花生AhFAD2基因抑制表達的轉基因后代分析

徐平麗，唐桂英，畢玉平，柳展基，單雷

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花生基因抑制表達的轉基因后代分析

徐平麗1,2，唐桂英1,2，畢玉平1,2，柳展基3，單雷1,2

1 山東省農業(yè)科學院 生物技術研究中心，山東 濟南 250100 2 山東省作物遺傳改良與生理生態(tài)重點實驗室，山東 濟南 250100 3 山東省農業(yè)科學院 棉花研究中心，山東 濟南 250100

徐平麗, 唐桂英, 畢玉平, 等. 花生AhFAD2基因抑制表達的轉基因后代分析.生物工程學報, 2018, 34(9): 1469–1477.Xu PL, Tang GY, Bi YP, et al. Analysis of the peanut transgenic offspring with depressing AhFAD2 gene. Chin J Biotech, 2018, 34(9): 1469–1477.

FAD2 (Δ12fatty acid desaturase，Δ12FAD或FAD2) 是催化油酸在脂肪酸碳鏈Δ12位脫氫生成亞油酸的關鍵酶。在花生中，F(xiàn)AD2酶活性下降或失活可提高籽粒中油酸的相對含量，改善花生籽粒及制品的品質和氧化穩(wěn)定性。通過將種子特異性表達Lectin啟動子和CaMV35S啟動子驅動的倒位重復基因RNAi干擾結構轉入花生，獲得了以豐花1號(FH1) 和花育23 (HY23) 為受體、攜帶上述2種轉化結構、穩(wěn)定遺傳的花生轉基因純合體株系，轉基因花生主要農藝性狀與非轉基因對照基本一致。實時熒光定量分析發(fā)現(xiàn)，各轉基因株系發(fā)育種子中基因的轉錄水平普遍下調。氣相色譜法進一步測定了部分轉基因后代株系種子的脂肪酸含量及組成，籽粒中油酸含量分別平均提高了15.09% (HY23為受體)、36.40% (FH1為受體)，相應地，亞油酸含量平均下降了16.19%、29.81%，油亞比平均增加了38.02%、98.10%。各轉基因株系的油酸含量顯著提高；且在以FH1為受體的轉基因株系后代籽粒以及種子特異性啟動子驅動的轉化結構中，RNAi的抑制效果更明顯。通過RNAi技術抑制花生FAD2基因的表達，可以有效提高花生籽粒油酸含量。該技術體系可以為花生品質育種提供借鑒。

花生，Δ12脂肪酸脫氫酶，RNA干擾，轉基因，油酸與亞油酸比值

花生是我國重要的經濟作物和油料作物，花生籽粒含油量達50%左右，油酸、亞油酸分別占其總脂肪酸含量的36%–67%和15%–43%[1]。油酸為18碳單不飽和脂肪酸，化學性質相比亞油酸、亞麻酸等多不飽和脂肪酸要穩(wěn)定得多。提高油酸含量可以改善花生及花生制品的口味和氧化穩(wěn)定性。Mozingo等報道稱，烘焙的高油酸花生比普通含量油酸花生貯存期延長8倍[2-4]。因此，提高花生籽粒中油酸的相對含量已成為目前花生品質育種的重要目標之一[5-7]。

微粒體Δ12脂肪酸脫氫酶 (Δ12fatty acid desaturase，Δ12FAD或FAD2)，是催化脂肪酸碳鏈上油酸在C12處脫氫生成亞油酸的關鍵酶，對于植物貯藏脂和膜脂中的不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸的比例有著重要調控作用[8-9]。花生基因組中存在兩對能編碼完整蛋白的基因 (和)。和基因編碼區(qū)序列變化所引起編碼蛋白活性的差異與花生籽粒油酸、亞油酸含量密切相關[10-11]。

近幾年，反義、共抑制或RNAi技術在改良脂肪酸組成方面的研究，已在油菜、大豆、棉花、亞麻等作物取得了突破[12-17]。Peng等構建獨特內含子間隔的脂肪酸延長酶1 (Fatty acid elongase1，) 基因融合片段的發(fā)卡RNA干擾載體，同時抑制基因的表達，使得轉基因油菜種子中的油酸含量從15%提高到85%；多不飽和脂肪酸含量下降到10%，其中芥酸含量為0[12]。Lee等通過反義RNA特異抑制種子基因，獲得了高油酸、低多不飽和脂肪酸的油菜[13]。Kinney等1996年通過正義-共抑制途徑，降低FAD2的酶活性，使得轉基因大豆的油酸含量從67%提高到超過80%[14]。Buhr等則利用RNAi同時抑制?；D移酶基因 () 和基因的表達，獲得了低棕櫚酸和高油酸的轉基因大豆[15]。Liu等通過構建種子特異性啟動子驅動的hpRNA (Hairpin RNA) 載體，抑制基因的表達，使得棉籽油中油酸的含量從15%提高到77%，亞油酸含量從60%下降到4%[16]。Chen等通過RNAi干擾基因的表達，使得轉基因T3代亞麻中油酸含量達到77%[17]。

我們實驗室前期構建了基因RNAi抑制表達載體，通過農桿菌介導法，分別將花椰菜花葉病毒 (Cauliflower mosaic virus，CaMV) 35S啟動子和種子特異性表達的大豆凝集素 (Lectin) 啟動子驅動的倒位重復片段轉入花生，獲得了一批PCR檢測的陽性轉基因植株[18]。本研究在此基礎上，經遺傳轉化、溫室種植、分子水平檢測篩選等，獲得10個穩(wěn)定遺傳的轉基因株系。利用qRT-PCR分析了基因在部分轉基因花生后代種子中的轉錄水平表達情況；調查了轉基因株系的主要農藝性狀；利用氣相色譜測定了部分轉基因花生后代種子的脂肪酸含量和組成。

1 材料與方法

1.1 植物材料

花生L.品種：花育23號 (HY23，CK1即非轉基因對照1)，由山東省花生研究所提供；豐花1號 (FH1，CK2即非轉基因對照2)，由山東農業(yè)大學農學院萬勇善教授提供。

花生轉基因株系由本實驗室通過RNAi策略，采用農桿菌介導法將基因倒位重復結構轉入受體花生FH1[18]和HY23獲得。文中分析的以HY23為受體的株系包括：201301021903、201301061108、201201030109 (帶有種子特異啟動子Lectin，下文分別簡寫為H1903、H1108、H0109) 和201302011308、201202100319、201202120104 (帶有組成型表達啟動子CaMV35S，下文分別簡寫為H1308、H0319、H0104)。FH1為受體的株系：201001010104、201001040101 (帶有種子特異啟動子Lectin，下文分別簡寫為F0104、F0101) 和 201002123501、201202060904 (帶有組成型表達啟動子CaMV35S，下文分別簡寫為F3501、F0904)?；ㄉD基因后代及非轉基因對照均種植在山東省農業(yè)科學院生物技術研究中心飲馬泉實驗基地溫室。

1.2 試劑

DNA聚合酶、PrimeScript Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis Kit、DNA分子量標準DL2000購自大連TaKaRa生物工程有限公司。TransStart Green qPCR SuperMix UDG購自北京全式金生物技術有限公司。新型植物RNA快速提取試劑盒購自北京華越洋生物科技有限公司。PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成。其余均為國產或進口分析純試劑。

1.3 實時熒光定量PCR引物設計

遵循熒光定量引物設計原則，使用Primer5.0引物設計軟件設計熒光定量PCR引物。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

qRT-PCR檢測花生內源基因轉錄水平的引物序列，2F：5′-CGACCGCAACGAAGT GTT-3′；2-R：5′-CCCTCCCTGGTGGATTGT-3′；花生內參Actin基因轉錄水平的檢測引物序列，Actin-F：5′-ATGTATGTAGCCATCCAAG-3′；Actin-R：5′-ACCAGAGTCCAGAACAATA-3′。

1.4 方法

1.4.1 穩(wěn)定遺傳的轉基因株系獲得

實驗室前期已獲得以FH1為受體的RNAi抑制基因表達的2種轉化結構的陽性轉基因花生植株[18]。在此基礎上，以HY23為受體進行了同樣的轉化，最終，共獲得2個轉化結構的PCR檢測陽性的轉基因T0代植株20株，部分植株PCR產物經測序驗證。來源于受體FH1和HY23的轉基因T0代植株經3–4代溫室種植、田間取樣PCR檢測、DNA序列測定篩選等過程，最終獲得單拷貝插入穩(wěn)定遺傳的純合體株系10個，用于后續(xù)實驗。

1.4.2基因在轉基因后代的轉錄水平分析

按照北京華越洋生物科技有限公司新型植物RNA快速提取試劑盒提供的方法，分別提取轉基因株系及非轉基因對照開花后30 d和60 d未成熟種子的總RNA。紫外分光光度計測定其純度、濃度，取0.2–0.5 μg 總RNA在1.2%瓊脂糖凝膠電泳，檢測總RNA的完整性。取0.5 μg總RNA，在10 μL體系中參照TaKaRa PrimeScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit提供步驟和條件合成cDNA第一鏈，儲存于–20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

選擇受體為HY23的轉基因后代4個轉化事件 (包括Lectin啟動子的2個，CaMV35S啟動子的2個)，受體為FH1的轉基因后代4個轉化事件 (包括Lectin啟動子的2個，CaMV35S啟動子的2個)，以花生Actin基因作為參比，實時熒光定量法對轉基因種子中基因轉錄水平表達情況進行分析。每一株系的檢測均設3個生物學重復，相對表達量用2–ΔΔCT的表示。

熒光實時定量PCR反應體系包括：10 μL 2×TransStart Green qPCR SuperMix UDG，10 μmol/LPCR正向引物和反向引物各0.4 μL，cDNA模板2 μL (約50 ng)，Passive Reference Dye (50×) 0.4 μL，ddH2O補充體積至20 μL。反應條件：95 ℃預變性2 min；然后95 ℃變性10 s，60 ℃退火延伸30 s，共40個循環(huán)。反應由ABI公司的7500型熒光定量PCR儀完成。

1.4.3 轉基因花生株系主要農藝性狀調查

主要通過觀察比較方法，對種植在溫室的轉基因花生及對照的株高、花期、生育期及感病情況等進行調查。收獲后的花生，則待自然曬干，分別選取不同轉基因株系的10個單株，每單株隨機選10個飽果，計算百果重；之后，隨機選取100粒飽滿種子，計算百仁重；統(tǒng)計記錄單株飽果數(shù)。

1.4.4 氣相色譜法 (Gas chromatography，GC) 檢測轉基因花生籽粒脂肪酸組成及含量

近紅外反射光譜法首先從T2代開始，對轉基因后代成熟籽粒的油酸含量進行初步篩選，選取油酸含量升高的后代株系進行后續(xù)實驗。之后，綜合主要農藝性狀調查和近紅外反射光譜測定結果，在每個表達結構的轉基因株系中選取2–3個轉化事件，每個轉化事件選取3個所測結果接近平均值的單株籽粒為氣相色譜測定對象，每個樣品10 g。參考Sukhija等[19]改進的一步法抽提脂肪酸并進行甲酯化，利用配置色譜柱DB-23 (60.0 m×250 μm×0.25 μm)、檢測器FID 270 ℃的氣相色譜儀Agilent 6890，參考國標GB/T 21514-2008[20]分析種子脂肪酸組成及其含量，測定由中國農業(yè)大學飼料分析測試中心完成。

2 結果與分析

2.1 AhFAD2基因在轉基因花生種子中的轉錄水平分析

qRT-PCR結果顯示 (圖1)，與非轉基因對照相比，花生基因的相對表達量在各轉基因株系后代發(fā)育種子中均有不同程度的降低，但降低幅度在不同啟動子驅動的轉化結構、種子不同的發(fā)育時期及不同的轉基因株系間不同。以HY23為受體的4個轉基因株系，在種子發(fā)育早期 (花后30 d)，與非轉基因對照相比，所測基因的相對表達量下降幅度為8.45%–51.30%，平均下降23.70%，種子特異性啟動子、CaMV35S啟動子驅動的轉化結構平均下降幅度分別為34.95%、12.46%；而在種子發(fā)育后期 (花后60 d)，基因表達受到更明顯抑制，基因相對表達量下降幅度為20.14%–88.98%，平均下降68.76%，種子特異性啟動子、CaMV35S啟動子驅動的轉化結構平均下降幅度分別為82.96%、54.56%。以FH1為受體的4個轉基因株系中，與非轉基因對照相比，花后30 d發(fā)育種子中基因的相對表達量下降幅度為16.38%–80.47%，平均下降48.88%，種子特異性啟動子、CaMV35S啟動子驅動的轉化結構平均下降幅度分別為74.06%、23.70%；而花后60 d種子中，基因表達受到的抑制更明顯，相對表達量下降幅度為31.16%–94.4%，平均下降71.04%，種子特異性啟動子、CaMV35S啟動子驅動的平均下降幅度分別為86.00%、56.09%。因此，種子特異性啟動子驅動下，抑制基因表達的效果更明顯；在以FH1為受體的轉基因株系籽粒中，基因的相對表達量較低，RNAi的抑制效果更理想。

圖1 AhFAD2基因在不同轉基因株系發(fā)育種子中的轉錄水平

2.2 轉基因花生主要農藝性狀調查

對2個轉化結構的轉基因花生主要農藝性狀分析表明，轉基因花生生育期分別為130 d和135 d左右 (以HY23、FH1為受體)，主莖平均高度分別為37.0 cm和45.0 cm，均屬連續(xù)開花型，整個生命周期無明顯感病癥狀，分別與非轉基因HY23、FH1的表現(xiàn)基本一致。收獲后，調查單株花生莢果及種子的部分性狀，轉基因花生果形、粒形、種皮顏色與非轉基因對照基本一致；百仁重、百果重等也無明顯變化 (圖2，表1)。調查結果可見，無論是組成型表達35S啟動子還是種子特異性Lectin啟動子驅動的基因抑制表達都沒有引起轉基因花生主要農藝性狀的明顯改變。

2.3 氣相色譜法 (GC) 分析轉基因花生株系籽粒脂肪酸組成

綜合考慮近紅外反射光譜檢測情況 (數(shù)據(jù)未展示) 和農藝性狀調查結果，我們共選取2個轉化結構的10個不同轉基因代表單株 (6個HY23為受體，4個FH1為受體)，利用氣相色譜法測定了籽粒中的主要脂肪酸含量及組成 (表2)。分析發(fā)現(xiàn)，花生轉基因株系種子中的8種主要脂肪酸含量發(fā)生了變化，包括棕櫚酸 (C16:0)、硬脂酸 (C18:0)、油酸 (C18:1n9c)、亞油酸 (C18:2n6c)、花生酸 (C20:0)、山崳酸 (C22:0)、木蠟酸 (C24:0) 等 (表3，含量低于2%的數(shù)據(jù)未展示)。以HY23為受體的轉基因株系種子中油酸含量從44.19%提高到48.15%–53.69%，平均提高了15.09%，最高可達21.5% (H1308)；亞油酸含量從34.48%下降到26.19%–31.04%，平均下降16.19%；油亞比從1.28提高到1.55–2.05，平均提高了38.02%。以FH1為受體的轉基因株系種子中油酸含量從37.20%提高到42.01%–55.22%，平均提高了36.40%，最高提高幅度為48.44% (F0104)；亞油酸含量從40.51%下降到24.87%–34.36%，平均下降29.81%；油亞比從0.92提高到1.22–2.22，平均提高了98.10%。轉基因株系種子中油酸含量、油亞比普遍提高，轉基因株系與非轉基因對照之間種子油酸、亞油酸含量差異顯著，說明倒位重復序列片段串聯(lián)組成的RNAi結構，可以有效抑制基因的表達；不同的轉基因株系之間，油酸含量差異顯著，不同啟動子驅動下的油亞比提高率差異明顯，說明不同的啟動子驅動、不同的轉化受體、不同株系間基因表達的RNAi抑制效果明顯不同 (表2，圖3)。

圖2 收獲期轉基因花生和非轉基因對照的表型

表1 部分轉基因花生莢果產量性狀統(tǒng)計

表2 轉基因花生籽粒中主要脂肪酸組分含量

CK1 is untransformed control HY23; CK2 is untransformed control FH1; capital letter represents significant variation at the 0.01 probability level; lowercase letter represents significant difference at the 0.05 probability level.

圖3 花生不同轉基因株系籽粒的油亞比增加率

3 討論

3.1 RNAi有效抑制轉基因花生種子中FAD2基因的表達

花生中含有兩個基因 (、)，它們在ORF區(qū)具有99%的序列一致性，因此，我們選擇位于編碼區(qū)5′端9–235 bp的保守區(qū)域設計RNAi表達結構可以同時抑制和的表達[18]。本研究獲得的轉基因株系種子中基因的表達受到不同程度抑制，但其他表型沒有發(fā)生明顯變化。一方面，干擾片段與其他基因的編碼序列或EST序列沒有同源性，不會意外沉默其他基因；另一方面，花生高油酸突變體的研究表明，正常生長條件下，這兩個基因在根、葉等營養(yǎng)體中的抑制表達或編碼酶活性降低，并不會造成明顯的表型變化。

Stoujesijk等在擬南芥中的研究表明，F(xiàn)AD2的RNA干擾效果在擬南芥子代穩(wěn)定遺傳[21]。我們的研究結果也基本印證了這一結論。本研究qRT-PCR分析的是T3或T4代純合株系種子中的轉錄水平，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)轉基因株系中RNAi抑制基因表達的抑制效果明顯，說明倒位重復序列片段串聯(lián)組成的RNAi結構，可以有效抑制基因的表達。

對基因在不同轉基因株系發(fā)育種子中的轉錄水平分析發(fā)現(xiàn)，種子特異性啟動子驅動的轉化結構，RNAi抑制基因表達的效果更為明顯。這或許是由于CaMV35S啟動子屬于組成型的表達啟動子，在整株水平上抑制基因的表達容易影響植株的膜脂結構、植株的生長速率及組培再生苗的生根等[18]。Lectin啟動子為種子特異表達啟動子，僅在種子發(fā)育階段驅動RNAi抑制基因的表達，一般不會對植株整體造成影響。脂肪酸代謝是植株生命體的基本生命活動之一，基因是脂肪酸代謝途徑的關鍵酶，因此，從籽仁油酸含量改良角度出發(fā)，種子特異啟動子調控的RNAi轉化結構，在改善花生油品質等方面會有更大的應用空間。

3.2 轉基因花生籽粒的O/L比不同程度提高

FAD2是催化油酸在脂肪酸碳鏈C12位脫氫生成亞油酸的關鍵酶，與植物貯藏脂中油酸、亞油酸含量密切相關。花生中和兩基因編碼的酶均具有催化活性，但它們對油酸含量的貢獻不同，基因突變的貢獻性更大一些。編碼區(qū)448位一個點突變致使編碼的酶活性幾乎喪失，然而僅這一基因突變，花生籽粒只表現(xiàn)出普通油酸性狀；而突變導致的表達降低或酶活性喪失，則花生籽粒會表現(xiàn)出中等油酸性狀；兩基因同時突變，突變體籽粒表現(xiàn)高油酸性狀，油酸含量可達75%以上[10,22]。

本研究以HY23為受體的轉基因株系種子中油亞比從1.28提高到1.55–2.05，平均提高了38.02%；而FH1為受體的轉化事件種子中油亞比從0.92提高到1.22–2.22，平均提高了98.10%。不同受體花生獲得的轉基因材料種子油亞比提高幅度明顯不同。以往的研究發(fā)現(xiàn)，轉化受體HY23基因發(fā)生突變，編碼的酶本身已不具備催化功能，因此其籽粒的O/L與其他珍珠豆型品種相比有所提高；而受體FH1攜帶的是野生型和基因，籽粒O/L處于較低水平[10]。按設計我們轉入的干擾片段應對兩基因具有同等的抑制效果，本研究發(fā)現(xiàn)，轉錄水平上，開花60 d的HY23和FH1轉基因株系間的抑制效果確實沒有明顯差別，但由于HY23受體突變的AhFAD2A本身的酶活性幾近喪失，因此轉基因種子中基因的抑制效果僅為基因抑制表達的結果，O/L提高幅度就相對偏低。FH1為受體的轉基因株系和兩基因表達均受到抑制，盡管它們的油酸含量和O/L總體上與HY23為受體的轉基因株系持平，但油酸含量和O/L的提高幅度相對更大。

以往在油菜、棉花、大豆等作物高油酸轉基因研究中發(fā)現(xiàn)，介導的轉錄后基因沉默策略比反義RNA、RNA共抑制等技術更為有效[12-17]。以油菜基因的3′UTR (Untranslated region，UTR) 219 bp片段為干擾片段的結構，使得轉基因油菜油酸含量從67%提高到85%[13]。油菜、兩個基因的融合片段形成的結構，可同時抑制轉基因油菜種子中與兩個基因的表達，使油酸含量高達85%且不含芥子酸[12]。Liu等在棉花中抑制ghFAD2-1基因表達，也使轉基因棉花籽粒中油酸從15%提高到了77%[16]。然而，本研究兩種受體材料獲得的轉基因株系中油酸含量最高的分別為53.69%、55.22%，O/L分別為1.55–2.05、1.22–2.22。此結果與黃冰艷等獲得的RNAi轉基因花生T1代籽粒O/L接近[23]。黃冰艷[23]等在研究中采用的也是具有內含子間隔的具發(fā)卡環(huán)的RNAi結構，但文中沒有介紹所選基因干擾片段的位置。同一轉化結構產生的不同轉基因株系目標性狀之間存在差異，這在其他植物轉基因研究中也常發(fā)生，推測是由于外源片段插入受體基因組的不同位置所造成[17,21]。但是，同樣運用hpRNA介導的策略抑制基因的表達，我們和黃冰艷等[23]在花生中的研究結果與他人在油菜、棉花等作物中的結果相比差距很大，可能是由于所選靶基因片段的位置不同造成了不同的抑制效果。

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(本文責編 郝麗芳)

Analysis of the peanut transgenic offspring with depressinggene

Pingli Xu1,2, Guiying Tang1,2, Yuping Bi1,2, Zhanji Liu3, and Lei Shan1,2

1 Bio-Tech Research Center, Shandong Academy of Agricultural Sciences, Jinan 250100, Shandong, China 2 Shandong Provincial Key Laboratory of Crop Genetic Improvement, Ecology and Physiology, Jinan 250100, Shandong, China 3 Shandong Cotton Research Center, Shandong Academy of Agricultural Sciences, Jinan 250100, Shandong, China

The delta-12 fatty acid desaturase (Δ12FAD or FAD2) is a key enzyme that catalyzes oleic acid to linoleic acid by dehydrogenation at Δ12position offatty acid carbon chain. In peanut, reduction or loss of FAD2 activity could enhance the relative content of oleic acid in kernels, and improve the quality and oxidation stability of peanut kernels and products. RNA interference (RNAi) technology could lead to non-expression or down-regulated expression ofgene. We constructed two RNA interference expression vectors with the inverted repeat sequence of partialgene, which were driven separately by cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S promoter or soybean agglutinin lectin seed-specific promoter. Homozygous transgenic lines carrying the two constructs stably in genetics were developed by peanut genetic transformation. There were no significant differences between the transgenic lines and the control through investigating the main agronomic traits. We analyzed the transcriptional level expression ofgene in transgenic lines and the control by real-time fluorescence quantitative PCR (qRT-PCR). The results suggested that the target genes of transgenic lines were likely suppressed by RNA interference, but showed different transcriptional levels in different peanut transgenic lines. Compared with untransformed lines, the resulting down-regulation ofgene resulted in a 15.09% or 36.40% increase in oleic acid content in the seeds of transformed HY23 and FH1 lines respectively, and the content of linoleic acid decreased by 16.19% or 29.81%, correspondingly, the ratio of oleic acid and linoleic acid (O/L) improved by 38.02%, 98.10%. The oleic acid content had significant differences between the two transformation constructs, and also among different transgenic lines. Moreover, the inhibition effect of RNAi was more obvious in the transgenic lines with FH1 as the receptor, and with transformation structure driven by seed specific promoter. The suppressed expression ofgene enabled the development of peanut fatty acid, which indicated that RNA interference would be a reliable technique for the genetic modification of peanut seed quality and the potential for improvement of other traits as well.

peanut(L.), Δ12fatty acid desaturase (FAD2), RNA interference (RNAi), transgenic, the ratio of oleic acid and linoleic acid (O/L)

December 23, 2017;

June 8, 2018

National Natural Science Foundation of China (Nos. 31201272, 31470349), Agricultural Improved Seed Project of Shandong Province (2014-2017).

Lei Shan. Tel: +86-531-66659435; E-mail: shlei1025@sina.com

國家自然科學基金(Nos. 31201272，31470349)，山東省農業(yè)良種工程(2014-2017) 資助。

2018-07-06

10.13345/j.cjb.170508

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20180709.1036.001.html