非洲豬瘟病毒p30-54融合蛋白基因的構(gòu)建、表達及其多克隆抗體制備

李 杰，張星星，郭 晶，孟慶玲，喬 軍*，張國武，王曉婷，李 妍，才學鵬

(1.石河子大學 動物科技學院，新疆 石河子 832003； 2.新疆農(nóng)墾科學院 省部共建綿羊遺傳改良與健康養(yǎng)殖國家重點實驗室，新疆 石河子 832000； 3.中國農(nóng)業(yè)科學院 蘭州獸醫(yī)研究所，甘肅 蘭州 730046)

非洲豬瘟(African swine fever，ASF)是由非洲豬瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)引起豬的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病[1-3]，以高熱、食欲廢絕、皮膚和內(nèi)臟器官出血為臨床特征，病死率高[4]。該病被世界動物衛(wèi)生組織(OIE)定為法定報告動物疫病[5]。ASF最初主要在非洲流行，隨后在意大利撒丁島、西班牙、葡萄牙、加勒比地區(qū)、巴西以及東歐等國家或地區(qū)被發(fā)現(xiàn)[6]。2017 年，俄羅斯遠東地區(qū)發(fā)生ASF疫情，導致該病傳入我國的風險不斷增加。因此，我國急需提高對該病的檢疫和監(jiān)測能力。

目前，血清學檢測是診斷和監(jiān)測豬群ASFV感染的重要方法之一[7]。然而，現(xiàn)有的ASFV血清學檢測方法中，所使用的ASFV診斷抗原或為細胞培養(yǎng)的全病毒抗原，或為ASFV單一的重組蛋白。細胞培養(yǎng)的全病毒抗原雖然敏感性較高，但需要培養(yǎng)活病毒，存在生物安全方面的問題[8]；單一重組蛋白抗原雖具有較高的特異性，但敏感性不高，檢出率較低。因此，制備特異性強和敏感性高的ASFV診斷用抗原是研發(fā)高效血清學診斷方法的關(guān)鍵。有研究表明，p30和p54蛋白均可誘導特異性免疫反應(yīng)，其中p30具有最佳的診斷抗原性能[7]。鑒于此，本研究將ASFVp30和p54基因進行融合，構(gòu)建了p30-54融合基因，并在大腸桿菌表達系統(tǒng)中進行表達，分析了融合蛋白的反應(yīng)原性，制備了抗ASFV p30-54融合蛋白多克隆抗體，以期為ASFV診斷用抗原的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 載體、菌株及試劑

pET-28a(+)、pMD18-T載體、E.coliDH5α和E.coliBL21(DE3)由石河子大學動物科技學院寄生蟲實驗室保存。IPTG、X-gal、DNA Marker、核酸限制性內(nèi)切酶(EcoRⅠ、XhoⅠ)、T4 DNA Ligase和標準蛋白質(zhì)Marker均購自TaKaRa公司。ASFV陽性血清由中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所惠贈。辣根過氧化物酶標記兔抗豬IgG購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。商品化ASFV抗體檢測ELISA試劑盒(西班牙INGENASA公司生產(chǎn))購自廣州測迪生物科技有限公司。

1.2 ASFV p30和p54基因的體外合成

根據(jù)GenBank中登錄的ASFVp30和p54基因序列，運用在線軟件Racc(http://nihserver.mbi.ucla.edu/RACC)對上述基因序列中大腸桿菌稀有密碼子預(yù)測分析，將其稀有密碼子優(yōu)化為大腸桿菌偏愛密碼子，由華大基因有限公司進行體外合成。

1.3 ASFV pT-p30-54重組質(zhì)粒的構(gòu)建

通過重疊延伸PCR技術(shù)(SOE-PCR)進行p30-54融合基因的構(gòu)建。根據(jù)p30和p54基因序列，設(shè)計PCR引物。Fp30：5′-GGAATTCATGGATTTTATTTTAAATATATCC-3′(下劃線部分為EcoRⅠ酶切位點);Rp30：5′-GTTTAATGACCATGAGTCTTA-3′。Fp54：5′-GAGCACATAACTTTATTCAAACCA-3′；Rp54：5′-CCTCGAGTTACAAGGAGTTTTCCAGGTC-3′(下劃線部分為XhoⅠ酶切位點)。用Fp30-Rp30擴增p30基因片段、Fp54-Rp54擴增p54基因片段，分別回收PCR產(chǎn)物。SOE-PCR采用20 μL反應(yīng)體系：Fp30、Rp54引物各0.5 μL，10×Pfu Buffer 2 μL，PCR產(chǎn)物各2 μL，2.5 mmol/L dNTPs 1.6 μL，Pfu DNA聚合酶0.2 μL，加水至20 μL。SOE-PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 4 min；95 ℃ 50 s，60 ℃ 40 s，72 ℃ 60 s，20個循環(huán)；72 ℃ 10 min。SOE-PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳并回收后，克隆入pMD18-T載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pT-p30-54，進行測序。

1.4 重組表達載體pET-p30-54的構(gòu)建與鑒定

用EcoRⅠ和XhoⅠ分別對pT-p30-54和pET28a(+)質(zhì)粒雙酶切，用DNA凝膠回收試劑盒回收p30-54目的基因和載體片段，用T4 DNA 連接酶4 ℃過夜連接，然后轉(zhuǎn)化入E.coliDH5α感受態(tài)細胞中，在含氨芐青霉素抗性的固體培養(yǎng)基中37 ℃過夜培養(yǎng)，挑取單菌落，再經(jīng)PCR和雙酶切鑒定的方法篩選獲得陽性克隆pET-p30-54。

1.5 ASFV p30-54融合蛋白的誘導表達

將鑒定正確的重組載體pET-p30-54轉(zhuǎn)化至E.coliBL21 (DE3)感受態(tài)細胞中，次日挑取單個菌落接種于LB液體培養(yǎng)基37 ℃過夜培養(yǎng)，次日取200 μL菌液接種于20 mL含氨芐青霉素抗性的液體LB培養(yǎng)基中，加入1.0 mmol/L IPTG誘導6 h，收集菌液。

1.6 ASFV p30-54融合蛋白的SDS-PAGE檢測和 Western blot 分析

將收集的菌液12 000 r/min離心1 min，收集菌體，進行SDS-PAGE電泳分析。以ASFV陽性血清為一抗、辣根過氧化物酶標記的兔抗豬IgG為二抗，對重組融合蛋白進行Western blot 分析。

1.7 多克隆抗體制備、純化和特異性檢測

將 IPTG誘導后的菌液用超聲破碎，按照Ni親和層析柱的操作步驟進行p30-54融合蛋白的純化。將12只健康的昆明系小鼠分成試驗組和對照組，每組6只；將純化后的p30-54融合蛋白溶液終質(zhì)量濃度調(diào)整為1 mg/mL，與弗氏完全佐劑按體積比1∶1混合，制備免疫原；同時將0.01 mol/L、pH值為7.2的PBS緩沖液與弗氏完全佐劑按體積比1∶1混合作為對照；然后通過皮下多點注射分別注射試驗組和對照組小鼠，進行首次免疫，免疫劑量為200 μL；在首免10 d后進行第2次免疫，二免2周后采血，分離血清，利用商品化的ASFV ELISA抗體檢測試劑盒進行抗體檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組質(zhì)粒pT-p30-54的構(gòu)建與鑒定

pT-p30-54經(jīng)PCR擴增可得到與預(yù)期大小相符的1 140 bp目的基因片段(圖1)。經(jīng)雙酶切(EcoRⅠ和XhoⅠ)可得到1 140 bp的目的基因片段和2 692 bp的載體片段(圖2)。測序結(jié)果顯示，構(gòu)建的重組質(zhì)粒含有ASFV完整的p30-54基因序列(圖3)，表明成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pT-p30-54。

M.DNA Marker ；1—2.重組質(zhì)粒pT-p30-54；3.陰性對照

M.DNA Marker；1.pT-p30-54雙酶切；2.pT-p30-54單酶切

第1行為p30-54融合基因核苷酸序列：1—582位核苷酸為p30基因序列,583—1 140位核苷酸為p54基因序列；第2行為p30-54融合基因編碼的氨基酸序列

2.2 重組表達載體pET-p30-54的構(gòu)建與鑒定

重組質(zhì)粒利用特異性引物成功擴增出大小為1 140 bp的p30-54融合基因片段(圖4)。用EcoRⅠ和XhoⅠ酶切后得到1 140 bp的目的片段和5 369 bp的pET-28a(+)載體片段(圖5)。表明成功構(gòu)建了重組表達載體pET-p30-54。

2.3 ASFV p30-54融合蛋白的SDS-PAGE檢測及Western blot分析結(jié)果

SDS-PAGE檢測結(jié)果表明，ASFV融合蛋白p30-54在47.1 ku處有明顯條帶，與理論完全相符(圖6)。Western blot分析發(fā)現(xiàn)，表達的p30-54融合蛋白可與ASFV陽性血清發(fā)生免疫學反應(yīng)，提示融合蛋白p30-54具有反應(yīng)原性。

M.DNA Marker；1—3.pET-p30-54陽性克隆PCR擴增結(jié)果；4.陰性對照

M.DNA Marker；1.pET-p30-54；2.pET-p30-54雙酶切；3.pET-p30-54 單酶切

M.蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標準；1—3.pET-28a(+)空載體轉(zhuǎn)化菌株的誘導；6—8.pET-p30-54轉(zhuǎn)化菌株誘導的表達產(chǎn)物；9.Western blot分析

2.4 ASFV p30-54融合蛋白多克隆抗體的制備及特異性檢測結(jié)果

利用ASFV ELISA抗體檢測試劑盒對免疫小鼠的血清進行檢測，結(jié)果顯示，ASFV p30-54融合蛋白免疫的小鼠血清均呈陽性，而對照組小鼠血清均呈陰性，表明成功制備了小鼠抗ASFV p30-54融合蛋白抗體。

3 結(jié)論與討論

ASFV是目前已知的唯一DNA蟲媒病毒，基因組為線性雙鏈DNA，長度在170～190 kb[4-5]，編碼150～200個病毒蛋白，其中p30、p54、p72等結(jié)構(gòu)蛋白是該病毒與宿主細胞相互作用的主要蛋白[6,9-10]，不但在病毒黏附和侵入過程中發(fā)揮著重要的作用[9]，而且可誘導機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答[11]。Lacasta等[12]構(gòu)建了ASFV基因組表達文庫，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，含有ASFVp54、p30、p72和可溶性血凝蛋白(sHA)編碼基因的文庫可誘導機體產(chǎn)生較強的細胞免疫和體液免疫，表明p30、p54、p72等結(jié)構(gòu)蛋白具有較強的免疫原性和反應(yīng)原性。

目前，酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)是ASFV血清學檢測最常用的方法[13-15]，國外已經(jīng)研發(fā)出商品化的試劑盒。西班牙研制的ASFV ELISA抗體檢測試劑盒通過阻斷酶標記免疫吸附測定法，將ASFV抗原預(yù)包被于聚苯乙烯微孔板上，加入待檢樣品后，樣品中抗體將與其抗原結(jié)合，洗滌后加入酶標記抗體和底物顯色，從而檢測樣品中ASFV抗體水平。然而，進口的ELISA檢測試劑盒價格昂貴，限制了其廣泛使用，而國內(nèi)ASFV檢測試劑盒尚處于研發(fā)中。董志珍等[16]以原核表達的ASFV p30重組蛋白包被反應(yīng)板，樣本或標準品中的ASFV抗體能與酶標板中包被的p30抗原反應(yīng)，同時加入針對p30的酶標單克隆抗體后參與抗原表位的競爭，建立了一種檢測ASFV抗體的競爭ELISA試劑盒。Sastre等[17]建立了基于ASFV p72單抗的免疫層析法(LFA)，用于ASFV抗原的檢測。結(jié)果表明，建立的LFA方法與商品化的ELISA之間存在很好的相關(guān)性，雖然其敏感性略低于PCR方法(PCR檢測陽性率為38%，LFA為27%)，但明顯高于ELISA檢測試劑盒。該方法適用于野外測試野生動物，并可用于設(shè)備簡陋的實驗室。Kazakova等[8]利用原核表達系統(tǒng)表達了p30蛋白，通過免疫印跡試驗評估了p30 重組蛋白對ASFV抗體的檢測能力，對試驗性和自然感染ASFV的家豬和野豬血清樣品進行了檢測，其特異性和敏感性可達98.75%和100%，并且感染6～8周后血清樣品即可檢測出特異性的ASFV抗體。

近年來，中國養(yǎng)豬業(yè)正面臨著ASF傳入的嚴峻威脅，尤其是新疆北部，新疆邊境線長達5 600 km，雖然與俄羅斯接壤地區(qū)目前尚未發(fā)生ASF疫情，但隨著ASF疫情的不斷擴散，新疆具有極大的傳入風險，可能成為該病傳入我國的一個重要窗口。為此，我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布了《非洲豬瘟疫情應(yīng)急預(yù)案》，嚴防該病從境外傳入我國。因此，研發(fā)ASFV特異、敏感的檢測試劑對于防范ASF傳入我國具有十分重要的現(xiàn)實意義。本研究表達了ASFV p30-54融合蛋白，并成功制備了抗該融合蛋白的多克隆抗體，為研發(fā)ASFV診斷試劑奠定了基礎(chǔ)。