光質(zhì)對(duì)莧菜愈傷組織生長(zhǎng)及甜菜色素和類(lèi)胡蘿卜素合成的影響

張媛媛，張心雨，2，張毛毛，梁 珥，潘君飛，2，劉生財(cái)，2*

(1.福建農(nóng)林大學(xué) 園藝學(xué)院，福建 福州 350002; 2.福建農(nóng)林大學(xué) 園藝植物生物工程研究所，福建 福州 350002)

莧菜(AmaranthustricolorL.)中富含甜菜色素、類(lèi)胡蘿卜素等，因其取材及色素提取較為方便，是提取和研究甜菜色素與類(lèi)胡蘿卜素的重要資源。光質(zhì)是植物生長(zhǎng)和發(fā)育不可缺少的環(huán)境因子，對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育、光合作用、基因表達(dá)、次生代謝產(chǎn)物的合成積累有著重要的影響[1-3]。近年來(lái)，學(xué)者們圍繞光質(zhì)對(duì)植物愈傷組織生長(zhǎng)及其次生代謝產(chǎn)物含量影響展開(kāi)了多方面的研究[4-9]。Anna等[10]研究表明，紅光降低了風(fēng)信子愈傷組織中類(lèi)胡蘿卜素的含量。許莉等[11]研究發(fā)現(xiàn)，與白光相比，黃光、紅光、藍(lán)光均降低了葉用萵苣中類(lèi)胡蘿卜素的含量。目前，光質(zhì)對(duì)莧菜愈傷組織中甜菜色素含量的影響還沒(méi)有相關(guān)報(bào)道，為此，本試驗(yàn)以莧菜愈傷組織為初始材料，將其置于不同光質(zhì)下培養(yǎng)，探究光質(zhì)對(duì)莧菜愈傷組織中甜菜色素及類(lèi)胡蘿卜素合成的影響，旨在為產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)甜菜色素和類(lèi)胡蘿卜素提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

福建農(nóng)林大學(xué)園藝植物生物工程研究所誘導(dǎo)保存的莧菜愈傷組織。

1.2 不同光質(zhì)處理莧菜愈傷組織及其形態(tài)觀察

以莧菜愈傷組織為材料，選取干燥、質(zhì)地松軟、生長(zhǎng)狀態(tài)良好且一致的莧菜愈傷組織接種到MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基中(含2，4-D 0.5 mg/L 、6-BA 6.0 mg/L、蔗糖 30 g/L、瓊脂 7 g/L，pH值5.8)繼代增殖培養(yǎng)，培養(yǎng)周期30 d。增殖培養(yǎng)后，選取生長(zhǎng)狀態(tài)一致的莧菜愈傷組織接種在培養(yǎng)基中(MS+ 2，4-D 0.5 mg/L、6-BA 6.0 mg/L、蔗糖 30 g/L、瓊脂 7 g/L，pH值5.8)，每瓶接種4塊，每塊約0.2 g，共接種180瓶。將其平均分為6組，分別置于藍(lán)光、白光、綠光、紅光、遠(yuǎn)紅光、黑暗(CK)6種不同光質(zhì)條件下進(jìn)行培養(yǎng)。不同光源技術(shù)參數(shù)如表1所示。光照時(shí)長(zhǎng)16 h/d，培養(yǎng)溫度(25±2)℃，培養(yǎng)30 d，在培養(yǎng)的第3、7、14、21、28天時(shí)拍照、觀察并記錄其形態(tài)。

表1 不同光源技術(shù)參數(shù)

1.3 測(cè)定項(xiàng)目及方法

1.3.1 甜菜色素的提取與測(cè)定 由于綠光、紅光、遠(yuǎn)紅光及黑暗條件下莧菜愈傷組織表面并沒(méi)有變紅，所以只進(jìn)行藍(lán)光及白光處理下甜菜色素的提取及含量測(cè)定。分別稱(chēng)取藍(lán)光及白光處理下的莧菜愈傷組織0.05 g，在液氮中研磨，之后迅速加入1 mL預(yù)冷甲醇，劇烈振蕩混勻，置于 4 ℃條件下30 min，12 000 r/min離心10 min，去上清液。用雙蒸水重懸沉淀，置于4 ℃ 條件下30 min，12 000 r/min離心10 min，取上清液，用紫外分光光度計(jì)分別在538 nm和465 nm下測(cè)甜菜紅素和甜菜黃素含量，二者含量之和作為甜菜色素總量。每種光質(zhì)進(jìn)行3次重復(fù)。

1.3.2 類(lèi)胡蘿卜素提取及條件優(yōu)化 取莧菜愈傷組織，放在玻璃研缽中磨成粉狀，準(zhǔn)確稱(chēng)取0.3 g放入具塞的三角瓶中，以丙酮(分析純級(jí))、石油醚(分析純級(jí))及氯仿(分析純級(jí))作為浸提溶液 ，研究不同浸提溶液、配比和時(shí)間對(duì)莧菜愈傷組織中類(lèi)胡蘿卜素提取效果的影響，具體設(shè)計(jì)見(jiàn)表2。提取后的溶液用紫外分光光度計(jì)在445 nm下測(cè)定類(lèi)胡蘿卜素含量,以篩選得到類(lèi)胡蘿卜素最佳提取條件，研究6種光質(zhì)對(duì)莧菜愈傷組織中類(lèi)胡蘿卜素含量的影響。

表2 莧菜愈傷組織中類(lèi)胡蘿卜素浸提溶液及浸提時(shí)間

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

用Excel及SPSS 19.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同光質(zhì)對(duì)莧菜愈傷組織形態(tài)的影響

不同光質(zhì)處理下，莧菜愈傷組織的生長(zhǎng)及形態(tài)質(zhì)地有明顯差異。如圖1所示，藍(lán)光處理下莧菜愈傷組織產(chǎn)生的甜菜色素的量隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加而增加(圖1A1、A5)，處理第28天時(shí)，藍(lán)光處理下的莧菜愈傷組織表面紅色物質(zhì)產(chǎn)生量較多，質(zhì)地較密實(shí)(圖1A5)；白光處理下莧菜愈傷組織產(chǎn)生的甜菜色素隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加而增加，但產(chǎn)生的量少于藍(lán)光處理(圖1B1、 B5)，處理第28天時(shí)，白光處理下的莧菜愈傷組織表面產(chǎn)生少量的紅色物質(zhì)，質(zhì)地松軟，呈塊狀(圖1B5)；綠光處理下莧菜愈傷組織表面沒(méi)有紅色物質(zhì)產(chǎn)生(圖1C2、 C5)，處理第28天時(shí)，莧菜愈傷組織表面呈現(xiàn)微黃色、透明塊狀(圖1C5)；紅光處理下莧菜愈傷組織表面沒(méi)有紅色物質(zhì)產(chǎn)生(圖1D2 、D5)，處理第28天時(shí)，莧菜愈傷組織表面呈現(xiàn)透明乳白色，質(zhì)地松軟(圖1D5)；遠(yuǎn)紅光處理下的莧菜愈傷組織表面沒(méi)有紅色物質(zhì)產(chǎn)生(圖1E2、 E5)，處理第28天時(shí)，莧菜愈傷組織表面呈現(xiàn)微黃色、透明塊狀(圖1E5)；黑暗條件下莧菜愈傷組織表面沒(méi)有紅色物質(zhì)的產(chǎn)生(圖1F2 、F5)，處理第28天時(shí)，莧菜愈傷組織表面呈現(xiàn)白色疏松、半透明塊狀(圖1F5)。相同培養(yǎng)時(shí)間，藍(lán)光、白光處理下莧菜愈傷組織表面有紅色物質(zhì)產(chǎn)生，且藍(lán)光處理下紅色物質(zhì)產(chǎn)生較多，但綠光、紅光、遠(yuǎn)紅光處理以及黑暗條件下的莧菜愈傷組織表面并沒(méi)有紅色物質(zhì)產(chǎn)生。由此可知，藍(lán)光對(duì)莧菜愈傷組織中甜菜色素的產(chǎn)生有明顯促進(jìn)作用。

A：藍(lán)光、B：白光、C：綠光、D：紅光、E：遠(yuǎn)紅光、F：黑暗；1、2、3、4、5分別代表處理第3天、第7天、第14天、第21天、第28天 圖1 不同光質(zhì)對(duì)莧菜愈傷組織形態(tài)的影響

2.2 不同光質(zhì)對(duì)莧菜愈傷組織中甜菜色素含量的影響

對(duì)藍(lán)光和白光處理下莧菜愈傷組織中甜菜色素含量進(jìn)行測(cè)定。通過(guò)表3可以看出，藍(lán)光處理下莧菜愈傷組織中甜菜紅素、甜菜黃素及甜菜色素總量均顯著高于白光處理。藍(lán)光處理下莧菜愈傷組織中甜菜紅素、甜菜黃素和甜菜色素總量分別為(0.109 3±0.011 2)mg/g，(0.037 8±0.005 3)mg/g和(0.147 0±0.013 3)mg/g，分別是白光處理下的5.28倍、2.33倍和3.99倍。說(shuō)明藍(lán)光對(duì)莧菜愈傷組織中甜菜紅素和甜菜黃素含量均有促進(jìn)作用。

表3 藍(lán)光和白光對(duì)莧菜愈傷組織中甜菜色素含量的影響 mg/g

注：同行數(shù)據(jù)后不同小寫(xiě)字母表示在0.05水平差異顯著，下同。

2.3 莧菜愈傷組織中類(lèi)胡蘿卜素浸提溶液及浸提時(shí)間篩選

在篩選莧菜愈傷組織中類(lèi)胡蘿卜素浸提溶液時(shí)發(fā)現(xiàn)(表4)，單一試劑以石油醚、氯仿浸提類(lèi)胡蘿卜素8、6 h效果最佳，與高桂珍等[12]對(duì)油菜種子類(lèi)胡蘿卜素總含量測(cè)定結(jié)果一致，這可能是因?yàn)槭兔?、氯仿?duì)類(lèi)胡蘿卜素有破壞作用。丙酮為浸提溶液，浸提4 h，類(lèi)胡蘿卜素提取量為22.4 mg/kg；浸提6 h，類(lèi)胡蘿卜素提取量為23.6 mg/kg；浸提8 h，類(lèi)胡蘿卜素提取量為24.0 mg/kg。石油醚為浸提溶液，浸提4 h，類(lèi)胡蘿卜素提取量為28.0 mg/kg；浸提6 h，類(lèi)胡蘿卜素提取量為22.4 mg/kg；浸提8 h，類(lèi)胡蘿卜素提取量為40.8 mg/kg。氯仿為浸提溶液，浸提4 h，類(lèi)胡蘿卜素提取量為23.6 mg/kg；浸提6 h，類(lèi)胡蘿卜素提取量為38.8 mg/kg；浸提8 h，類(lèi)胡蘿卜素提取量為35.2 mg/kg。丙酮∶石油醚為1∶1的混合浸提溶液，浸提4 h，類(lèi)胡蘿卜素提取量為28.0 mg/kg；浸提6 h，類(lèi)胡蘿卜素提取量為25.6 mg/kg；浸提8 h，類(lèi)胡蘿卜素提取量為64.0 mg/kg。丙酮∶氯仿為2∶1的混合浸提溶液，浸提8 h，類(lèi)胡蘿卜素提取量為23.2 mg/kg。石油醚∶氯仿為1∶1的混合浸提溶液，浸提8 h，類(lèi)胡蘿卜素提取量為44.0 mg/kg?？傮w來(lái)看，類(lèi)胡蘿卜素的提取量隨著浸提時(shí)間的增加而增高，但其穩(wěn)定性較低，因此浸提時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)。對(duì)單一溶劑提取8 h的效果進(jìn)行比較，類(lèi)胡蘿卜素提取量依次為石油醚>氯仿>丙酮。對(duì)混合浸提劑提取8 h的效果進(jìn)行比較，類(lèi)胡蘿卜素提取量依次為丙酮+石油醚>石油醚+氯仿>丙酮+氯仿。由此可以看出，丙酮、石油醚以1∶1混合為浸提溶液，料液比1∶100(g/mL)，提取時(shí)間8 h，可使莧菜愈傷組織中類(lèi)胡蘿卜素達(dá)到最佳提取效果。

表4 不同浸提溶液及浸提時(shí)間對(duì)莧菜愈傷組織中類(lèi)胡蘿卜素的提取效果

2.4 不同光質(zhì)對(duì)莧菜愈傷組織中類(lèi)胡蘿卜素含量的影響

從表5可以看出，藍(lán)光處理下莧菜愈傷組織中類(lèi)胡蘿卜素含量為(0.218 1±0.008 2)mg/g，白光處理下莧菜愈傷組織中類(lèi)胡蘿卜素含量為(0.145 9±0.007 0)mg/g，綠光處理下莧菜愈傷組織中類(lèi)胡蘿卜素含量為(0.053 33±0.001 3)mg/g，紅光處理下莧菜愈傷組織中類(lèi)胡蘿卜素含量為(0.030 8±0.000 6)mg/g，遠(yuǎn)紅光處理下莧菜愈傷組織中類(lèi)胡蘿卜素含量為(0.046 9±0.001 6)mg/g，黑暗處理下莧菜愈傷組織中類(lèi)胡蘿卜素含量為(0.027 2±0.001 2) mg/g。不同光質(zhì)對(duì)莧菜愈傷組織中類(lèi)胡蘿卜素含量的影響依次為藍(lán)光>白光>綠光>遠(yuǎn)紅光>紅光>黑暗，藍(lán)光對(duì)莧菜愈傷組織中類(lèi)胡蘿卜素的含量有明顯的促進(jìn)作用。

表5 不同光質(zhì)對(duì)莧菜愈傷組織中類(lèi)胡蘿卜素含量的影響 mg/g

3 結(jié)論與討論

3.1 不同光質(zhì)對(duì)莧菜愈傷組織中甜菜色素和類(lèi)胡蘿卜素合成的影響

光質(zhì)是影響植物愈傷組織次生代謝產(chǎn)物合成的重要環(huán)境因素之一，并且不同光質(zhì)對(duì)其影響存在差異。本研究結(jié)果顯示，以黑暗為CK，藍(lán)光、白光對(duì)莧菜愈傷組織中甜菜色素含量的影響程度最大，且影響程度依次為藍(lán)光>白光。黃歡等[13]對(duì)鹽地堿蓬研究發(fā)現(xiàn)，黑暗誘導(dǎo)幼苗中甜菜色素的積累，而光照則抑制了其積累；然而在愈傷組織中的影響則相反，光照促進(jìn)了甜菜色素的積累，不同光質(zhì)對(duì)鹽地堿蓬甜菜色素誘導(dǎo)作用不同，白光的誘導(dǎo)效果最好，藍(lán)光次之。甜菜色素的穩(wěn)定性受酸堿度、光、熱等因素的影響，一般以甜菜色素葡糖苷的形式存在，當(dāng)pH 值為2.5～7.0時(shí)比較穩(wěn)定，當(dāng)pH值<2.0或pH值>9.0時(shí)甜菜紅素降解，堿性條件下轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色的甜菜黃素；溫度愈高，甜菜色素的穩(wěn)定性愈差，易產(chǎn)生色變，而低溫(低于10 ℃)條件下穩(wěn)定性較好；光質(zhì)的變化可以導(dǎo)致甜菜色素化學(xué)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化或者加速其氧化過(guò)程，從而加快色變的速度[14]。試驗(yàn)中綠光、紅光、遠(yuǎn)紅光、黑暗下的莧菜愈傷組織表面沒(méi)有紅色物質(zhì)產(chǎn)生，這可能與pH值、溫度以及光照的影響有關(guān)，需進(jìn)一步研究。

吳鑠溟等[15]研究表明，白光和藍(lán)光照射培養(yǎng)下的蛹蟲(chóng)草菌絲體的類(lèi)胡蘿卜素含量顯著高于紅光和黃光條件下，黑暗條件下沒(méi)有檢測(cè)到類(lèi)胡蘿卜素的生成。本研究結(jié)果顯示，不同光質(zhì)對(duì)莧菜愈傷組織中類(lèi)胡蘿卜素含量的影響程度依次為藍(lán)光>白光>綠光>遠(yuǎn)紅光>紅光，此結(jié)果與前人對(duì)風(fēng)信子、萵苣的研究結(jié)果不一致[10-11]。針對(duì)不一致的結(jié)論分析認(rèn)為，不同植物的感光能力不同，不同光質(zhì)觸發(fā)不同光受體，進(jìn)而影響植物的光合特性、生長(zhǎng)發(fā)育、抗逆、衰老及次生代謝產(chǎn)物合成等。

3.2 類(lèi)胡蘿卜素提取條件的優(yōu)化及效果

植物中類(lèi)胡蘿卜素一般均能溶于丙酮和石油醚，單一溶劑中石油醚的溶解性高于丙酮和氯仿，溶劑混合使用比單一使用提取效果好。丙酮與石油醚以1∶1混合為提取液，料液比1∶100(g/mL)，提取時(shí)間8 h，可使莧菜愈傷組織中類(lèi)胡蘿卜素達(dá)到最佳提取效果。學(xué)者們圍繞類(lèi)胡蘿卜素的提取條件展開(kāi)了大量研究[16-19]，其中，楊?yuàn)櫟萚16]通過(guò)試驗(yàn)得出柑橘皮中類(lèi)胡蘿卜素的最佳提取條件為乙醇∶乙酸乙酯∶正己烷3∶1∶1混合，溫度40 ℃，提取時(shí)間50 min，料液比為1∶10 (g/mL)。袁旭紅等[17]利用復(fù)合酶法提取沙棘類(lèi)胡蘿卜素，最佳提取條件為纖維素酶∶果膠酶2∶1、酶解溫度30 ℃、酶解時(shí)間25 min、酶加入量0.20%、酶解pH值7，提取率為89.99%。李世紅等[18]研究認(rèn)為，利用無(wú)水乙醇作為提取液，料液比1∶60(g/mL)、提取時(shí)間180 min、提取溫度55 ℃，可使西蘭花中類(lèi)胡蘿卜素達(dá)到最佳提取效果。

3.3 結(jié)論

藍(lán)光和白光可以誘導(dǎo)莧菜分化出紅色愈傷組織，而其他光質(zhì)誘導(dǎo)的愈傷組織呈黃色或白色；與黑暗相比，藍(lán)光最有利于莧菜愈傷組織中甜菜色素、類(lèi)胡蘿卜素的合成，白光次之，其他光質(zhì)無(wú)法合成甜菜紅素；莧菜愈傷組織中類(lèi)胡蘿卜素最佳提取條件是采用丙酮與石油醚比為1∶1混合提取溶液，莧菜愈傷組織與提取液比為1∶100(g/mL)，提取時(shí)間8 h。