黃酒酵母HO基因的敲除及其對黃酒發(fā)酵的影響

白 梅，劉雙平,3,4，毛 健,4，韓 笑,3,4，周志磊,4，鄒慧君，王宗敏,4，姬中偉,4，許正宏*

（1.江南大學生物工程學院，糧食發(fā)酵工藝與技術國家工程實驗室，江蘇 無錫 214122；2.國家黃酒工程技術研究中心，浙江 紹興 312000；3.江蘇省產(chǎn)業(yè)技術研究院食品生物技術研究所，如皋江大食品生物技術研究所有限公司，江蘇 如皋 226500；4.江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122）

釀酒酵母作為一種模式真核生物，便于培養(yǎng)和進行遺傳操作，產(chǎn)醇高，工業(yè)條件耐受性強，為食品安全性微生物[1]。釀酒酵母菌株一般為單倍體或者二倍體，在自然界還存在三倍體。黃酒是中國的特產(chǎn)[2]，其命名主要取決于其大多呈黃色。黃酒作為中國的國酒，是以糯米、小麥、小米等為原料，外加麥曲及酒母作為糖化發(fā)酵劑，經(jīng)過蒸煮、糖化發(fā)酵、過濾澄清、殺菌等一系列工序制備的一種釀造酒。黃酒屬于低度酒，酒度一般在15°左右；其歷史悠久、營養(yǎng)豐富、口感醇厚、飲法多樣，是酒類中為數(shù)不多的保健酒之一；其用途廣泛，可用于烹飪、飲料等市場。

我國各地區(qū)黃酒在釀造工藝上區(qū)別并不是非常明顯，但黃酒在中國的地域性很強，其風味隨著每個生產(chǎn)地區(qū)的不同也表現(xiàn)出相當大的差異，這主要是由于黃酒所特有的口感風味不僅與釀造原料有關系，也與各個生產(chǎn)地區(qū)參與黃酒釀造中的微生物群落有關。傳統(tǒng)黃酒的魅力在于產(chǎn)區(qū)特有的微生物。要釀造出口感醇厚、風味獨特、品質穩(wěn)定的黃酒，就要利用好黃酒釀造過程起作用的微生物，釀酒酵母的乙醇發(fā)酵功能被廣泛應用于包括黃酒在內的酒飲料行業(yè)，其釀造性能的優(yōu)劣直接影響到黃酒的生產(chǎn)與品質[3-6]。本實驗室從工業(yè)黃酒發(fā)酵醪中篩選出一株黃酒酵母11-1并保藏，用其制作酒母，制作黃酒后，監(jiān)測其各項生長和發(fā)酵指標，發(fā)現(xiàn)其發(fā)酵能力較優(yōu)。

對于實驗室用標準二倍體釀酒酵母的孢子產(chǎn)生條件，國內外均有報道。孢子的產(chǎn)生獲得必須要提供適當?shù)漠a(chǎn)孢條件，釀酒酵母的營養(yǎng)體在營養(yǎng)缺乏處于饑餓的條件下，進過減數(shù)分裂由二倍體變?yōu)閱伪扼w，形成子囊[7-11]。已有研究表明，釀酒酵母在麥氏（Mcclary）瓊脂培養(yǎng)基上的產(chǎn)孢量最大，產(chǎn)孢效果最好，馬鈴薯培養(yǎng)基次之，且在培養(yǎng)溫度25 ℃時其產(chǎn)孢效率最高[12-13]。因此，本實驗決定利用最佳產(chǎn)孢培養(yǎng)基Mcclary培養(yǎng)基，在25 ℃對黃酒酵母11-1進行產(chǎn)孢培養(yǎng)，以期得到黃酒酵母11-1單倍體菌株，Huxley等[14]發(fā)現(xiàn)，基于釀酒酵母交配座的差異，可以采用聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）的方法篩選釀酒酵母配型。用可視方法檢測釀酒酵母交配型已有報道[15]，根據(jù)釀酒酵母交配型的穩(wěn)定性可以將菌株分為兩種，即同宗配合型和異宗配合型。異宗配合型菌株的交配型是穩(wěn)定的，而同宗配合型單倍體菌株的交配型不穩(wěn)定，能夠發(fā)生交配型的改變。同宗配合的菌株中帶有活性的HO基因，可以使菌株的交配型發(fā)生變化[16-17]。本實驗室保藏的野生黃酒酵母11-1為二倍體，且HO基因具有活性，其編碼的核酸內切酶在MAT基因座能夠進行特異性的雙鏈切割，使得孢子接合型發(fā)生轉變，進而與周圍的異型孢子進行結合，重新變?yōu)槎扼w。楊華軍等[1]采用過表達HO基因的方法成功獲得了釀酒酵母多倍體，說明HO基因的存在會使酵母的配型發(fā)生轉變。丁文濤[18]也成功改變了釀酒酵母配型，得到了高乙醇產(chǎn)量的釀酒酵母。

李華等[12]在測定菌株的發(fā)酵力實驗中，發(fā)現(xiàn)單倍體菌株的乙醇發(fā)酵力差異較大，推測原因是黃酒酵母的發(fā)酵能力由多個基因控制。影響乙醇發(fā)酵性能的因素很多，單倍體的細胞生長速度比親本二倍體的生長速度稍慢，其發(fā)酵周期也較長。工業(yè)上釀酒酵母大多數(shù)為二倍體，但為了更加方便快速地研究釀酒酵母，實驗中多采用單倍體菌株。本研究通過基因敲除技術敲除HO基因獲得配型穩(wěn)定的單倍體酵母菌株，并通過群體雜交獲得二倍體HO基因缺失型釀酒酵母，并對其發(fā)酵能力進行測定[19-21]。研究HO基因的缺失對黃酒酵母發(fā)酵生產(chǎn)能力的影響，為下一步更方便、簡潔地采用基因手段研究黃酒酵母獨有的代謝特性打下了基礎，且誘導酵母產(chǎn)孢進而獲得單倍體是進行酵母遺傳學和育種工作極為重要的一步，它既是黃酒酵母性狀遺傳所必須的，又可為后續(xù)進行雜交作好親本的準備。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種與質粒

黃酒酵母（菌株編號：11-1），由本實驗室從黃酒酒廠發(fā)酵醪液出篩出并保藏（實驗室資源平臺號：RWBL Y1502）；pSH47-HyBR質粒、pYX212質粒均為實驗室保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基與試劑

Mcclary培養(yǎng)基：葡萄糖0.1%，KCl 0.18%，NaAc 0.82%，酵母膏0.25%，瓊脂2%；pH 7.0。115 ℃滅菌20 min。

YPD培養(yǎng)基：酵母膏1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%，瓊脂2%；pH 7.0。115 ℃滅菌20 min。

潮霉素、G418、LiAc、PEG3350 上海生物工程有限公司；鮭魚精DNA 美國Sigma-Aldrich公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

DYY-6C型電泳儀 北京六一儀器廠；超凈工作臺蘇州富泰潔凈系統(tǒng)有限公司；凝膠成像系統(tǒng) 南京潤亞生物科技發(fā)展有限公司；可見分光光度計 杭州匯爾儀器設備有限公司；三頭梯度PCR儀 江蘇舜天國際集團機械進口股份有限公司；移液器 德國Eppendorf公司；SHP-80型生化培養(yǎng)箱、GRP-9080型隔水式恒溫培養(yǎng)箱 上海森信實驗儀器有限公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鞏義市予華儀器有限責任公司；MICRL17小型離心機 賽默飛世爾科技公司；電子天平 梅特勒-托利多儀器有限公司；恒溫搖床 上海合恒儀器設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 HO基因敲除盒的構建

表1 HO基因敲除所用引物[22]Table 1 Primes used in HO gene knockout

HO基因敲除所用引物見表1，HO基因敲除盒構建步驟如下：1）以質粒pYX212為模板，利用引物KAN-1-FW和KAN-2-RV進行PCR擴增，獲得的PCR產(chǎn)物為loxpKANloxp，以其擴增產(chǎn)物為模板，利用引物KAN-3-FW和KAN-4-RV進行第2輪擴增，得到帶有HO基因互補序列的KANMX。2）以酵母染色體為模板，利用引物HO-1-FW和HO1-1-RV進行PCR擴增，獲得的PCR產(chǎn)物為HOL。3）以酵母染色體為模板，利用引物HO-2-RV和HO2-1-FW進行PCR擴增，獲得的PCR產(chǎn)物為HOR。4）利用重疊PCR技術將上述3 種PCR產(chǎn)物連接起來，得到HOL-KANMX-HOR，即為HO基因敲除盒。

1.3.2 黃酒酵母11-1醋酸鋰轉化

利用LiAc轉化法[23-24]將得到的HO敲除盒轉化進黃酒酵母11-1中，涂布含有G418質量濃度為400 μg/mL的YPD培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)2～5 d。將長出的菌落轉接至含有G418質量濃度為500 μg/mL的YPD培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)2 d后排除沒有生長的假陽性菌落，再轉接至含有G418質量濃度為500 μg/mL的YPD培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)2 d后進行PCR驗證。

1.3.3 G418抗性的刪除

本實驗室保藏的pSH47-HyBR質粒是帶有Cre重組酶基因以及潮霉素B抗性的質粒，將其轉化進重組菌（HO::loxpG418）并表達，即可實現(xiàn)對抗性的刪除，得到HOΔ。

將重組質粒pSH47-HyBR通過醋酸鋰轉化法轉化進入重組菌（HO::loxpG418）感受態(tài)細胞中，轉化后的酵母涂布在含潮霉素B 600 μg/mL的YPD篩選平板上，30 ℃培養(yǎng)2～3 d，挑取轉化子。將轉化子劃線在含潮霉素B 800 μg/mL的YPD平板上培養(yǎng)48 h，挑選轉化子進行菌落PCR驗證[25]。

1.3.4 黃酒酵母單倍體的分離

HO基因敲除后需要對黃酒酵母11-1進行產(chǎn)孢分離，以得到a型和α型單倍體用于后續(xù)基因操作。挑取黃酒酵母11-1 HOΔ單菌落接種于YPD液體培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min過夜培養(yǎng)。用無菌超純水將菌體洗凈，涂布產(chǎn)孢培養(yǎng)基Mcclary，26 ℃培養(yǎng)5～7 d。待酵母菌落長出后刮取至含有蝸牛酶的1.5 mL EP管中，30 ℃水浴60 min。將菌液移至含有少許玻璃珠和10 mL 0.9% NaCl溶液的100 mL三角瓶中，60 ℃水浴10 min后放入30 ℃培養(yǎng)箱200 r/min培養(yǎng)1 h[9-12]。活化結束后將菌體洗滌干凈，稀釋涂布YPD固體培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)48 h，挑取形態(tài)較小的單菌落進行PCR驗證。

1.3.5 二倍體黃酒酵母11-1-HOΔ工程菌的獲得

將兩種接合型（a型和α型）的單倍體菌株分別接種于5 mL的YPD液體培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)24 h，然后各取0.5 mL的上述菌液接種于裝有20 mL YPD液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，30 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)48 h。去除上清液獲得菌體沉淀，用無菌水洗滌2 次后，最終懸浮于10 mL的無菌水中，將懸浮液適當稀釋，取100 μL菌液涂布于YPD平板，30 ℃培養(yǎng)2～5 d待菌落長出。使用引物MAT/MAT-a/MAT-α進行PCR鑒定[26]。

1.3.6 發(fā)酵特性分析[27-30]

采用以下黃酒釀制工藝流程制作黃酒：

關鍵控制點：1）蒸米：置于電磁爐上蒸熟至米里外一致、無白心為止；2）冷卻落缸：將蒸好的米冷卻至室溫，分別按照要求拌入一定量的麥曲、酒母，落料品溫要求在26～28 ℃；3）糖化發(fā)酵：于28～30 ℃前酵5 d，再于14～16 ℃后酵15 d左右；4）壓榨：將發(fā)酵好的糙米酒醪通過真空抽濾器使酒液與酒糟分離；5）煎酒：于92～93 ℃煎酒20～30 min后趁熱灌裝、封壇，即為成品。

分別使用野生黃酒酵母11-1和黃酒酵母11-1-HOΔ作為酒母用于黃酒發(fā)酵。分別取發(fā)酵第24、48、96、360、480小時的樣品，測量黃酒基本理化指標。黃酒發(fā)酵過程中各項指標按照GB/T 13662—2008《黃酒》執(zhí)行。所有實驗數(shù)據(jù)進行3 次測定，運用Origin 9.0軟件進行計算。

2 結果與分析

2.1 黃酒酵母11-1單倍體的獲得

2.1.1 HO基因的敲除

利用HO-1-FW和HO-2-RV引物對，以黃酒酵母11-1染色體作為模板進行PCR擴增，野生型菌株經(jīng)擴增后將得到1 953 bp大小的產(chǎn)物，而HO敲除盒的擴增產(chǎn)物大小為2 632 bp。由圖1可以看到，1號泳道PCR產(chǎn)物在2 000～3 000 bp之間，經(jīng)過多輪擴增，成功得到了HO敲除盒。

圖1 HO敲除盒驗證Fig. 1 Agarose gel electrophoresis of PCR products was used to test the modified HO gene

如方法1.3.2節(jié)描述，采用醋酸鋰轉化法敲除HO基因。PCR鑒定結果如圖2所示。

圖2 黃酒酵母11-1酵母HO基因敲除驗證Fig. 2 Agarose gel electrophoresis of PCR product was used to test the deletion of HO

2.1.2 G418抗性的刪除

由于在構建重組菌黃酒酵母11-1（HO::loxpG418）時引入了G418抗性基因，使得以后在對重組菌黃酒酵母11-1進行基因改造時無法再使用此抗性作為篩選標記，雖然沒有明顯證據(jù)表明該基因的表達會給釀酒酵母的代謝帶來負擔，但抗性基因在酵母中表達的產(chǎn)物并沒有實用價值，造成了抗生素的浪費。因此，在構建敲除盒時即在G418抗性標記的兩端加入了Cre重組酶識別位點loxp，通過表達Cre重組酶可以將敲除盒中的loxpG418刪除。本實驗室保藏的pSH47-HyBR質粒是帶有Cre重組酶基因以及潮霉素B抗性的質粒，將其轉化進重組菌（HO::loxpG418）并表達，即可實現(xiàn)對抗性的刪除，得到HOΔ。

如圖2所示，利用HO-1-FW和HO-2-RV引物對，以黃酒酵母11-1染色體作為模板進行PCR擴增，野生型菌株經(jīng)擴增后得到1 953 bp大小的產(chǎn)物（泳道1），HO敲除盒同源整合到酵母染色體上的擴增產(chǎn)物大小為2 632 bp左右（泳道2），而Cre重組酶將敲除盒上的loxpG418刪除后可以擴增到1 028 bp左右的條帶（泳道3），證明抗性標記基因G418已被成功刪除。

2.1.3 黃酒酵母單倍體的分離及接合型鑒定

以酵母染色體基因組為模板，利用F-FW和A-RV、F-FW和α-RV兩對引物對同時進行PCR擴增。若所擴增酵母為a型單倍體則僅可得到F-FW和A-RV擴增出的544 bp片段，無法得到F-FW和α-RV擴增片段；若所擴增酵母為α型單倍體，則僅可得到F-FW和α-RV擴增出的404 bp片段，無法得到F-FW和A-RV擴增片段；若所擴增酵母為二倍體，則兩對引物對的擴增片段均可獲得。如圖3A所示，泳道2、3驗證的酵母菌為α型單倍體，如圖3B所示，泳道2、3驗證的酵母菌為a型單倍體，由此成功得到了黃酒酵母11-1的a型HOΔ和α型HOΔ單倍體，可用于酵母遺傳學以及其他代謝途徑上的操作。

圖3 黃酒酵母11-1的α型（A）和a型（B）單倍體的PCR驗證Fig. 3 Agarose gel electrophoresis of PCR product was used to test the mating type of haploid S. cereviase strains

2.2 二倍體黃酒酵母11-1-HOΔ工程菌的獲得

2.2.1 二倍體黃酒酵母11-1-HOΔ工程菌的驗證

圖4 二倍體黃酒酵母11-1-HOΔ的PCR驗證Fig. 4 Agarose gel electrophoresis of PCR product was used to test the mating type of diploid S. cereviase strains

采用1.3.5節(jié)方法，將兩種接合型（a型和α型）的單倍體菌株進行群體雜交獲得二倍體黃酒酵母11-1-HOΔ工程菌，長出菌落使用引物MAT/MAT-a/MAT-α進行PCR鑒定，結果見圖4。

2.2.2 二倍體黃酒酵母11-1-HOΔ工程菌的產(chǎn)孢鏡檢結果

圖5 野生型黃酒酵母11-1（A）和 黃酒酵母11-1-HOΔ（B）的生孢鏡檢（10×40）Fig. 5 Microscopic observation of spores of wild (A) and HO disrupted (B) yeasts grown on Mcclaryc plates (10 × 40)

如圖5所示，將黃酒酵母11-1-HOΔ在Mcclary培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，顯微鏡觀察子囊孢子野生型與黃酒酵母11-1-HOΔ并無異常，說明HO基因的缺失對釀酒酵母的生孢能力是沒有影響的。

2.3 黃酒發(fā)酵液特性分析

圖6 黃酒發(fā)酵液理化指標的測定Fig. 6 Physicochemical properties of Chinese rice wine samples fermented by different strains

將野生型黃酒酵母11-1和改造后的黃酒酵母11-1-HOΔ制作酒母，采用黃酒工藝制作黃酒，分別取發(fā)酵第24、48、96、360、480小時的酒樣，對其還原糖、總酸、氨基酸態(tài)氮、乙醇體積分數(shù)進行檢測。如圖6所示，因為黃酒為好氧發(fā)酵，在發(fā)酵前期的時候由于發(fā)酵體系不穩(wěn)定，數(shù)值稍有波動，但到前酵結束黃酒發(fā)酵后期，發(fā)現(xiàn)野生型黃酒酵母11-1和黃酒酵母11-1-HOΔ之間黃酒發(fā)酵液常規(guī)理化指標差異并不大。

3 結 論

本實驗通過用醋酸鋰轉化法敲除黃酒酵母11-1的HO基因，利用Cre/loxp系統(tǒng)除去引進HO敲除基因框所帶進的抗性基因KanMX，獲得不含外源抗性基因且不能發(fā)生接合型轉變的黃酒酵母11-1單倍體菌株（a型和α型），然后通過群體雜交最終得到了二倍體黃酒酵母11-1-HOΔ，根據(jù)實驗結果可知，黃酒酵母11-1野生型酵母菌和黃酒酵母11-1-HOΔ兩者之間的發(fā)酵能力并無差異，HO基因的缺失不會對黃酒發(fā)酵生產(chǎn)過程產(chǎn)生影響。獲得的配型穩(wěn)定的黃酒酵母單倍體菌株可用于后續(xù)的基因改造，研究黃酒酵母的遺傳和代謝特性；同時單倍體菌株具有接合能力，也可進一步雜交育種，獲得性能優(yōu)良的釀酒酵母用于工業(yè)生產(chǎn)中，對維護和提升生產(chǎn)企業(yè)的經(jīng)濟效益具有十分重要的意義。