糖酐酶最適催化溫度為35 ℃、最適催化pH值為5.0，具有與天然酶相似的催化性質(zhì)。但在溫度穩(wěn)定性上略有降低，類似的情況也出現(xiàn)在斯達(dá)克油脂酵母（Lipomyces starkeyi 1390）來源的右旋糖酐酶基因的異源表達(dá)中，異源表達(dá)的重組右旋糖酐酶最適溫度為30 ℃，低于天然酶的55 ℃，最適pH 4.5，低于天然酶的5.0[27-28]，可能是因?yàn)楫愒幢磉_(dá)過程中不同的表達(dá)體系對蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行了一定程度的修飾，具體原因有待進(jìn)一步深入研究。

在搖瓶水平上對重組酵母的產(chǎn)酶能力進(jìn)行單因素優(yōu)化，優(yōu)化后重組酶活力達(dá)到240.74 U/mL，高于Chen Lin等[27]在5 L發(fā)酵罐獲得83.9 U/mL的重組酶活力，Kang等[7]在10 L的發(fā)酵罐中獲得的134 U/mL的酶活力，低于梁達(dá)奉等[17]在5 L發(fā)酵罐中獲得的1 048 U/mL（誘導(dǎo)型）以及398 U/mL（組成型）重組酶活力，但高于其搖瓶單因素優(yōu)化后的75 U/mL（誘導(dǎo)型）以及60.4 U/mL（組成型）。說明重組棘孢青霉右旋糖酐酶在搖瓶水平的表達(dá)能力達(dá)到國內(nèi)現(xiàn)有水平。但是在搖瓶水平總蛋白質(zhì)量濃度低，僅為0.068 mg/mL，顯著低于Roca等[8]在10 L發(fā)酵罐中表達(dá)的右旋糖酐酶產(chǎn)量。但畢赤酵母是一種適合高密度發(fā)酵的菌株，在發(fā)酵罐中畢赤酵母分泌表達(dá)能力能夠顯著提高，例如里氏木霉Cel5基因在5 L發(fā)酵罐中酶活力相比搖瓶提高了11 倍[29]、雪白根霉在50 L發(fā)酵罐中的酶活力相對于搖瓶發(fā)酵提高了40 倍[30]。所以可期望通過高密度發(fā)酵條件優(yōu)化，進(jìn)一步提高重組畢赤酵母分泌表達(dá)右旋糖酐酶的能力。

以棘孢青霉基因組為模板克隆得到右旋糖酐酶編碼基因，序列優(yōu)化后整合到畢赤酵母X33中，表達(dá)后的右旋糖酐酶具有與天然酶相似的酶學(xué)性質(zhì)，說明重組右旋糖酐酶可以代替天然棘孢青霉右旋糖酐酶直接應(yīng)用于工業(yè)催化制備右旋糖酐。條件優(yōu)化后重組畢赤酵母搖瓶產(chǎn)酶能力達(dá)到240.74 U/mL，達(dá)到國內(nèi)現(xiàn)有搖瓶表達(dá)水平。