Mito-cpYFP cDNA轉(zhuǎn)基因小鼠的建立及其自由基分布規(guī)律的初步探討*

戴 優(yōu)， 郭靜科， 陳 琦， 劉樹(shù)滔， 周建武， 柯李晶， 饒平凡△

(1浙江工商大學(xué)中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院-浙江工商大學(xué)食品營(yíng)養(yǎng)科學(xué)聯(lián)合研究中心， 浙江 杭州 310012； 2福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院， 福建 福州 350108)

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)C57BL/6小鼠、昆明小鼠及ICR鼠均由浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，雌雄不限，6～8周齡，控光(12 h 明暗相間)，自由飲水和采食。所有操作均符合倫理學(xué)要求。

2 主要試劑

DNA Marker (Thermo Fisher Scientific)；瓊脂糖(Bio-west)； Premix Taq DNA Polymerase和反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)； Triton X-100和Trizma? hydrochloride solution (Sigma)； Proteinase K (Merck)； Tris (Bio Basic)； RNA和DNA提取試劑盒(上海生工)；RIPA裂解液(碧云天)；抗GAPDH抗體(Cell Signaling Technology)；其余生化試劑均為進(jìn)口或?yàn)閲?guó)產(chǎn)分析純。所用引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

RGS7: regulator of G-protein signaling 7; F: Forward; R: Reverse.

3 主要方法

3.1Mito-cpYFP基因表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 本實(shí)驗(yàn)使用的質(zhì)粒為pRP(Exp)-CAGG>mito-cpYFP，由福州大學(xué)生物工程研究所贈(zèng)送。質(zhì)粒圖譜信息見(jiàn)圖1，其中mito-cpYFP cDNA全長(zhǎng)為810 bp[10]。

Figure 1. Structure map of pRP(Exp)-CAGG>mito-cpYFP vector. f1 ori: origin of f1 phage replication; Ampicillin: sequence of ampicillin resistance gene; pUC ori: origin of plasmid; SV40 pA: sequence of simian vacuolating virus 40 polyA sequence; Kozak: Kozak consensus sequence; CAGG: promoter sequence.

圖1載體pRP(Exp)-CAGG>mito-cpYFP的圖譜

3.2mito-cpYFP cDNA轉(zhuǎn)基因小鼠的建立 取6周齡體型健碩的C57BL/6母鼠，注射孕馬血清促性腺激素，48 h后注射人絨毛膜促性腺激素，隨后與公鼠合籠交配。次日檢查母鼠陰栓，有陰栓者作為供體母鼠，取其受精卵進(jìn)行體外培養(yǎng)；與此同時(shí)，將輸精管結(jié)扎成功的6周齡ICR公鼠與母鼠合籠，次日檢查母鼠陰栓，有陰栓者作為代孕鼠。待受精卵出現(xiàn)大而清晰的原核時(shí)，通過(guò)顯微注射將含有目的基因片段的質(zhì)粒注射入體外培養(yǎng)的受精卵內(nèi)。將注入質(zhì)粒后存活良好的受精卵注射入代孕鼠的輸卵管中，每只代孕鼠移植30枚左右的受精卵。待代孕鼠移植19～20 d后自然生產(chǎn)。

3.3轉(zhuǎn)基因小鼠基因型的鑒定

3.3.1DNA的鑒定 取新生3周的小鼠尾巴約5 mm組織提取DNA，采用巢式PCR法進(jìn)行PCR鑒定，使用的引物為表1中的cpYFP-1和RGS7。PCR反應(yīng)條件為:94 ℃預(yù)變性3 min；隨后94 ℃變性30 s，60 ℃退火35 s，72 ℃延伸35 s，38個(gè)循環(huán)；擴(kuò)展72 ℃ 5 min。取得產(chǎn)物后，用1.5%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，溴化乙啶染色后于凝膠成像系統(tǒng)中觀察結(jié)果。

3.3.2mRNA的鑒定 同3.3.1步驟，對(duì)子代小鼠mRNA進(jìn)行提取，并進(jìn)行RT-PCR鑒定。為保證目的基因(mito-cpYFP)鑒定的準(zhǔn)確率，本文設(shè)計(jì)了2對(duì)引物，分別為cpYFP-1和cpYFP-2，序列見(jiàn)表1。反應(yīng)條件與DNA擴(kuò)增條件相同。獲得產(chǎn)物后，置于1.5%的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，用凝膠成像系統(tǒng)采集圖像并觀察結(jié)果。

3.4mito-cpYFP cDNA轉(zhuǎn)基因小鼠的熒光鑒定與分布 mito-cpYFP被氧化后，在488 nm的激發(fā)光照射下，可產(chǎn)生525 nm的綠色熒光。利用該特點(diǎn)，對(duì)經(jīng)PCR及RT-PCR鑒定為陽(yáng)性的新生F0代轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行熒光觀察。鑒定是否出現(xiàn)熒光及熒光在其體內(nèi)的分布情況。

結(jié) 果

1 F0代轉(zhuǎn)基因小鼠的制備

將受精卵移植入17只8周齡的發(fā)情ICR母鼠的輸卵管內(nèi)，待其自然生產(chǎn)。孕期結(jié)束后共產(chǎn)下80只新生幼鼠，受孕率為100%，其中，4只具有繁殖能力，采用與野生型小鼠交配的策略，目前已繁殖到F3代。

2 轉(zhuǎn)基因小鼠的鑒定

2.1F0代mito-cpYFP cDNA轉(zhuǎn)基因小鼠的PCR鑒定 用上文提及的引物及方法，提取F0代小鼠的DNA進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果如圖2所示，共有8只小鼠的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)250 bp的目標(biāo)條帶，即有8只F0代小鼠為PCR陽(yáng)性小鼠，mito-cpYFP的基因序列被成功轉(zhuǎn)入這8只小鼠的基因組內(nèi)。

Figure 2. Identification of positive F0 generation mice by PCR. 2, 19, 33, 39, 45, 47 and 64: the numbers of transgenic mice of F0 generation; M: DNA marker; P: positive control; WT: wild-type mice; H2O: the solution in this experiment.

圖2F0代PCR陽(yáng)性小鼠的鑒定結(jié)果

2.2F0代mito-cpYFP cDNA轉(zhuǎn)基因小鼠的RT-PCR鑒定 用本文設(shè)計(jì)的RT-PCR引物及方法，提取鼠尾組織的mRNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后，使用1.5%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果見(jiàn)圖3。F0代小鼠中，有7只小鼠出現(xiàn)了本文所設(shè)計(jì)的2個(gè)目標(biāo)條帶，即轉(zhuǎn)入的目的基因序列已在F0代轉(zhuǎn)基因鼠體內(nèi)表達(dá)出相應(yīng)的mRNA及蛋白。

Figure 3. Identification of positive F0 generation mice by RT-PCR. 2, 19, 33, 39, 45, 47 and 64: the numbers of transgenic mice of F0 generation; WT: wild-type mice; cpYFP-1: the first target gene; cpYFP-2: the second target gene; GAPDH: the reference gene.

圖3F0代PCR陽(yáng)性小鼠的鑒定結(jié)果

3 轉(zhuǎn)基因小鼠的熒光觀察

根據(jù)mito-cpYFP被氧化后，在488 nm激發(fā)光照射下，可產(chǎn)生525 nm綠色熒光的特點(diǎn)，我們對(duì)DNA與mRNA鑒定均為陽(yáng)性的轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行熒光觀察，同時(shí)觀察熒光分布。轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性小鼠的熒光現(xiàn)象與昆明小鼠有明顯差異。如圖4～6所示，白色小鼠為昆明小鼠，黑色小鼠為轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性小鼠。圖4中，昆明小鼠的腹腔內(nèi)無(wú)熒光，轉(zhuǎn)基因小鼠腹腔內(nèi)有熒光出現(xiàn)，熒光較強(qiáng)的部位主要集中在腸道、恥骨聯(lián)合部及膀胱等部位，腎臟及肝臟則出現(xiàn)較弱的熒光。

如圖5A所示，對(duì)二者的胸腔進(jìn)行解剖，發(fā)現(xiàn)胸腔均無(wú)熒光，同時(shí)恥骨聯(lián)合部及膀胱的熒光消失，此時(shí)距腹腔解剖出現(xiàn)熒光的時(shí)間間隔約為0.5 h。其中，轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性小鼠的胸腺及因解剖而造成的傷口處有較弱的綠色熒光，見(jiàn)圖5B。

Figure 4. The image of abdominal anatomy. The fluorescence in intestines was stronger than that in kidney and liver.

圖4腹腔解剖對(duì)比圖

Figure 5. The images of thoracic anatomy. A: anatomized chests; B: enlarged chest of the transgenic mouse. The fluorescence of wound was weak.

圖5胸腔解剖對(duì)比圖

實(shí)施腦部解剖觀察，轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性小鼠的顱內(nèi)出現(xiàn)熒光，如圖6所示。對(duì)二者的口腔進(jìn)行解剖發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性小鼠的口腔黏膜出現(xiàn)綠色熒光，見(jiàn)圖7。

Figure 6. The image of anatomy of the brain. The fluorescence was observed in the brain.

圖6腦部解剖對(duì)比圖

Figure 7. The image of oral cavity anatomy. Green fluorescence in oral mucosa was intense.

圖7口腔解剖對(duì)比圖

討 論

目前，不乏將cpYFP作為自由基探針用于構(gòu)建動(dòng)物模型，特別是構(gòu)建哺乳動(dòng)物模型的實(shí)驗(yàn)團(tuán)隊(duì)，他們都取得了較為顯著的進(jìn)展，如Ding等[11]認(rèn)為由cpYFP引起的“超氧炫”現(xiàn)象可作為測(cè)量胰島素抗性應(yīng)激的唯一生物學(xué)指標(biāo)；Cao等[5]發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是在體內(nèi)還是體外，軟骨組織中促炎因子均可刺激細(xì)胞產(chǎn)生更多的自由基參與炎癥反應(yīng)，這對(duì)炎癥的治療方案有著重大意義。