大白菜BrCOX11基因的克隆及表達(dá)分析

魏小春，原玉香，趙艷艷，王志勇，楊雙娟，鄭小蘭，段俊枝，張曉偉*

(1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 園藝研究所,河南 鄭州 450002； 2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)與信息研究所，河南 鄭州 450002)

細(xì)胞色素C氧化酶(Cytochrome C oxidase，COX)也稱細(xì)胞色素氧化酶，能夠以氧化磷酸化的方式為細(xì)胞供能。細(xì)胞色素C氧化酶作為線粒體呼吸鏈組成的關(guān)鍵部分，對細(xì)胞提供能量至關(guān)重要。它是位于線粒體電子傳遞鏈上的一種氧化酶、膜蛋白酶，并且是呼吸鏈中電子受體的最后一個。細(xì)胞色素C氧化酶是線粒體電子傳遞鏈復(fù)合體的多亞基末端氧化酶，在三磷酸腺苷生產(chǎn)調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用[1-2]。其活性受張力、膜脂質(zhì)環(huán)境、激素調(diào)節(jié)以及蛋白質(zhì)修飾的影響[2-4]。細(xì)胞色素C氧化酶一般含有4～13個亞基，亞基數(shù)目在不同生物中不等。COX11是核基因編碼的線粒體蛋白，在生物體中的主要功能是在組裝過程中將Cu插入COX復(fù)合物。COX11蛋白家族的幾個成員已被證明在向COX亞基Ⅰ遞送過程中起關(guān)鍵作用[5-6]。COX10和COX11在球形紅菌(Rhodobactersphaeroides)中起到和細(xì)胞色素氧化酶亞基Ⅱ、Ⅲ的蛋白質(zhì)分子伴侶功能[7]。研究發(fā)現(xiàn)，COX11具有消除活性氧的功能，是真核生物的一個新的細(xì)胞程序性凋亡(PCD)的抑制因子。與野敗型細(xì)胞質(zhì)雄性不育基因WA352的互作干擾了COX11的正常功能，導(dǎo)致水稻花藥絨氈層線粒體的活性氧暴發(fā)和細(xì)胞色素C釋放到細(xì)胞漿(這是PCD的誘導(dǎo)因素)，提前啟動PCD控制的絨氈層降解，從而產(chǎn)生花粉敗育[8]。

大白菜(Brassicarapassp.pekinensis)為蕓薹屬葉用蔬菜(基因組AA，2n=20)。作為重要的蔬菜作物在中國乃至全球種植，年產(chǎn)值在600億元以上。在我國種植面積達(dá)270萬hm2以上，占全國蔬菜總種植面積的15%左右[9-11]，然而尚未有關(guān)大白菜COX11基因(BrCOX11)的報道，為此開展大白菜COX11基因克隆和表達(dá)分析，旨在為COX11基因功能的鑒定提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試材料大白菜為河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所選育的Ogura雄性不育系Tyms、Polima雄性不育系22 m2、保持系Y231-330、抗根腫病DH系Y635-10、感根腫病DH系Y177-47。所有材料于2016年在河南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究開發(fā)基地種植，統(tǒng)一栽培管理。根腫病材料鑒定參考河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所生物育種實驗室建立的方法進(jìn)行：在培養(yǎng)間內(nèi)培育材料，培養(yǎng)條件16 h光照/8 h黑暗、光照強(qiáng)度120 μmol/(m2·s)、溫度(22±2)℃。采用灌根接種法鑒定抗性。每個小區(qū)定植27株幼苗，制備根懸浮液，每個材料灌根10～35 d，之后對根部進(jìn)行逐一分級調(diào)查[12]。

1.2 大白菜總RNA提取和反轉(zhuǎn)錄

RNA提取參照Trizol法，以RNA作為模板反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.3 基因引物設(shè)計與合成

根據(jù)相關(guān)序列設(shè)計引物(表1)，由深圳華大基因科技服務(wù)有限公司合成。

表1 大白菜基因克隆及其表達(dá)檢測所用引物

1.4 BrCOX11基因3′RACE及cDNA全長克隆

轉(zhuǎn)錄組測序Denovo組裝結(jié)果片段，設(shè)計引物進(jìn)行3′RACE(SMARTer RACE cDNA Amplification Kit,Clontech)，按照獲得的完整編碼區(qū)設(shè)計引物擴(kuò)增cDNA全長。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性 5 min；95 ℃ 變性30 s，54 ℃ 退火3 min，72 ℃延伸1 min，35次循環(huán)。

采用瓊脂糖凝膠電泳檢測產(chǎn)物，檢測合格后回收片段，連接Infusion克隆載體(In-Fusion HD Cloning Kit,Clontech)，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，檢測得到陽性單克隆，之后測序。DNA MarkerⅢ為DL 5000(Takara,Dalian)。

1.5 序列分析

按照目的基因序列，在NCBI的Blastp工具欄對所編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行同源序列比對，用Clustal X軟件進(jìn)行序列比對分析，用MEGA 7.0軟件構(gòu)建進(jìn)化樹，用ProtParam軟件分析BrCOX11基因編碼的氨基酸理化性質(zhì)，用SOPMA(Secondary structure prediction method)預(yù)測分析蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)，用軟件BaCelLo(Balanced subcellular localization predictor)進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測，用軟件ProtScale分析氨基酸序列的親水性/疏水性。

1.6 基因表達(dá)分析

提取大白菜葉片、根部及花蕾總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。定量PCR反應(yīng)體系為20.0 μL[10 μL 2×SYBR?Premix ExTaqTM(Tli RNaseH Plus)，2 μL cDNA，上、下游引物(qCOX11F及qCOX11R)各1 μL(引物濃度10 μmol/L)，6 μL ddH2O]。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，40次循環(huán)。每個樣品重復(fù)3次。內(nèi)參基因為Actin。采用羅氏公司LightCycler?480Ⅱ?qū)崟r熒光定量PCR儀，對目的基因進(jìn)行實時熒光定量PCR擴(kuò)增。用2-△△CT法計算基因相對表達(dá)量[13]。

大白菜組織特異性及根腫病數(shù)據(jù)來自 SRR643621、SRR643622、SRR643623、SRR643624、SRR643625、SRR643626、SRR643627、SRR643628、SRR3571023、SRR3571024。相對表達(dá)量為FPKM[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 大白菜BrCOX11基因克隆

根據(jù)3′RACE結(jié)果(圖1A)，組裝成完整編碼區(qū)，設(shè)計引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，凝膠電泳，觀察條帶可以看出目的片段大小為1 300 bp左右(圖1B)，將所需的片段回收，然后連接、轉(zhuǎn)化，進(jìn)行單克隆測序。該基因與數(shù)據(jù)庫中目的片段相同，具有完整的ORF，為861 bp，編碼286個氨基酸，命名為BrCOX11。

圖1 大白菜BrCOX11基因PCR擴(kuò)增

2.2 BrCOX11基因編碼氨基酸序列同源性分析

通過比對分析大白菜BrCOX11基因的序列，發(fā)現(xiàn)其編碼蛋白質(zhì)有COX11結(jié)構(gòu)域(圖2)。用Clustal X進(jìn)行多重比對分析發(fā)現(xiàn)，大白菜與其他作物COX11氨基酸序列高度相似，是COX家族的一員(圖3)。

圖2 大白菜BrCOX11結(jié)構(gòu)域預(yù)測

2.3 BrCOX11蛋白理化性質(zhì)預(yù)測及親水性分析

用ProtParam軟件預(yù)測大白菜BrCOX11氨基酸的理化性質(zhì)，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量32.206 ku，理論等電點8.75，分子式C1 434H2 214N386O435S12，脂肪系數(shù)66.78，疏水性平均值-0.394。含量最高的氨基酸是絲氨酸(相對含量達(dá)到10.5%)，色氨酸和半胱氨酸含量較低。疏水性平均值小于零，說明BrCOX11是親水性蛋白。

2.4 BrCOX11蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

用SOPMA軟件分析BrCOX11蛋白的二級結(jié)構(gòu)：α-螺旋(h) 21.68%、延伸鏈(e)20.63%、β-轉(zhuǎn)角(t) 5.24%、無規(guī)則卷曲(c) 52.45%，多肽鏈通過形成二級結(jié)構(gòu)來給BrCOX11蛋白提供穩(wěn)定的空間(圖4)。

圖3 大白菜BrCOX11氨基酸序列比對

圖4 大白菜BrCOX11氨基酸二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

2.5 BrCOX11蛋白進(jìn)化樹分析

用Blastp進(jìn)行同源性檢索，用MEGA 7.0構(gòu)建進(jìn)化樹?？梢钥闯觯蟀撞薆rCOX11與蕓薹屬、擬南芥屬及蘿卜屬親緣關(guān)系最近；而與棉花屬、胡蘿卜屬和黃瓜屬等親緣關(guān)系較遠(yuǎn)(圖5)。

圖5 大白菜及其他物種COX11蛋白進(jìn)化樹分析

2.6 大白菜BrCOX11基因表達(dá)分析

從圖6可以看出，無論抗根腫病材料還是感根腫病材料，BrCOX11基因在根腫菌侵染后的根部組織中表達(dá)上調(diào)，而在根腫菌侵染后的葉片組織中下調(diào)。

177-47CK、177-47T、L177-47CK、L177-47T分別為感根腫病DH系Y177-47接菌前地下部分、接菌后地下部分、接菌前葉片部分、接菌后葉片部分；635-10CK、635-10T、L635-10CK、L635-10T分別為抗根腫病DH系Y635-10接菌前地下部分、接菌后地下部分、接菌前葉片部分、接菌后葉片部分圖6 BrCOX11基因在大白菜抗根腫病DH系Y635-10、感根腫病DH系Y177-47中的相對表達(dá)量

從圖7可以看出，BrCOX11基因在大白菜不同組織器官如根、莖、葉、果莢中的表達(dá)量均不相同，其中，在果莢中表達(dá)量最高。

圖7 BrCOX11基因在大白菜不同組織器官中的相對表達(dá)量

從圖8中可以看出，BrCOX11在大白菜Ogura雄性不育系Tyms 和Polima雄性不育系22m2中表達(dá)量明顯低于其共同保持系Y231-330中的表達(dá)量。

圖8 BrCOX11基因在大白菜雄性不育系Tyms 、22m2及保持系Y231-330中的相對表達(dá)量

3 結(jié)論與討論

通過對在雜交稻中廣泛利用的野敗型細(xì)胞質(zhì)雄性不育(Cytoplasmic male sterility，CMS)基因WA352的克隆，發(fā)現(xiàn)該基因由多個功能未知的線粒體基因片段重組而成。研究發(fā)現(xiàn)，COX11具有消除活性氧的功能，是真核生物保守的一個新的細(xì)胞程序性凋亡抑制因子，與WA352蛋白的互作干擾了COX11的正常功能，導(dǎo)致水稻花藥絨氈層線粒體的活性氧暴發(fā)和細(xì)胞色素C釋放到細(xì)胞漿，提前啟動PCD控制的絨氈層降解，從而產(chǎn)生花粉敗育[8]。為了闡明植物線粒體新基因的起源進(jìn)化機(jī)制，又對800多份野生稻和栽培稻材料的線粒體基因組進(jìn)行序列分析，發(fā)現(xiàn)11種與WA352相關(guān)的重組結(jié)構(gòu)，3個新的CMS基因WA352a、WA352b、WA314。證明這些CMS新基因是由2個結(jié)構(gòu)相似但沒有CMS功能的原基因通過序列變異和自然選擇，獲得了與COX11的互作能力即功能化演化而來，將有助于進(jìn)一步了解CMS基因和恢復(fù)基因協(xié)同進(jìn)化和互作的分子機(jī)制[15]。

COX11在花粉發(fā)育乃至植物生長發(fā)育的整個過程起著重要作用。COX11的敲除和過表達(dá)都會干擾蛋白質(zhì)的功能，并具有顯著的表型效果。研究表明，敲除擬南芥AtCOX11基因抑制植物的根生長；高水平的COX11可導(dǎo)致其蛋白質(zhì)失去活性[16]。AtCOX11在擬南芥中不僅有供應(yīng)能量的功能，而且通過不相關(guān)的功能，促進(jìn)花粉萌發(fā)[17]。AtCOX11還參與水稻中COX11同源物的ROS代謝調(diào)控[8]。COX11啟動子主要活躍在具有高分裂和/或高代謝率的組織，例如胚胎吸收過程中的COX11啟動子，在發(fā)芽前需要區(qū)分、并修復(fù)其線粒體所產(chǎn)生的活性氧[18]。所有活躍組織都取決于呼吸鏈復(fù)合物的連續(xù)形成，因此需要足夠量的組裝因子如COX11。在這方面，它類似于與COX功能相關(guān)的其他基因的表達(dá)模式，例如COX組裝因子HCC1(用于同源物銅伴侶SCO1)[19]，COX亞基COX5b-1[20]和細(xì)胞色素C編碼基因CYCT-1和CYCT-2[21]。

BrCOX11基因的表達(dá)量在大白菜不同的組織器官中存在明顯差異，可能與組織特異性有一定的關(guān)系[22-23]。BrCOX11基因在抗根腫病和感根腫病材料以及大白菜地上及地下部分的表達(dá)量存在不同，說明該基因的表達(dá)量和大白菜是否抗根腫病也有一定的關(guān)系。BrCOX11基因的表達(dá)量在Ogura雄性不育系Tyms 和Polima雄性不育系22m2、保持系Y231-330中的相對表達(dá)量存在不同，在保持系中的相對表達(dá)量較高，說明該基因的表達(dá)可能與花粉發(fā)育及雄性不育有關(guān)。