無(wú)細(xì)胞體系非天然蛋白質(zhì)合成研究進(jìn)展

高偉，卜寧，盧元

?

盧元 清華大學(xué)化學(xué)工程系助理教授、博士生導(dǎo)師。研究的焦點(diǎn)在于發(fā)展和應(yīng)用無(wú)細(xì)胞合成等世界最前沿的技術(shù)，突破天然生命體系的限制，高效合成和精準(zhǔn)改造核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子，以解決生物制造、人類(lèi)與動(dòng)物健康等領(lǐng)域最具挑戰(zhàn)性的科學(xué)與工程難題。目前已在等雜志上發(fā)表30多篇高影響學(xué)術(shù)雜志論文，擁有5項(xiàng)國(guó)際授權(quán)專(zhuān)利、12項(xiàng)國(guó)內(nèi)授權(quán)專(zhuān)利。研究成果得到了相關(guān)領(lǐng)域國(guó)內(nèi)外同行專(zhuān)家的廣泛關(guān)注和高度評(píng)價(jià)，并產(chǎn)生了日益增大的國(guó)際影響力。更多信息請(qǐng)瀏覽課題組網(wǎng)站：http://LuLab.org。

無(wú)細(xì)胞體系非天然蛋白質(zhì)合成研究進(jìn)展

高偉1,2，卜寧2，盧元1

1 清華大學(xué)化學(xué)工程系，北京 100084 2 沈陽(yáng)師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110034

高偉, 卜寧, 盧元. 無(wú)細(xì)胞體系非天然蛋白質(zhì)合成研究進(jìn)展. 生物工程學(xué)報(bào), 2018, 34(9): 1371–1385.Gao W, Bu N, Lu Y. Recent advances in cell-free unnatural protein synthesis. Chin J Biotech, 2018, 34(9): 1371–1385.

無(wú)細(xì)胞非天然蛋白質(zhì)合成作為蛋白質(zhì)研究的新興手段，已成功用于表征蛋白質(zhì)分子間、蛋白質(zhì)與核酸分子間相互作用等基礎(chǔ)科學(xué)研究及醫(yī)藥蛋白、蛋白質(zhì)材料等工業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域。無(wú)細(xì)胞非天然蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)不需維持細(xì)胞的生長(zhǎng)，無(wú)細(xì)胞膜阻礙，可依據(jù)研究目的添加基因元件或化學(xué)物質(zhì)從而增強(qiáng)工程設(shè)計(jì)和過(guò)程調(diào)控的自由性；也可賦予蛋白質(zhì)新的特性、結(jié)構(gòu)及功能，如可實(shí)現(xiàn)蛋白翻譯后修飾、反應(yīng)手柄引入、生物物理探針及多聚蛋白質(zhì)合成等。文中系統(tǒng)地綜述了目前應(yīng)用于無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)中的非天然氨基酸嵌入方法，包括全局抑制及基于正交翻譯體系的終止密碼子抑制、移碼抑制、有義密碼子再分配和非天然堿基等方法的研究進(jìn)展，及非天然氨基酸在蛋白質(zhì)修飾、生物物理探針、酶工程、蛋白質(zhì)材料以及醫(yī)藥蛋白質(zhì)生產(chǎn)等領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)展，并分析了該體系的發(fā)展前景及廣泛工業(yè)化應(yīng)用的機(jī)遇與挑戰(zhàn)。

無(wú)細(xì)胞合成生物學(xué)，蛋白質(zhì)工程，非天然氨基酸，非天然蛋白質(zhì)

蛋白質(zhì)作為重要的生物大分子，是所有生物體維持結(jié)構(gòu)、功能的必需物質(zhì)。自然狀態(tài)下，20種天然氨基酸 (Natural amino acids, NAAs) 可產(chǎn)生結(jié)構(gòu)功能多樣的天然蛋白質(zhì)，但這些天然蛋白質(zhì)已不能滿(mǎn)足蛋白質(zhì)工程及蛋白藥物生產(chǎn)等領(lǐng)域的研究需要，而帶有新型側(cè)鏈基團(tuán)的非天然氨基酸 (Unnatural amino acids, UNAAs)[1]的嵌入可賦予蛋白質(zhì)新的化學(xué)性質(zhì)、結(jié)構(gòu)及功能[2]，打開(kāi)了新蛋白質(zhì)工程的大門(mén)，為生物研究、生物治療學(xué)及合成生物學(xué)提供了新的途徑，已成為這些領(lǐng)域中關(guān)鍵的新興應(yīng)用[3]。在基礎(chǔ)科學(xué)研究領(lǐng)域，將其用于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及動(dòng)力學(xué)研究，利用原核生物無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了真核生物蛋白翻譯后修飾[4]；一些可交聯(lián)的UNAAs已被嵌入蛋白質(zhì)來(lái)表征蛋白質(zhì)之間配體-受體[2]及蛋白質(zhì)與核酸之間的相互作用[5]；增強(qiáng)蛋白質(zhì)的光學(xué)及熱學(xué)穩(wěn)定性，用于構(gòu)建納米開(kāi)關(guān)[1]等。在工業(yè)化生產(chǎn)研究領(lǐng)域，非天然蛋白質(zhì)可作為新型生物高分子材料、蛋白藥物及共價(jià)大分子抑制劑，為材料科學(xué)和醫(yī)藥蛋白的開(kāi)發(fā)與生產(chǎn)創(chuàng)造了新的契機(jī)，如蛋白質(zhì)聚合物[6]、硒蛋白[7]、磷酸化蛋白質(zhì)[8]及抗體-藥物結(jié)合物[9]的合成等。因此，合成嵌入U(xiǎn)NAAs的非天然蛋白質(zhì)是蛋白質(zhì)工程發(fā)展中具有革命性的一步。

探究歷史，非天然蛋白質(zhì)的合成[10]具有里程碑意義的進(jìn)展要追溯到1989年，Schultz團(tuán)隊(duì)首先通過(guò)琥珀抑制的方法將合成的UNAAs嵌入到β-內(nèi)酰胺酶中，并發(fā)現(xiàn)嵌入多種不同UNAAs，可促進(jìn)對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及功能的研究[11]。自此，蛋白質(zhì)中嵌入U(xiǎn)NAAs的方法得到了快速發(fā)展。目前較成熟的方法主要包括兩大類(lèi)，分別是基于天然翻譯體系的全局抑制方法及基于正交翻譯體系 (Orthogonal translation systems, OTSs) 的琥珀抑制、移碼抑制、有義密碼子再分配及非天然堿基對(duì)的嵌入方法[12]。

最初，非天然蛋白質(zhì)主要依托細(xì)胞體系，但需要維持細(xì)胞自身良好的生長(zhǎng)狀態(tài)，以合成目標(biāo)蛋白。由于細(xì)胞內(nèi)代謝通路復(fù)雜，而目標(biāo)蛋白合成途徑非細(xì)胞內(nèi)主反應(yīng)，導(dǎo)致產(chǎn)物產(chǎn)量較低，純化步驟繁瑣；且某些UNAAs不易穿過(guò)細(xì)胞膜屏障進(jìn)入細(xì)胞，并會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生不同程度的毒性，從而降低了細(xì)胞對(duì)UNAAs的利用率，限制UNAAs嵌入效率；同時(shí)，由于細(xì)胞膜的阻礙，反應(yīng)的可調(diào)控性能較差。這些導(dǎo)致體內(nèi)UNAAs的嵌入效率較低，特別是在多位點(diǎn)UNAAs嵌入時(shí)尤為明顯。但隨著無(wú)細(xì)胞蛋白合成系統(tǒng)的出現(xiàn)及日漸成熟[13-15]，無(wú)細(xì)胞非天然蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)(Cell-free unnatural protein synthesis, CFUPS) (圖1) 應(yīng)運(yùn)而生。CFUPS以外源DNA或mRNA為模板，向反應(yīng)體系中添加底物、能量物質(zhì)、多種輔因子和非天然組分，包括OTS中的正交氨酰tRNA合成酶/正交tRNA (o-aaRS/o-tRNA) 對(duì)及UNAAs等，在細(xì)胞提取物提供的多種酶的作用下合成非天然蛋白質(zhì)。其中細(xì)胞提取物來(lái)源已從原核細(xì)胞擴(kuò)大至真核細(xì)胞及哺乳動(dòng)物，包括大腸桿菌[16]、酵母細(xì)胞[17]、小麥胚芽細(xì)胞[18]、昆蟲(chóng)細(xì)胞[19]和兔網(wǎng)織紅細(xì)胞[20]。CFUPS與細(xì)胞非天然蛋白質(zhì)合成相比具有諸多的優(yōu)點(diǎn) (表1)[12-13]：該系統(tǒng)生產(chǎn)周期短，整個(gè)生產(chǎn)過(guò)程僅需1?2 d；無(wú)細(xì)胞膜阻礙，規(guī)避了 UNAAs選擇性問(wèn)題且不會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，利于重新分配遺傳密碼[2]和精細(xì)調(diào)控反應(yīng)進(jìn)程，進(jìn)一步擴(kuò)大蛋白質(zhì)功能[12]。雖然CFUPS已得到極大發(fā)展，但同一條肽鏈上不同UNAAs的多位點(diǎn)嵌入，仍是該領(lǐng)域的瓶頸，在CFUPS和細(xì)胞體系均只能實(shí)現(xiàn)2?3個(gè)位點(diǎn)的嵌入[24-25]；而同一條肽鏈上同種UNAAs的多位點(diǎn)嵌入已取得很大進(jìn)展，均能實(shí)現(xiàn)10個(gè)或10個(gè)以上UNAAs[6,22-23]的嵌入，但CFUPS中非天然蛋白質(zhì)表達(dá)水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于細(xì)胞體系。如Yanagisawa團(tuán)隊(duì)利用CFUPS實(shí)現(xiàn)了單一位點(diǎn)包含BocKme1 (Nε-(叔丁氧羰基)-Nε-甲基-1-賴(lài)氨酸)的人組蛋白H3的高于細(xì)胞體系約10倍的表達(dá)[21]；另外Yanagisawa團(tuán)隊(duì)[21]也對(duì)基于.的細(xì)胞及無(wú)細(xì)胞體系中人組蛋白H3變體的表達(dá)量進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)嵌入2個(gè)BocKme1時(shí)，CFUPS的H3變體表達(dá)量高于細(xì)胞體系約70倍。因此，CFUPS已逐漸成為強(qiáng)大的非天然蛋白質(zhì)合成平臺(tái)，目前已成功從實(shí)驗(yàn)室投入到實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用中，用于抗體-藥物結(jié)合物[9]、潛在的疫苗和顯像劑、裝飾性病毒樣顆粒的生產(chǎn)[26]及酶的開(kāi)發(fā)改造[27]等工業(yè)加工過(guò)程，但目前還未達(dá)到無(wú)細(xì)胞天然蛋白質(zhì)合成的100 L的生產(chǎn)規(guī)模[28]，因此要實(shí)現(xiàn)CFUPS的工廠(chǎng)化應(yīng)用，仍需更多科研工作者的不懈努力。

本文首先介紹了CFUPS中UNAAs的不同嵌入方法，主要包括基于天然翻譯體系的全局抑制方法和基于OTSs的終止密碼子抑制、移碼抑制、有義密碼子再分配和非天然堿基對(duì)方法，以及它們應(yīng)用的優(yōu)勢(shì)及挑戰(zhàn)，接著對(duì)CFUPS的主要應(yīng)用進(jìn)行回顧，最后分析了當(dāng)前CFUPS嵌入方法面臨的挑戰(zhàn)及可能的應(yīng)對(duì)策略。

圖1 無(wú)細(xì)胞非天然蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)

1 無(wú)細(xì)胞體系UNAAs嵌入的方法

CFUPS作為合成生物學(xué)新興的研究手段，已發(fā)展為強(qiáng)大的UNAAs嵌入平臺(tái)，用來(lái)改進(jìn)天然蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)及功能特性[2]。目前，該體系采用的UNAAs嵌入方法主要包括基于天然翻譯體系的全局抑制，以及基于OTSs的終止密碼子抑制、移碼抑制、有義密碼子再分配和非天然堿基對(duì)的方法，本節(jié)會(huì)對(duì)這些方法的發(fā)展應(yīng)用進(jìn)行詳細(xì)論述。

1.1 全局抑制

全局抑制 (Global suppression) 是最早發(fā)展的UNAAs嵌入方法 (圖2 A-a, b)，其利用天然蛋白質(zhì)翻譯體系合成嵌入U(xiǎn)NAAs的非天然蛋白質(zhì)。全局抑制以一種 (或多種) 特定氨基酸的營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株為宿主菌，向反應(yīng)體系中補(bǔ)充菌株所缺陷氨基酸的非天然類(lèi)似物，在天然翻譯機(jī)制的背景下，這種非天然類(lèi)似物即可取代該天然氨基酸的位點(diǎn)，在全局范圍內(nèi)實(shí)現(xiàn)UNAAs嵌入，從而改變蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)及功能 (圖2A)[2]。早在60多年前，Cohen及其同事成功在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)用蛋氨酸類(lèi)似物SeMet全局替代Met[30]。但分子量大或帶電荷的UNAAs很難穿過(guò)細(xì)胞膜屏障，這大大限制了體系對(duì)UNAAs的利用率，且某些UNAAs本身或一定量的累積會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，甚至使細(xì)胞致死[31]。因此研究者們發(fā)展了無(wú)細(xì)胞膜阻礙的CFUPS，在使用CFUPS嵌入U(xiǎn)NAAs時(shí)，首先要制備營(yíng)養(yǎng)缺陷型細(xì)胞的提取物[31]，再添加反應(yīng)所需的NAAs (除去被替換的NAA) 及UNAAs。若未除盡體系中所有將被替換的NAA，即會(huì)引起該種NAA與其非標(biāo)準(zhǔn)類(lèi)似物之間的競(jìng)爭(zhēng)，使UNAAs與NAAs按照兩者的濃度比率嵌入蛋白質(zhì)[12]。Singh-Blom等使用色氨酸枯竭型CFUPS，表達(dá)了具有生物活性的含有色氨酸類(lèi)似物5-氟色氨酸或6-氟色氨酸修飾的鏈霉抗生物素蛋白，且嵌入效率高達(dá)100%[31]，為UNAAs的廣泛嵌入提供了新的可能。全局抑制利用天然翻譯機(jī)制，不需進(jìn)化翻譯組分和改變目標(biāo)蛋白遺傳信息，即可實(shí)現(xiàn)多個(gè)位點(diǎn)一種 (或多種) UNAAs的高效嵌入，且不會(huì)生成截短的蛋白質(zhì)；另外，基于無(wú)細(xì)胞體系的開(kāi)放性和自由性，無(wú)UNAAs的毒性及運(yùn)輸問(wèn)題，可提高體系對(duì)UNAAs的利用效率。但較難實(shí)現(xiàn)位點(diǎn)特異性UNAAs嵌入。

圖2 無(wú)細(xì)胞體系中UNAAs嵌入方法

1.2 終止密碼子抑制

在蛋白質(zhì)工程領(lǐng)域，有時(shí)需要對(duì)一個(gè) (或幾個(gè)) 位點(diǎn)進(jìn)行特定的修飾，以監(jiān)測(cè)及表征蛋白質(zhì)的某些結(jié)構(gòu)及功能特性，但全局抑制無(wú)法實(shí)現(xiàn)UNAAs的位點(diǎn)特異性嵌入，因此研究者們發(fā)展了一套位點(diǎn)特異性嵌入U(xiǎn)NAAs的方法。Schultz及其同事首先在大腸桿菌提取物中，將UNAA嵌入蛋白質(zhì)中被琥珀終止密碼子取代的有義密碼子位點(diǎn)[11]，稱(chēng)為終止密碼子抑制 (Stop codon suppression) 方法 (圖2 B-a)。在天然翻譯體系中，64個(gè)三聯(lián)密碼子中的3個(gè)終止密碼子赭石 (UAA)、乳白 (UGA) 和琥珀 (UAG) 通常不編碼任何氨基酸，而是與釋放因子識(shí)別，終止翻譯過(guò)程。但在某些生物體天然翻譯機(jī)制中，終止密碼子可編碼特定的氨基酸[32]，如詹氏甲烷球菌的終止密碼子 (UAG) 可編碼酪氨酸[33]，研究者們由此發(fā)展了終止密碼子抑制的方法，即用3個(gè)終止密碼子編碼UNAAs，從而合成非天然蛋白質(zhì)[12]。應(yīng)用該方法進(jìn)行UNAAs嵌入?；谡彩霞淄榍蚓腛TS，包括某種UNAA及與其正交的o-tRNA/o-aaRS對(duì)，有時(shí)還包括正交延伸因子 (o-EF-Tu) 及正交核糖體 (o-Ribosome)。為實(shí)現(xiàn)及提高UNAAs嵌入的精準(zhǔn)度，關(guān)鍵的一點(diǎn)是進(jìn)化OTS，使其可不再識(shí)別NAAs，只特異性識(shí)別正交的UNAA[35]。OTSs的正交性越強(qiáng)，NAAs在tRNACUA上的交叉裝載的頻率越低，提高UNAAs嵌入效率[12]。但在原核生物中，釋放因子1 (RF1) 會(huì)特異性識(shí)別琥珀密碼子 (UAG)，與o-tRNA產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)，從而產(chǎn)生截短的蛋白質(zhì)，使嵌入效率降低?？紤]到這些因素，Lajoie構(gòu)建了一株將基因組中所有編碼UAG終止密碼子 (321個(gè)TAG)突變成TAA，且敲除基因的重組大腸桿菌，在該菌株中琥珀密碼子與OTS完全正交，并不被本體的翻譯機(jī)制識(shí)別，且不會(huì)產(chǎn)生截短的蛋白質(zhì)，從而進(jìn)一步提高了UNAAs嵌入效率[36]。Hong等在去除RF1重編碼的大腸桿菌CFUPS中成功實(shí)現(xiàn)單位點(diǎn)和多位點(diǎn)對(duì)-炔丙氧基-L-苯丙氨酸 (p- propargyloxy-L-phenylalanine, pPaF) 的嵌入，與含有RF1的CFUPS相比，單一位點(diǎn)嵌入pPaF的超折疊綠色熒光蛋白 (Superfolder green fluorescent protein, sfGFP) 產(chǎn)量高出2.5倍[22]。此外，熱敏RF1突變體的熱失活以及利用抗體抑制RF1已成功應(yīng)用于CFUPS系統(tǒng)[37]。但宿主菌RF1的敲除，通常會(huì)影響細(xì)胞提取物活性，降低CFUPS蛋白產(chǎn)量，限制其廣泛應(yīng)用。而最近，Jewett利用菌株改造工程，以C321.ΔA[36]為出發(fā)菌，構(gòu)建了5種核酸酶 (、、、和)、兩種蛋白酶 (和) 以及8種影響氨基酸、能量和氧化還原穩(wěn)定性的基因 (、、、、、、和) 功能單一或組合失活的重組菌株，建立了RF1敲除的高產(chǎn)CFUPS平臺(tái)，其中，.Δ.粗提物中單位點(diǎn)4-乙?；?L-苯基丙氨酸 (4-Acetyl-L-phenylalanine, pAcF) 嵌入的sfGFP表達(dá)量比通用的BL21 Star (DE3)粗提取物提高92%，高于MCJ.559 (.?A endA csdA(C13: 13 TAG再編碼為T(mén)AA)) 粗提物145%[38]，實(shí)現(xiàn)了高嵌入效率及高非天然蛋白質(zhì)產(chǎn)量的雙重目標(biāo)。終止密碼子抑制在一定程度上擴(kuò)大了生物體遺傳編碼，與重編碼菌株細(xì)胞提取物手段相結(jié)合，可有效提高UNAAs嵌入效率。但終止密碼子數(shù)量有限，導(dǎo)致可嵌入的UNAAs數(shù)量有限，此外，OTSs的正交性也是限制UNAAs嵌入效率的主要因素。因此擴(kuò)大UNAAs的遺傳編碼和進(jìn)化OTSs是提高嵌入效率的必然選擇。

1.3 移碼抑制

為實(shí)現(xiàn)單 (或多) 位點(diǎn)特異性UNAAs嵌入，研究者們發(fā)展了移碼抑制 (Frameshift suppression) (圖2 B-b) 的嵌入方法，擴(kuò)大了UNAAs的密碼子庫(kù)，提高了嵌入效率，也解決了單一蛋白中多個(gè)特異位點(diǎn)UNAAs嵌入問(wèn)題。移碼抑制是基于含有一個(gè)擴(kuò)大的反密碼子環(huán)的移碼抑制tRNA (Frameshift suppressor tRNA) 導(dǎo)致密碼子被超過(guò)3個(gè)核堿基的反密碼子解碼的現(xiàn)象[12]。通過(guò)該方法，四堿基[39]甚至五堿基密碼子[40]已被成功地用于CFUPS中非天然蛋白質(zhì)合成。Hohsaka及其同事在CFUPS中用CGGG四聯(lián)密碼子成功將丹?；翘烊话被?Dansylated non-natural amino acids)嵌入鏈霉親和素，這也是第一次將相對(duì)較大的丹酰化氨基酸嵌入蛋白質(zhì)，且比琥珀抑制具有更高的嵌入效率[41]。此外，該方法適用的細(xì)胞粗提物來(lái)源已從大腸桿菌擴(kuò)展到昆蟲(chóng)[19]和兔網(wǎng)織紅細(xì)胞[42]。通過(guò)使用不同的四聯(lián)密碼子和它們的同源預(yù)氨?；痶RNAs的方法，已將2個(gè)[39]或3個(gè)[43]不同的UNAAs成功嵌入目標(biāo)蛋白。目前移碼抑制的密碼子也擴(kuò)展至五聯(lián)密碼子，Hohsaka等在大腸桿菌CFUPS中使用五聯(lián)密碼子CGGUA，并添加預(yù)氨?；膖RNAUACCG，成功在鏈霉菌抗生物素蛋白mRNA的Tyr54位點(diǎn)嵌入對(duì)-硝基苯丙氨酸(p-nitrophenylalanine, nitroPhe)，產(chǎn)生了全長(zhǎng)的鏈霉菌抗生物素蛋白，且CGGN1N2(N表示任意核糖核苷酸) 的另外15個(gè)密碼子也被其互補(bǔ)的預(yù)化學(xué)?；囊拼a抑制tRNA成功解碼[40]。盡管移碼抑制已很大程度擴(kuò)展了UNAAs的遺傳編碼，但天然核糖體識(shí)別四聯(lián)或五聯(lián)反密碼子tRNA的能力有限，解碼效率不高，同時(shí)可能會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)組的錯(cuò)讀與蛋白質(zhì)的錯(cuò)誤合成，產(chǎn)生截短的蛋白質(zhì)，因此需要對(duì)天然的核糖體進(jìn)行改造，使它朝著更有效解碼四聯(lián)體密碼子的方向進(jìn)化[44]。

表1 無(wú)細(xì)胞及細(xì)胞非天然蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)比較

a: refers to the expression of human histone H3 with single BocK36me1 in.-based and cell-free unnatural protein synthesis system[21].

1.4 有義密碼子再分配

鑒于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性和tRNA反密碼子對(duì)密碼子識(shí)別的擺動(dòng)性，30–40個(gè)有義密碼子足以編碼生物體的遺傳信息，因此，超過(guò)20個(gè)有義密碼子是潛在的可重新分配的密碼子[45]，這種為有義密碼子重新分配其他NAAS (或UNAAs) 的方法即為有義密碼子再分配 (圖2 B-c)，目前使用該方法已成功將150多種UNAAs嵌入蛋白質(zhì)中[44]。如在酵母線(xiàn)粒體中將CUN密碼子 (N代表A、U、G、C) 從編碼亮氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)榫幋a蘇氨酸[45]，這種重編碼也需要突變新的正交tRNA/aaRS對(duì)。而CFUPS在遺傳密碼再分配領(lǐng)域具有一定優(yōu)勢(shì)，純化組分[46]和天然tRNAs缺失的細(xì)胞粗提物的無(wú)細(xì)胞翻譯系統(tǒng)[47]，均可選擇性地提供純化的tRNAs，從而基本上創(chuàng)建一個(gè)可自定義遺傳密碼的平臺(tái)，其中選中的密碼子保留“空白”以重新分配UNAAs[48]。Iwane等[49]構(gòu)建了含有32個(gè)tRNASNN(S = G或C) 的體外轉(zhuǎn)錄物的CFUPS，利用預(yù)先裝載UNAAs的tRNASNNs代替可裝載NAAs的冗余tRNASNNs，實(shí)現(xiàn)了3個(gè)冗余密碼子的再分配，并成功表達(dá)了由20個(gè)NAAs和3個(gè)UNAAs組成的線(xiàn)性肽的32聚體。或者，Terasaka等突變50S核糖體亞基的肽基轉(zhuǎn)移酶中心位點(diǎn)，消除其利用某些天然tRNAs進(jìn)行翻譯的能力[50]。將這種核糖體與含補(bǔ)償位點(diǎn)突變的tRNA一起使用，可進(jìn)行遺傳密碼重編碼，為遺傳密碼重寫(xiě)和非天然蛋白質(zhì)合成提供潛在新策略。

1.5 非天然堿基對(duì)

上述的UNAAs嵌入方法均依賴(lài)于天然堿基組成的密碼子-反密碼子相互作用，使用無(wú)義抑制tRNA[51]或四聯(lián)抑制tRNA[52]嵌入U(xiǎn)NAAs，但是天然堿基數(shù)量有限，使這些方法在多種不同的UNAAs嵌入蛋白質(zhì)的效率受到限制，且翻譯過(guò)程中抑制tRNA與釋放因子或天然tRNA之間的競(jìng)爭(zhēng)也會(huì)降低UNAAs嵌入效率[53]。在這些方面，使用非天然堿基對(duì)(Unnatural base-pairs，UBPs) (圖2 B-d) 擴(kuò)大UNAAs的遺傳編碼更有優(yōu)勢(shì)[18]，UBPs是人工設(shè)計(jì)合成的可行使或模擬天然核酸功能、而又具有相對(duì)獨(dú)立性的人造堿基對(duì)，在翻譯過(guò)程中，可將UNAAs分配給含有非天然堿基的額外密碼子[18]在蛋白特定位點(diǎn)嵌入U(xiǎn)NAAs。Bain研究組成功實(shí)現(xiàn)了非天然堿基對(duì)isoG-isoC的DNA的體外復(fù)制和轉(zhuǎn)錄[54]，并借助人工合成含有反密碼子 CU(isoG)的tRNA，在體外翻譯系統(tǒng)中成功將3-碘化酪氨酸嵌入到一段小肽中[55]。Hirao開(kāi)發(fā)了2-氨基-6-(2-噻吩基) 嘌呤 (用s表示) 和吡啶-2-酮 (用y表示) 的UBPs (s-y)，該UBPs可通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (Polymerase chain reaction, PCR) 嵌入DNA或RNA的特異位點(diǎn)，可在T7轉(zhuǎn)錄的大腸桿菌CFUPS中將3-氯酪氨酸 (3-chlorotyrosine) 嵌入到人Ras蛋白的32位點(diǎn)[18]。Romesberg 團(tuán)隊(duì)發(fā)展出了一對(duì)較為優(yōu)異的非天然堿基對(duì)dNaM-dTPT3[54]，其復(fù)制的保真性已基本接近天然堿基[56]。但非天然堿基有時(shí)結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，會(huì)在異構(gòu)體間相互轉(zhuǎn)換，且某些在復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過(guò)程中仍有較低保真性[57]，導(dǎo)致正確的模板數(shù)量較少，從而影響UNAAs嵌入效率，因此，提高UBPs本身的化學(xué)穩(wěn)定性及其與模板復(fù)制、轉(zhuǎn)錄及翻譯過(guò)程中各組分的正交性尤為重要[58]。

2 正交翻譯體系優(yōu)化

迄今，通過(guò)OTSs嵌入到目標(biāo)蛋白中的UNAAs已達(dá)150余種，在蛋白質(zhì)的標(biāo)記、穩(wěn)定性改變、定位監(jiān)測(cè)、酶活性提高及細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)等方面有著廣泛的應(yīng)用[44]。OTSs包括某種UNAA及與其正交的o-tRNA/o-aaRS對(duì)、延伸因子及核糖體。為提高嵌入效率，必須確保這些組分與宿主翻譯機(jī)器的正交性 (指o-tRNA不攜帶任何NAAs；o-aaRS不能氨酰化任何內(nèi)源性tRNAs；o-aaRS不能接受任何NAAs作為底物)，o-tRNA/o-aaRS對(duì)通常來(lái)源于親緣關(guān)系遙遠(yuǎn)的生物[59]，通過(guò)定向進(jìn)化以改善其與UNAAs的兼容性，實(shí)現(xiàn)特異位點(diǎn)嵌入。而進(jìn)化的o-aaRS?；钚酝ǔ５陀谄涮烊蛔嫦?，非天然蛋白質(zhì)的合成可基于OTSs，使用終止密碼子抑制、移碼抑制、有義密碼子再分配和非天然堿基對(duì)的方法在特異位點(diǎn)高效嵌入U(xiǎn)NAAs。因?yàn)镃FUPS與OTSs的兼容性要明顯優(yōu)于細(xì)胞系統(tǒng)，所以正交翻譯方法通常應(yīng)用在無(wú)細(xì)胞非天然蛋白質(zhì)合成體系中。但與其天然祖先相比，工程化的o-aaRSs通常表現(xiàn)出較低的?；钚?，尤其是對(duì)非同源抑制tRNA[45,60-61]，而CFUPS的開(kāi)放環(huán)境允許定量添加純化的o-aaRS、o-tRNA和UNAAs，可通過(guò)調(diào)整正交翻譯組分濃度來(lái)提高UNAAs嵌入效率；在真核CFUPS中添加大腸桿菌來(lái)源的OTSs時(shí)，增加Mg2+濃度有助于UNAAs嵌入[62]。此外，細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中o-aaRS和o-tRNA的過(guò)表達(dá)及UNAAs的補(bǔ)充常導(dǎo)致細(xì)胞毒性，而CFUPS不需依賴(lài)完整的活細(xì)胞，也就規(guī)避了這一問(wèn)題，可優(yōu)先高效合成嵌入U(xiǎn)NAAs的非天然蛋白質(zhì)，甚至難溶性蛋白質(zhì)[5]。

雖然目前OTSs在CFUPS中已得到了很好的應(yīng)用，但由于正交翻譯組分在不同嵌入方法間的適應(yīng)性不同，為提高UNAAs嵌入效率，需更有效進(jìn)化包括o-aaRSs、o-tRNAs、核糖體及EF-Tu在內(nèi)的OTSs。首先需開(kāi)發(fā)更有效的o-aaRS/o-tRNA進(jìn)化篩選及表達(dá)優(yōu)化平臺(tái)，提高o-aaRS與o-tRNA的正交性和表達(dá)水平，以提高非天然蛋白質(zhì)產(chǎn)量[45]。另外，終止密碼子抑制中，需提高抑制tRNA與終止密碼子的識(shí)別效率，抑制或去除RF1與終止密碼子的識(shí)別，提高抑制tRNA的通讀效率[23]。移碼抑制中，可進(jìn)化核糖體的16S rRNA及模板鏈上的核糖體結(jié)合位點(diǎn)，以提高對(duì)四聯(lián)或五聯(lián)密碼子的解碼效率，避免出現(xiàn)蛋白質(zhì)組錯(cuò)讀的現(xiàn)象[63]。為進(jìn)一步提高有義密碼子再分配UNAAs的嵌入效率，可尋找并利用具有開(kāi)放密碼子 (基因組中未使用的密碼子) 的天然物種或創(chuàng)建合成生物體，還可開(kāi)發(fā)有義密碼子重新分配篩選方法來(lái)測(cè)試o-tRNA/o-aaRS對(duì)的正交性，以開(kāi)發(fā)出正交性強(qiáng)或完全正交的o-tRNA/o-aaRS對(duì)[45]。使用UBPs時(shí)，由于非天然堿基對(duì)本身結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，因此，提高非天然堿基對(duì)穩(wěn)定性及其與模板復(fù)制、轉(zhuǎn)錄及翻譯過(guò)程中各組分的正交性是提高UNAAs嵌入效率的主要途徑。這些優(yōu)化將是非天然蛋白質(zhì)合成領(lǐng)域的重大進(jìn)步，也將為基于正交翻譯體系CFUPS創(chuàng)造更廣闊的應(yīng)用前景。

3 無(wú)細(xì)胞合成非天然蛋白質(zhì)的應(yīng)用

3.1 蛋白質(zhì)修飾

蛋白質(zhì)位點(diǎn)特異性修飾 (圖3) 是蛋白質(zhì)標(biāo)記和選擇性添加結(jié)構(gòu)元素的基本技術(shù)，已經(jīng)成為探測(cè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能以及產(chǎn)生具有增強(qiáng)的或新的特性蛋白質(zhì)的有力工具。蛋白質(zhì)修飾的理想狀態(tài)是獲得均一的同質(zhì)混合物，但通常的偶聯(lián)反應(yīng)涉及用親電試劑修飾賴(lài)氨酸、半胱氨酸或絲氨酸的親核側(cè)鏈[64]，通常會(huì)產(chǎn)生不同性質(zhì)蛋白質(zhì)綴合物的異質(zhì)混合物；另外，也可通過(guò)酶催化的生物反應(yīng)或化學(xué)反應(yīng)用化學(xué)標(biāo)簽[65]修飾特定多肽序列，或用半合成方法表達(dá)蛋白質(zhì)連接 (Expressed protein ligation, EPL)[66]，將正交化學(xué)反應(yīng)官能團(tuán)引入蛋白質(zhì)中，以精確控制結(jié)合位點(diǎn)和化學(xué)計(jì)量比，但后續(xù)處理過(guò)程較復(fù)雜。而CFUPS平臺(tái)的應(yīng)用可基本解決這些問(wèn)題。將含有酮基、疊氮基、炔基和磷酸基等正交化學(xué)反應(yīng)性側(cè)鏈的UNAAs嵌入蛋白質(zhì)的特異位點(diǎn)，可合成結(jié)構(gòu)明確的蛋白質(zhì)綴合物[4]，除實(shí)現(xiàn)對(duì)結(jié)合位點(diǎn)和反應(yīng)化學(xué)計(jì)量比的精確控制外，也可優(yōu)化蛋白質(zhì)綴合物的物理和生物學(xué)性質(zhì)[59]，是一種極具吸引力的蛋白質(zhì)修飾方式。如Ohno基于大腸桿菌CFUPS，將酵母琥珀抑制tRNATyr/突變的酪氨酰-tRNA合成酶對(duì)作為3-疊氮基酪氨酸(3-azidotyrosine) 的載體，以大鼠鈣調(diào)蛋白(CaM) 為模型蛋白，分別獲得了在72、78、80或100氨基酸位點(diǎn)處攜帶疊氮基酪氨酸的幾個(gè)非天然CaM分子，用三芳基膦和生物素的綴合化合物對(duì)這些蛋白進(jìn)行翻譯后修飾，產(chǎn)生了位點(diǎn)選擇性生物素化的CaM分子[67]。

圖3 CFUPS中UNAAs應(yīng)用

另外，應(yīng)用UNAAs對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行翻譯后修飾 (Post-translational modifications, PTMs)，也是UNAAs在蛋白質(zhì)修飾方面的一個(gè)重要應(yīng)用。天然存在的PTMs會(huì)影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定及功能，有時(shí)也會(huì)對(duì)相應(yīng)修飾蛋白的定位及相互作用產(chǎn)生影響，此外，不同PTMs信號(hào)之間會(huì)相互干擾，導(dǎo)致每種PTMs不能執(zhí)行其特定的功能[68]，而應(yīng)用CFUPS嵌入U(xiǎn)NAAs可作為這種問(wèn)題的有效解決手段[12]。這種方法可將同質(zhì)天然PTMs模擬物嵌入蛋白質(zhì)中，對(duì)藥物蛋白質(zhì)的生產(chǎn)來(lái)講，可規(guī)避細(xì)胞體系常伴隨著的批次間的變化，如通過(guò)CFUPS將特定的PTMs (例如單糖基化和二糖基化的UNAAs) 共翻譯成蛋白質(zhì)[69]；或引入具有反應(yīng)性手柄的UNAAs，對(duì)已合成的蛋白質(zhì)進(jìn)行翻譯后修飾，如磷酸酪氨酸類(lèi)似物[70-71]等。

3.2 蛋白質(zhì)中的UNAAs探針

UNAAs作為高靈敏度的生物物理探針 (圖3)，可結(jié)合到重組蛋白質(zhì)的特定位點(diǎn)，用于目標(biāo)蛋白質(zhì)的定量檢測(cè)及結(jié)構(gòu)和功能的精確分析[31,72]。由于在細(xì)胞提取物制備過(guò)程中損害了細(xì)胞本身的氨基酸代謝途徑，并且可以使用特異性抑制劑，使同位素標(biāo)記的干擾最小化[73]；也可經(jīng)過(guò)透析，去除部分內(nèi)源的氨基酸，以減少對(duì)同位素標(biāo)記的UNAAs的稀釋。因此，相比細(xì)胞體系，CFUPS可以在使用最少量昂貴氨基酸條件下進(jìn)行穩(wěn)定的同位素標(biāo)記，產(chǎn)生的含有同位素標(biāo)記UNAAs的蛋白質(zhì)，可用于FT-IR、NMR表征及MS定量檢測(cè)[12]。除13C/15N標(biāo)記的氨基酸外，19F[74]取代的UNAAs也可用于無(wú)背景NMR研究[31,75]；此外，重原子取代的氨基酸的使用也大大促進(jìn)了X射線(xiàn)晶體結(jié)構(gòu)測(cè)定[76]。Abe以脫硫弧菌黃素單核苷酸(FMN)結(jié)合蛋白作為模型蛋白，應(yīng)用基于小麥胚芽的CFUPS，將3-疊氮基-L-酪氨酸(3-azido-L- tyrosine)嵌入FMN結(jié)合位點(diǎn)的Tyr35殘基位點(diǎn)，并通過(guò)熒光素-三芳基膦衍生物對(duì)該UNAA進(jìn)行特定的化學(xué)修飾，檢測(cè)輔因子結(jié)合蛋白的結(jié)構(gòu)變化[77]。

另一類(lèi)重要的生物物理探針即熒光UNAAs。熒光探針的高靈敏度性使其成為蛋白質(zhì)工程中普遍使用的研究方法[12]。熒光UNAAs可用于快速測(cè)定蛋白質(zhì)產(chǎn)量，無(wú)放射性標(biāo)記，因此不需要液體閃爍計(jì)數(shù)及在磷光屏上曝光[78]。如將熒光性UNAA (BODIPYFL) 嵌入煙堿型乙酰膽堿受體，可以對(duì)蛋白進(jìn)行單分子熒光檢測(cè)[79]。在特異位點(diǎn)嵌入熒光探針也可用于探測(cè)蛋白質(zhì)定位、構(gòu)象和蛋白質(zhì)之間相互作用的信息[80]，將4-氰基苯丙氨酸和4-乙炔基苯丙氨酸等UNAAs嵌入到蛋白質(zhì)中，利用這些氨基酸的固有熒光研究蛋白質(zhì)分子內(nèi)過(guò)程，如構(gòu)象變化和蛋白質(zhì)折疊[81]。Kirill使用體外預(yù)先裝載BODIPY-tRNACysCCU將BODIPY熒光團(tuán)引入鈣調(diào)蛋白 (CaM)，同時(shí)，通過(guò)琥珀抑制方法在相同的多肽上嵌入對(duì)疊氮基苯丙氨酸(p-azido-l-phenylalinine，pAzF)及其與四甲基羅丹明二苯并環(huán)辛烯 (TAMRA-DIBO) 的翻譯后綴合，通過(guò)一個(gè)翻譯后衍生步驟成功引入兩個(gè)熒光標(biāo)記，并通過(guò)單分子FRET分析監(jiān)測(cè)CaM在暴露于Ca2+或螯合劑時(shí)構(gòu)象的顯著變化[82]。引入多種熒光UNAAs還可實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)構(gòu)象和完整性的研究[12]。Anderson等使用琥珀抑制和四堿基解碼的混合方法，可通過(guò)FRET監(jiān)測(cè)蛋白質(zhì)完整性[83]；Nataka及其同事使用熒光UNAAs相關(guān)光譜篩選MMP-9抑制劑[84]；Sisido小組通過(guò)將一對(duì)供體淬滅劑UNAAs嵌入鏈霉親和素中，得到了局部蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的信息[85]；此外，嵌入U(xiǎn)NAAs也可監(jiān)測(cè)生物素在鏈霉親和素上的結(jié)合結(jié)果[72,86]。

3.3 蛋白質(zhì)進(jìn)化

傳統(tǒng)的酶或蛋白質(zhì)工程依賴(lài)于用其余的19種NAAs中的一種取代某一位點(diǎn)的某種氨基酸來(lái)改變酶或蛋白質(zhì)的功能特性[87]，嵌入U(xiǎn)NAAs的工程技術(shù)開(kāi)始產(chǎn)生具有更高穩(wěn)定性和改變催化性質(zhì)的酶[87]。近年，殘基特異性和位點(diǎn)特異性嵌入方法正在成為產(chǎn)生具有改變或改善功能酶的優(yōu)選方法。嵌入U(xiǎn)NAAs能夠提高半胱氨酸蛋白酶底物結(jié)合靈敏度[88]。細(xì)菌磷酸三酯酶以很快的速率催化農(nóng)藥氧磷的水解，并被認(rèn)為接近其進(jìn)化極限。Ugwumba等[89]為了測(cè)試是否可以通過(guò)嵌入U(xiǎn)NAAs來(lái)改善其自然進(jìn)化的更新率，及探測(cè)外周活性位點(diǎn)殘基在催化循環(huán)過(guò)程非化學(xué)步驟中的作用 (底物結(jié)合和產(chǎn)物釋放)，在CFUPS中，用非天然的L-(7-羥基香豆素-4-酰)乙基甘氨酸(Hco)和L-(7-甲基香豆素-4-酰)乙基甘氨酸(Mco)以及天然的亮氨酸、苯丙氨酸和色氨酸取代309位天然存在的酪氨酸。動(dòng)力學(xué)分析表明Hco的7-羥基，特別是當(dāng)其處于去質(zhì)子化狀態(tài)時(shí)，有助于促進(jìn)底物轉(zhuǎn)化的限速產(chǎn)物釋放步驟，提高其天然活性8?11倍。這些結(jié)果表明，UNAAs為已有的酶工程和進(jìn)化提供了新的有價(jià)值功能空間。

3.4 蛋白質(zhì)藥物

過(guò)去十年中，基于非天然蛋白質(zhì)藥物的研究在生物醫(yī)藥領(lǐng)域受到高度關(guān)注，且已被應(yīng)用于臨床規(guī)模藥物蛋白及疫苗的生產(chǎn)[90]。例如利用UNAAs形成共價(jià)的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)-小分子連接，形成均勻的抗體-藥物結(jié)合物，能夠增強(qiáng)對(duì)靶向細(xì)胞的有效性[91]。此外，Patel及其同事創(chuàng)造了含有炔丙基甘氨酸的螢光素酶變體以及攜帶pAzF的scFv與IM9蛋白的融合構(gòu)建體。然后研究人員將IM9-scFv融合蛋白與螢光素酶偶聯(lián)，并將所得的偶聯(lián)物用于體內(nèi)檢測(cè)B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞[92]。Swartz及其同事開(kāi)發(fā)了一種用于生產(chǎn)裝飾性病毒樣顆粒的新型流水線(xiàn)，可用作潛在的疫苗和顯像劑[26]。此外，抗體藥物結(jié)合物 (Antibody-drug conjugates, ADCs) 目前已經(jīng)成為靶向高效遞送細(xì)胞毒性藥物治療腫瘤的有效方法，已有超過(guò)40種ADCs處于臨床開(kāi)發(fā)階段[93]，且有兩個(gè)高效靶向遞送細(xì)胞毒性藥物治療腫瘤的ADSs已通過(guò)監(jiān)管部門(mén)的審批[94]。Zimmerman 等在CFUPS中成功表達(dá)含有pAzF的曲妥珠單抗變體，隨后將其與帶有DBCO的MMAF藥物部分偶聯(lián)，合成位點(diǎn)特異性ADC，產(chǎn)量達(dá)到約250 μg/mL，且經(jīng)細(xì)胞毒性測(cè)試為有效[9]。Ugwumba等用非天然氨基酸Hco標(biāo)記西尼羅河病毒非結(jié)構(gòu)蛋白酶，該酶對(duì)蛋白抑制劑及小配體分子非常敏感，可用于探測(cè)蛋白質(zhì)鑒定新的抑制劑，使其成為發(fā)現(xiàn)新藥的有力工具[95]。這些進(jìn)展表明了CFUPS在生產(chǎn)新型治療藥物 (圖3) 方面是實(shí)用且有效的，目前已成為新藥研發(fā)過(guò)程中快速而有效的工具之一。

3.5 蛋白質(zhì)材料

UNAAs嵌入產(chǎn)生新型序列明確的聚合物以用于生物材料合成的多功能應(yīng)用。Albayrak和Swartz報(bào)道了在CFUPS中含有2個(gè)或3個(gè)位點(diǎn)特異性嵌入U(xiǎn)NAAs的蛋白質(zhì)的直接聚合，其允許銅催化的疊氮化物-炔烴環(huán)加成形成線(xiàn)性或分支的蛋白質(zhì)聚合物[6]。Maza等合成9種UNAAs，通過(guò)與熒光團(tuán)或衍生樹(shù)脂反應(yīng)分析不同的生物復(fù)合物的最佳連接臂長(zhǎng)度，優(yōu)化了制備生物復(fù)合物的參數(shù)[96]。Katti等將3種具有較長(zhǎng)側(cè)鏈的UNAAs ((±)-2-氨基庚二酸、5-氨基戊酸和DL-2-氨基辛酸) 作為改性劑修飾鈉蒙脫石 (Na-MMT) 粘土，X射線(xiàn)衍射結(jié)果表明，在用3種UNAAs修飾后，Na-MMT粘土的層間距離增加；細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)顯示用3種氨基酸修飾的Na-MMT粘土仍保持了原有的生物相容性[97]。

4 結(jié)論與展望

無(wú)細(xì)胞非天然蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)作為靈活嵌入非天然氨基酸的強(qiáng)大技術(shù)平臺(tái)，已成為細(xì)胞內(nèi)非天然蛋白質(zhì)合成的重要補(bǔ)充手段之一。無(wú)細(xì)胞非天然蛋白質(zhì)合成解決了UNAAs的跨膜及胞內(nèi)運(yùn)輸障礙、細(xì)胞生長(zhǎng)毒性問(wèn)題，目前已成功合成蛋白藥物、病毒樣顆粒、膜蛋白和蛋白質(zhì)材料等多領(lǐng)域的非天然功能蛋白質(zhì)，在指導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)非天然蛋白質(zhì)合成體系及研究蛋白質(zhì)間相互作用、開(kāi)發(fā)蛋白質(zhì)藥物、新型蛋白材料方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。將來(lái)無(wú)細(xì)胞非天然蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)需要朝著4個(gè)方面發(fā)展，分別是：1) 開(kāi)發(fā)更有效的OTSs，提高非天然氨基酸的嵌入效率；2) 實(shí)現(xiàn)在目標(biāo)蛋白的多個(gè)位點(diǎn)嵌入多種UNAAs，擴(kuò)大非天然蛋白質(zhì)的種類(lèi)；3) 解決UNAAs多樣性帶來(lái)的生物不相容性，使非天然蛋白質(zhì)的產(chǎn)量得到大幅度的上升；4) 進(jìn)一步降低非天然蛋白質(zhì)合成的成本，使其能夠帶來(lái)可觀(guān)的經(jīng)濟(jì)效益，促進(jìn)工業(yè)化應(yīng)用。最大限度去開(kāi)發(fā)無(wú)細(xì)胞非天然蛋白質(zhì)合成平臺(tái)的潛力，使其能夠更好地應(yīng)用于科學(xué)基礎(chǔ)研究及工業(yè)生產(chǎn)研究。

[1] Wang L. Genetically encoding new bioreactivity. New Biotechnol, 2017, 38: 16–25.

[2] Soye BJD, Patel JR, Isaacs FJ, et al. Repurposing the translation apparatus for synthetic biology. Curr Opin Chem Biol, 2015, 28: 83–90.

[3] Hoesl MG, Budisa N. Recent advances in genetic code engineering in. Curr Opin Biotechnol, 2012, 23(5): 751–757.

[4] Liu CC, Schultz PG. Adding new chemistries to the genetic code. Annu Rev Biochem, 2010, 79(1): 413–444.

[5] Hong SH, Kwon YC, Jewett M. Non-standard amino acid incorporation into proteins usingcell-free protein synthesis. Front Chem, 2014, 2: 34.

[6] Albayrak C, Swartz JR. Cell-free co-production of an orthogonal transfer RNA activates efficient site-specific non-natural amino acid incorporation. Nucl Acids Res, 2013, 41(11): 5949–5963.

[7] Br?cker MJ, Ho J ML, Church GM, et al. Recoding the genetic code with selenocysteine. Angew Chem, 2014, 53(1): 319–323.

[8] Park HS, Hohn MJ, Umehara T, et al. Expanding the genetic code ofwith phosphoserine. Science, 2011, 333(6046): 1151–1154.

[9] Zimmerman ES, Heibeck TH, Gill A, et al. Production of site-specific antibody–drug conjugates using optimized non-natural amino acids in a cell-free expression system. Bioconjugate Chem, 2014, 25(2): 351–361.

[10] Zhang P, Lin J, Lu Y. Advances in cell-free protein synthesis. Chin J Bioprocess Engin, 2018, 16(1): 59–66 (in Chinese).張鵬, 林駿, 盧元. 無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成的研究進(jìn)展. 生物加工過(guò)程, 2018, 16(1): 59–66.

[11] Noren CJ, Anthony-Cahill SJ, Griffith MC, et al. A general method for site-specific incorporation of unnatural amino acids into proteins. Science, 1989, 244(4901): 182–188.

[12] Quast RB, Mrusek D, Hoffmeister C, et al. Cotranslational incorporation of non-standard amino acids using cell-free protein synthesis. FEBS Lett, 2015, 589(15): 1703–1712.

[13] Lu Y. Cell-free synthetic biology: engineering in an open world. Synthet Syst Biotechnol, 2017, 2(1): 23–27.

[14] Welsh JP, Lu Y, He XS, et al. Cell-free production of trimeric influenza hemagglutinin head domain proteins as vaccine antigens. Biotechnol Bioeng, 2012, 109(12): 2962–2969.

[15] Lu Y, Chan W, Ko BY, et al. Assessing sequence plasticity of a virus-like nanoparticle by evolution toward a versatile scaffold for vaccines and drug delivery. Proc Natl Acad Sci USA, 2015, 112(40): 12360–12365.

[16] Goerke AR, Swartz JR. High-level cell-free synthesis yields of proteins containing site-specific non-natural amino acids. Biotechnol Bioeng, 2009, 102(2): 400–416.

[17] Hodgman CE, Jewett MC. Characterizing IGR IRES-mediated translation initiation for use in yeast cell-free protein synthesis. New Biotechnol, 2014, 31(5): 499–505.

[18] Hirao I, Ohtsuki T, Fujiwara T, et al. An unnatural base pair for incorporating amino acid analogs into proteins. Nat Biotechnol, 2002, 20(2): 177–182.

[19] Taki M, Tokuda Y, Ohtsuki T, et al. Design of carrier tRNAs and selection of four-base codons for efficient incorporation of various nonnatural amino acids into proteins in21 (21) insect cell-free translation system. J Biosci Bioeng, 2006, 102(6): 511–517.

[20] Li SW, Millward S, Roberts R.selection of mrna display libraries containing an unnatural amino acid. J Am Chem Soc, 2002, 124(34): 9972–9973.

[21] Yanagisawa T, Takahashi M, Mukai T, et al. Multiple site-specific installations of Nε-monomethyl-L-lysine into histone proteins by cell-based and cell-free protein synthesis. Chembiochem, 2014, 15(12): 1830–1838.

[22] Hong SH, Ntai I, Haimovich AD, et al. Cell-free protein synthesis from a release factor 1 deficientactivates efficient and multiple site-specific nonstandard amino acid incorporation. ACS Synth Biol, 2014, 3(6): 398–409.

[23] Johnson DBF, Xu JF, Shen ZX, et al. RF1 knockout allows ribosomal incorporation of unnatural amino acids at multiple sites. Nat Chem Biol, 2011, 7(11): 779–786.

[24] Chen SX, Fahmi NE, Wang L, et al. Detection of dihydrofolate reductase conformational change by FRET using two fluorescent amino acids. J Am Chem Soc, 2013, 135(35): 12924–12927.

[25] Kajihara D, Abe R, Iijima I, et al. FRET analysis of protein conformational change through position-specific incorporation of fluorescent amino acids. Nat Methods, 2006, 3(11): 923–929.

[26] Lu Y, Welsh JP, Chan W, et al.-based cell free production of flagellin and ordered flagellin display on virus-like particles. Biotechnol Bioeng, 2013, 110(8): 2073–2085.

[27] Ravikumar Y, Nadarajan SP, Hyeon YT, et al. Incorporating unnatural amino acids to engineer biocatalysts for industrial bioprocess applications. Biotechnol J, 2015, 10(12): 1862–1876.

[28] Zawada JF, Yin G, Steiner AR, et al. Microscale to manufacturing scale-up of cell-free cytokine production—anew approach for shortening protein production development timelines. Biotechnol Bioeng, 2011, 108(7): 1570–1578.

[29] Chatterjee A, Sun SB, Furman JL, et al. A versatile platform for single- and multiple-unnatural amino acid mutagenesis in. Biochemistry, 2013, 52(10): 1828–1837.

[30] Munier R, Cohen GN. Incorporation of structural analogues of amino acids in bacterial proteins. Biochim Biophys Acta, 1956, 21(3): 592–593.

[31] Singh-Blom A, Hughes RA, Ellington AD. An amino acid depleted cell-free protein synthesis system for the incorporation of non-canonical amino acid analogs into proteins. J Biotechnol, 2014, 178: 12–22.

[32] Ambrogelly A, Palioura S, S?ll D. Natural expansion of the genetic code. Nat Chem Biol, 2006, 3(1): 29–35.

[33] Wang L, Brock A, Herberich B, et al. Expanding the genetic code of. Science, 2001, 292(5516): 498–500.

[34] Xie JM, Schultz PG. An expanding genetic code. Methods, 2005, 36(3): 227–238.

[35] Normanly J, Kleina LG, Masson JM, et al. Construction ofamber suppressor tRNA genes: III. Determination of tRNA specificity. J Mol Biol, 1990, 213(4): 719–726.

[36] Lajoie MJ, Rovner AJ, Goodman DB, et al. Genomically recoded organisms expand biological functions. Science, 2013, 342(6156): 357–360.

[37] Agafonov DE, Huang YW, Grote M, et al. Efficient suppression of the amber codon in.translation system. FEBS Lett, 2005, 579(10): 2156–2160.

[38] Martin RW, Des Soye BJ, Kwon YC, et al. Cell-free protein synthesis from genomically recoded bacteria enables multisite incorporation of noncanonical amino acids. Nat Commun, 2018, 9: 1203.

[39] Hohsaka T, Ashizuka Y, Taira H, et al. Incorporation of nonnatural amino acids into proteins by using various four-base codons in antranslation system. Biochemistry, 2001, 40(37): 11060–11064.

[40] Hohsaka T, Ashizuka Y, Murakami H, et al. Five-base codons for incorporation of nonnatural amino acids into proteins. Nucl Acids Res, 2001, 29(17): 3646–3651.

[41] Hohsaka T, Muranaka N, Komiyama C, et al. Position-specific incorporation of dansylated non-natural amino acids into streptavidin by using a four-base codon. FEBS Lett, 2004, 560(1/3): 173–177.

[42] Taira H, Fukushima M, Hohsaka T, et al. Four-base codon-mediated incorporation of nonnatural amino acids into proteins in a eukaryotic cell-free translation system. J Biosci Bioeng, 2005, 99(5): 473–476.

[43] Ohtsuki T, Manabe T, Sisido M. Multiple incorporation of non-natural amino acids into a single protein using tRNAs with non-standard structures. FEBS Lett, 2005, 579(30): 6769–6774.

[44] Dumas A, Lercher L, Spicer CD, et al. Designing logical codon reassignment-expanding the chemistry in biology. Chem Sci, 2015, 6(1): 50–69.

[45] O’donoghue P, Ling JQ, Wang YS, et al. Upgrading protein synthesis for synthetic biology. Nat Chem Biol, 2013, 9(10): 594–598.

[46] Shimizu Y, Inoue A, Tomari Y, et al. Cell-free translation reconstituted with purified components. Nat Biotechnol, 2001, 19(8): 751–755.

[47] Ahn JH, Hwang MY, Oh IS, et al. Preparation method forS30 extracts completely dependent upon tRNA addition to catalyze cell-free protein synthesis. Biotechnol Bioproc Eng, 2006, 11(5): 420–424.

[48] Forster AC, Tan ZP, Nalam MNL, et al. Programming peptidomimetic syntheses by translating genetic codes designed. Proc Natl Acad Sci USA, 2003, 100(11): 6353–6357.

[49] Iwane Y, Hitomi A, Murakami H, et al. Expanding the amino acid repertoire of ribosomal polypeptide synthesis via the artificial division of codon boxes. Nat Chem, 2016, 8(4): 317–325.

[50] Terasaka N, Hayashi G, Katoh T, et al. An orthogonal ribosome-tRNA pairengineering of the peptidyl transferase center. Nat Chem Biol, 2014, 10(7): 555–557.

[51] Cload ST, Liu DR, Froland WA, et al. Development of improved tRNAs forbiosynthesis of proteins containing unnatural amino acids. Chem Biol, 1996, 3(12): 1033–1038.

[52] Moore B, Persson BC, Nelson CC, et al. Quadruplet codons: implications for code expansion and the specification of translation step size. J Mol Biol, 2000, 298(2): 195–209.

[53] Short GF, Golovine SY, Hecht SM. Effects of release factor 1 onprotein translation and the elaboration of proteins containing unnatural amino acids. Biochemistry, 1999, 38(27): 8808–8819.

[54] Li LJ, Degardin M, Lavergne T, et al. Natural-like replication of an unnatural base pair for the expansion of the genetic alphabet and biotechnology applications. J Am Chem Soc, 2014, 136(3): 826–829.

[55] Bain JD, Switzer C, Chamberlin R, et al. Ribosome-mediated incorporation of a non-standard amino acid into a peptide through expansion of the genetic code. Nature, 1992, 356(6369): 537–539.

[56] Seo YJ, Hwang GT, Ordoukhanian P, et al. Optimization of an unnatural base pair toward natural-like replication. J Am Chem Soc, 2009, 131(9): 3246–3252.

[57] Chen F, Dong MX, Ge M, et al. Artificial base and synthetic life. Bull Chin Acad Sci, 2016, 31(4): 457–466 (in Chinese).陳非, 董夢(mèng)醒, 葛猛, 等. 人造堿基與人工合成生命. 中國(guó)科學(xué)院院刊, 2016, 31(4): 457–466.

[58] Hirao I, Kimoto M. Unnatural base pair systems toward the expansion of the genetic alphabet in the central dogma. Proc Japan Acad, Ser B, 2012, 88(7): 345–367.

[59] Kim CH, Axup JY, Schultz PG. Protein conjugation with genetically encoded unnatural amino acids. Curr Opin Chem Biol, 2013, 17(3): 412–419.

[60] Albayrak C, Swartz JR. Using.-based cell-free protein synthesis to evaluate the kinetic performance of an orthogonal tRNA and aminoacyl-tRNA synthetase pair. Biochem Biophys Res Commun, 2013, 431(2): 291–295.

[61] Nehring S, Budisa N, Wiltschi B. Performance analysis of orthogonal pairs designed for an expanded eukaryotic genetic code. PLoS ONE, 2012, 7(4): e31992.

[62] Quast RB, Claussnitzer I, Merk H, et al. Synthesis and site-directed fluorescence labeling of azido proteins using eukaryotic cell-free orthogonal translation systems. Analyt Biochem, 2014, 451: 4–9.

[63] Wang KH, Neumann H, Peak-Chew SY, et al. Evolved orthogonal ribosomes enhance the efficiency of synthetic genetic code expansion. Nat Biotechnol, 2007, 25(7): 770–777.

[64] Baslé E, Joubert N, Pucheault M. Protein chemical modification on endogenous amino acids. Chem Biol, 2010, 17(3): 213–227.

[65] O’hare HM, Johnsson K, Gautier A. Chemical probes shed light on protein function. Curr Opin Struct Biol, 2007, 17(4): 488–494.

[66] Muir TW. Semisynthesis of proteins by expressed protein ligation. Ann Rev Biochem, 2003, 72(1): 249–289.

[67] Ohno S, Matsui M, Yokogawa T, et al. Site-selective post-translational modification of proteins using an unnatural amino acid, 3-azidotyrosine. J Biochem, 2007, 141(3): 335–343.

[68] Venne AS, Kollipara L, Zahedi RP. The next level of complexity: crosstalk of posttranslational modifications. Proteomics, 2014, 14(4/5): 513–524.

[69] Fahmi NE, Dedkova L, Wang BX, et al. Site-specific incorporation of glycosylated serine and tyrosine derivatives into proteins. J Am Chem Soc, 2007, 129(12): 3586–3597.

[70] Serwa R, Wilkening I, Del Signore G, et al. Chemoselective staudinger-phosphite reaction of azides for the phosphorylation of proteins. Angew Chem Int Ed Engl, 2009, 48(44): 8234–8239.

[71] Serwa R, Majkut P, Horstmann B, et al. Site-specific PEGylation of proteins by a Staudinger-phosphite reaction. Chem Sci, 2010, 1(5): 596–602.

[72] Taki M, Hohsaka T, Murakami H, et al. A non-natural amino acid for efficient incorporation into proteins as a sensitive fluorescent probe. FEBS Lett, 2001, 507(1): 35–38.

[73] Su XC, Loh CT, Qi R, et al. Suppression of isotope scrambling in cell-free protein synthesis by broadband inhibition of PLP enymes for selective15N-labelling and production of perdeuterated proteins in H2O. J Biomol NMR, 2011, 50(1): 35–42.

[74] Neerathilingam M, Greene LH, Colebrooke SA, et al. Quantitation of protein expression in a cell-free system: efficient detection of yields and 19F NMR to identify folded protein. J Biomol NMR, 2005, 31(1): 11–19.

[75] Loscha KV, Herlt AJ, Qi RH, et al. Multiple-site labeling of proteins with unnatural amino acids. Angew Chem Int Ed Engl, 2012, 51(9): 2243–2246.

[76] Kiga D, Sakamoto K, Kodama K, et al. An engineeredtyrosyl–tRNA synthetase for site-specific incorporation of an unnatural amino acid into proteins in eukaryotic translation and its application in a wheat germ cell-free system. Proc Natl Acad Sci USA, 2002, 99(15): 9715–9720.

[77] Abe M, Ohno S, Yokogawa T, et al. Detection of structural changes in a cofactor binding protein by using a wheat germ cell-free protein synthesis system coupled with unnatural amino acid probing. Prot: Struct, Funct, Bioinf, 2007, 67(3): 643–652.

[78] Ozawa K, Loscha KV, Kuppan KV, et al. High-yield cell-free protein synthesis for site-specific incorporation of unnatural amino acids at two sites. Biochem Biophys Res Commun, 2012, 418(4): 652–656.

[79] Zhang WH, Otting G, Jackson CJ. Protein engineering with unnatural amino acids. Curr Opin Struct Biol, 2013, 23(4): 581–587.

[80] Abe R, Jeong HJ, Arakawa D, et al. Ultra Q-bodies: quench-based antibody probes that utilize dye-dye interactions with enhanced antigen-dependent fluorescence. Sci Rep, 2014, 4: 4640.

[81] Miyake-Stoner SJ, Miller AM, Hammill JT, et al. Probing protein folding using site-specifically encoded unnatural amino acids as FRET donors with tryptophan. Biochemistry, 2009, 48(25): 5953–5962.

[82] Cui ZL, Mureev S, Polinkovsky ME, et al. Combining sense and nonsense codon reassignment for site-selective protein modification with unnatural amino acids. ACS Synth Biol, 2017, 6(3): 535–544.

[83] Anderson RD, Zhou J, Hecht SM. Fluorescence resonance energy transfer between unnatural amino acids in a structurally modified dihydrofolate reductase. J Am Chem Soc, 2002, 124(33): 9674–9675.

[84] Nakata H, Ohtsuki T, Sisido M. A protease inhibitor discovery method using fluorescence correlation spectroscopy with position-specific labeled protein substrates. Analyt Biochem, 2009, 390(2): 121–125.

[85] Taki M, Hohsaka T, Murakami H, et al. Position-specific incorporation of a fluorophore?quencher pair into a single streptavidin through orthogonal four-base codon/anticodon Pairs. J Am Chem Soc, 2002, 124(49): 14586–14590.

[86] Murakami H, Hohsaka T, Ashizuka Y, et al. Site-directed incorporation of fluorescent nonnatural amino acids into streptavidin for highly sensitive detection of biotin. Biomacromolecules, 2000, 1(1): 118–125.

[87] Ravikumar Y, Nadarajan SP, Yoo TH, et al. Unnatural amino acid mutagenesis-based enzyme engineering. Trends Biotechnol, 2015, 33(8): 462–470.

[88] Poreba M, Kasperkiewicz P, Snipas SJ, et al. Unnatural amino acids increase sensitivity and provide for the design of highly selective caspase substrates. Cell Death Different, 2014, 21(9): 1482.

[89] Ugwumba IN, Ozawa K, Xu ZQ, et al. Improving a natural enzyme activity through incorporation of unnatural amino acids. J Am Chem Soc, 2011, 133(2): 326–333.

[90] Murray CJ, Baliga R. Cell-free translation of peptides and proteins: from high throughput screening to clinical production. Curr Opin Chem Biol, 2013, 17(3): 420–426.

[91] Axup JY, Bajjuri KM, Ritland M, et al. Synthesis of site-specific antibody-drug conjugates using unnatural amino acids. Proc Natl Acad Sci USA, 2012, 109(40): 16101–16106.

[92] Patel KG, Ng PP, Kuo CC, et al. Cell-free production ofluciferase–antibody fragment bioconjugates fordetection of tumor cells. Biochem Biophys Res Commun, 2009, 390(3): 971–976.

[93] Donaghy H. Effects of antibody, drug and linker on the preclinical and clinical toxicities of antibody-drug conjugates. mAbs, 2016, 8(4): 659–671.

[94] Bakhtiar R. Antibody drug conjugates. Biotechnol Lett, 2016, 38(10): 1655–1664.

[95] Ugwumba IN, Ozawa K, de la Cruz L, et al. Using a genetically encoded fluorescent amino acid as a site-specific probe to detect binding of low-molecular- weight compounds. Assay Drug Dev Technol, 2011, 9(1): 50–57.

[96] Maza JC, McKenna JR, Raliski BK, et al. Synthesis and incorporation of unnatural amino acids to probe and optimize protein bioconjugations. Bioconjugate Chem, 2015, 26(9): 1884–1889.

[97] Katti KS, Ambre AH, Peterka N, et al. Use of unnatural amino acids for design of novel organomodified clays as components of nanocomposite biomaterials. Philosoph Trans R Soc A: Math, Phys Eng Sci, 2010, 368(1917): 1963–1980.

(本文責(zé)編 陳宏宇)

Recent advances in cell-free unnatural protein synthesis

Wei Gao1,2, Ning Bu2, and Yuan Lu1

1 Department of Chemical Engineering, Tsinghua University, Beijing 100084, China 2 College of Life Sciences, Shenyang Normal University, Shenyang 110034, Liaoning, China

Cell-free unnatural protein synthesis (CFUPS) as an emerging approach for protein engineering research, has been successfully applied in basic scientific studies (e.g., protein-protein interaction, protein-nucleic acid interaction) and industrial production (e.g., pharmaceutical proteins, protein materials). CFUPS can improve the engineering freedom and the process control by allowing free addition of genetic elements and chemicals as research purposes. It also can give protein novel characteristics, structures and functions, including post-translational modification of proteins, incorporation of reaction handles, synthesis of biophysical probes and polymeric protein. This article systematically reviews the unnatural amino acid incorporation methods (global suppression, stop codon suppression, frameshift suppression and unnatural base-pairs) and the application advances of unnatural amino acids in protein modifications, biophysical probes, enzyme engineering, biomaterials and biopharmaceutical protein production. The opportunities and challenges of the CFUPS system development and the wide application of industrialization are also illustrated with details.

cell-free synthetic biology, protein engineering, unnatural amino acids (UNAAs), unnatural proteins

May 12, 2018;

June 28, 2018

National Natural Science Foundation of China (No. 21706144).

Yuan Lu. Tel/Fax:+86-10-62780127; E-mail: yuanlu@tsinghua.edu.cn Ning Bu. E-mail: buning@sohu.com

國(guó)家自然科學(xué)基金 (No. 21706144) 資助。

2018-07-14

10.13345/j.cjb.180203

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20180712.1701.003.html