室旁核內(nèi)花生四烯酰乙醇胺對心衰大鼠的心臟功能和交感神經(jīng)活動(dòng)的影響*

王仁俊， 周 琴， 未曉巍， 李 華， 趙永斌， 齊云峰， 欒 劍， 周曉馥

(吉林師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物技術(shù)系， 吉林 四平 136000)

慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)作為當(dāng)代人類健康的殺手，其重要病理特征之一為交感神經(jīng)興奮性增強(qiáng)[1]。研究報(bào)道顯示中樞神經(jīng)系統(tǒng)中相關(guān)作用機(jī)制改變是導(dǎo)致心衰時(shí)交感神經(jīng)興奮性增強(qiáng)的重要原因之一，如CHF時(shí)下丘腦室旁核(paraventricular nucleus，PVN)內(nèi)內(nèi)源性物質(zhì)(如神經(jīng)遞質(zhì)、調(diào)質(zhì)等)的整合作用失衡均可導(dǎo)致交感活動(dòng)亢進(jìn)[2]。我們最近研究發(fā)現(xiàn)微小核苷酸[3]、前列腺素[4]和γ-氨基丁酸等的整合作用失衡亦可導(dǎo)致交感傳出活動(dòng)亢進(jìn)，惡化心衰。但PVN內(nèi)大麻素類物質(zhì)是否參與心衰交感神經(jīng)活動(dòng)的調(diào)節(jié)過程，迄今為止，相關(guān)報(bào)道甚少。

花生四烯酰乙醇胺(arachidonylethanolamide，AEA)是內(nèi)源性大麻素樣物質(zhì)，也被稱作“內(nèi)源性香草酸物質(zhì)”，其合成途徑主要是通過磷脂酰乙醇胺與磷脂在Ca2+依賴性N-?；D(zhuǎn)移酶(N-acyltransferase)催化作用下產(chǎn)生N-arachidonoyl phosphatidylethanolamine (NArPE)，隨后又在磷脂酶D (phospholipase D，PLD)作用下最后生成AEA。已有報(bào)道顯示在心肌缺血和心律失常等疾病中AEA均發(fā)揮重要的保護(hù)作用。AEA具有擴(kuò)血管降血壓的作用，但該作用在瞬時(shí)受體電位香草酸亞型1(transient receptor potential vanilloid type 1，TRPV1)基因敲減后消失；在右心房中TRPV1抑制劑能夠阻斷AEA所增強(qiáng)的肺迷走傳入神經(jīng)的敏感性；在急性心肌梗死后，激活TRPV1受體對心肌起保護(hù)作用[5]，還可增加平滑肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度。以上研究結(jié)果提示在外周組織中AEA與TRPV1具有保護(hù)心血管的作用，且AEA與TRPV1受體密切相關(guān)。

在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)AEA可誘導(dǎo)一氧化氮[6]產(chǎn)生，促進(jìn)心肌舒張，且該效應(yīng)與鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶II(calcium-calmodulin-dependent protein kinase II,CaMKII)密切相關(guān)[7]。另有文獻(xiàn)報(bào)道AEA在孤束核(nucleus tractus solitarii，NTS)中可延長壓力反射時(shí)間，抑制交感神經(jīng)活性。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)AEA在麻醉大鼠PVN內(nèi)可明顯降低動(dòng)脈血壓，同時(shí)在突觸處可激活TRPV1受體。也有報(bào)道指出AEA激活TRPV1受體，引起細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度增加[8]，從而激活CaMKII[9]。然而，當(dāng)脂肪酸酰胺水解酶(fatty acid amide hydrolase，F(xiàn)AAH)水解AEA后，TRPV1的活性將受到抑制。有報(bào)道顯示CaMKII不僅能調(diào)節(jié)TRPV1的磷酸化而且能致其功能敏感化，CaMKII活性增強(qiáng)可使細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度增加，進(jìn)而激活小電導(dǎo)鈣激活鉀通道(small-conduc-tance calcium-activated potassium channel， SK channel)[10]。此外，CaMKII也參與 2型SK (type 2 SK,SK2)功能的調(diào)控，當(dāng)抑制CaMKII 時(shí)，SK2對apamin的敏感性也會降低[11]。AEA也能夠通過調(diào)控胞內(nèi)Ca2+濃度來調(diào)節(jié)SK活性。另有報(bào)道稱CaMKII介導(dǎo)的磷酸化能夠調(diào)控通道的激活，在心肌細(xì)胞中KN-93(CaMKII的選擇性抑制劑)能夠阻斷SK電流的增強(qiáng)，SK2過表達(dá)則減弱了心衰大鼠的腎交感神經(jīng)活性[12]。綜上所述，我們提出如下假說： 心衰大鼠交感活動(dòng)的亢進(jìn)可能與PVN內(nèi)AEA和Ca2+濃度降低，CaMKII、SK2及磷酸化TRPV1蛋白表達(dá)下調(diào)密切相關(guān)。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性Wistar大鼠，體重180～220 g，購于長春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司，許可證號為SCXK(吉)2011-0004。大鼠飼料購自長春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司，生產(chǎn)許可證號為SCXK(吉)2010-0001。恒溫(23±2)℃，常規(guī)24 h晝夜循環(huán)。

1.2藥品試劑與實(shí)驗(yàn)設(shè)備 氨基甲酸乙酯、α-氯醛糖、肝素鈉、KN-93和辣椒平(capsazepine,CPZ)購自長春鼎國生物技術(shù)有限公司。儀器設(shè)備包括腦立體定位儀(NARISHIGE，SR-5M-HT)、多通道生理信號采集系統(tǒng)(成都泰盟有限公司)、激光共聚焦顯微鏡系統(tǒng)(ZEISS， LSM 710)等。

2 方法與過程

2.1構(gòu)建心衰模型與假手術(shù)模型 30%氨基甲酸乙酯經(jīng)腹腔麻醉大鼠，固定于鼠板上，消毒完成后，切開頸部皮膚，分離氣管連接大鼠呼吸機(jī)，待呼吸均勻后，于3～4肋骨間開胸，暴露心臟，剪開心包膜后用0號帶線縫合針結(jié)扎心衰組動(dòng)物的冠狀動(dòng)脈，假手術(shù)組不結(jié)扎，手術(shù)縫合。術(shù)后3 d 每天注射1次青霉素抗感染，常規(guī)飼養(yǎng)。

2.2植入微滲透泵 將麻醉的大鼠固定于腦立體定位儀上，參照大鼠Paxions & Waston腦圖譜，于下丘腦室旁核(前囟后1.7 mm，L和R 0.5 mm，H7.2 mm)插入微滲透泵導(dǎo)管，牙科水泥固定，然后將含藥物的Alzet 1004號微滲透泵[人工腦脊液(artificial cerebrospinal fluid,aCSF)： 0.11 μL/h； apamin： 5 μg·kg-1·h-1； AEA： 100 ng·kg-1·h-1； KN-93、CPZ和BAPTA-AM均為 10 μg·kg-1·h-1]埋于頸部皮下,另選麻醉大鼠在其腹腔植入同樣型號的微滲透泵(aCSF： 0.22 μL/h； apamin： 10 μg·kg-1·h-1； AEA： 200 ng·kg-1·h-1； KN-93、CPZ和BAPTA-AM均為20 μg·kg-1·h-1),手術(shù)縫合。常規(guī)飼養(yǎng)4周。

2.3超聲心動(dòng)圖及血流動(dòng)力學(xué)檢測 本研究選用冠脈結(jié)扎4周的心衰大鼠進(jìn)行微滲透泵給藥，連續(xù)灌注4周后，檢測心功能、血流動(dòng)力學(xué)和交感驅(qū)動(dòng)指標(biāo)。30%烏拉坦及α-氯醛糖腹腔注射麻醉實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，采用超聲心動(dòng)圖儀檢測左心室射血分?jǐn)?shù)(ejection fraction，EF)、左心室舒張末期容積(left ventricular end-diastolic volume，LVEDV)和左心室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular end-diastolic diameter，LVDd)；分離動(dòng)脈并插管，通過壓力換能器連接到多道生理記錄儀，采集平均動(dòng)脈壓(mean artery blood pressure，MAP)、左心室收縮壓(left ventricular systolic pressure，LVSP)和左心室舒張末期壓(left ventricular end-diastolic pressure，LVEDP)等各項(xiàng)指標(biāo)；俯臥固定麻醉大鼠，分離腎交感神經(jīng)，通過生物神經(jīng)元放電記錄儀記錄腎交感神經(jīng)放電(renal sympathetic nerve discharge，RSND)，記錄大鼠Ⅱ?qū)?lián)心電圖，并同步得到心率(heart rate，HR)。

2.4NG108細(xì)胞的培養(yǎng) NG108細(xì)胞為小鼠的神經(jīng)母細(xì)胞瘤和大鼠的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤融合后形成的雜交細(xì)胞，常作為工具細(xì)胞在研究神經(jīng)系統(tǒng)與疾病發(fā)生機(jī)制過程中使用。在無菌環(huán)境中將NG108細(xì)胞接種到DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中含10%胎牛血清、1% HAT、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素。分別添加5、10、15、20和25 μmol/L AEA于培養(yǎng)瓶中進(jìn)行孵育實(shí)驗(yàn)，5% CO2、95%過濾空氣于37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h。

2.5胞內(nèi)鈣離子濃度(intracellular Ca2+concentration,[Ca2+]i)的測定 DMEM培養(yǎng)基清洗細(xì)胞并用胰酶消化制備細(xì)胞懸液(終密度為1×109/L), 37℃恒溫水浴5 min后加入Fura 2-AM(終濃度為5 μmol/L)，于37 ℃恒溫?fù)u床負(fù)載45 min, 離心后去上清(200×g， 8 min)，用平衡鹽溶液(balanced salt solution,BSS;mmol/L：NaCl 130.0，KCl 5.46，CaCl21.33，葡萄糖5.56，HEPES 20.0， 0.2%牛血清蛋白)沖洗細(xì)胞3次，BSS懸浮細(xì)胞(細(xì)胞密度保持在1×109/L)，0 ℃避光保存待測。

熒光測定方法：激發(fā)狹縫5 nm，發(fā)射狹縫10 nm，激發(fā)波長為340 nm和380 nm (2 s更換一次，交替出現(xiàn))，發(fā)射波長為480 nm，響應(yīng)因子0.02，記錄從60 s～100 s的熒光比值。按照常規(guī)公式：[Ca2+]i=Kd·(F-Fmin)/(Fmax-F)，即可求得各組細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度。Kd: 解離常數(shù)(224 nmol/L)； F: 不同實(shí)驗(yàn)條件下的熒光強(qiáng)度； Fmax: 加入Triton X-100后測得的最大熒光值； Fmin: 加入EGTA后測得的最小熒光值。

2.6Western blot檢測蛋白水平 取PVN組織及NG108細(xì)胞，加入蛋白提取緩沖液(10 mmol/L Tris、1 mmol/L 蛋白酶抑制劑、1 mmol/L 磷酸酶抑制劑、1% SDS、0.1% Triton X-100和1 mmol/L PMSF)，超聲粉碎，4 ℃、12 000 r/min離心8 min；上清液即為全細(xì)胞蛋白，BCA法測蛋白濃度；SDS-PAGE分離蛋白，濾紙-膠-膜-濾紙樣的三明治法電移膜；5%脫脂奶粉4 ℃封閉過夜；I 抗4 ℃孵育過夜后，TBS洗滌3次,每次10 min,暗室中熒光素標(biāo)記的 II 抗孵育1 h，再用TBS洗滌2次，每次min,蒸餾水洗10 min，ECL曝光，最后顯影定影，拍照。

2.7高效液相色譜法測AEA的含量 精密稱量PVN組織后，加入含水解酶抑制劑PMSF的玻璃瓶中，加入乙腈溶劑20 mL，勻漿打碎后，進(jìn)行為時(shí)1 h 的超聲。4 ℃靜置過夜，棄上清。將沉淀物全部放入離心機(jī)(10 000 r/min)離心10 min，收集上層有機(jī)相。利用固相萃取技術(shù)，2 mL流動(dòng)相，乙酸乙酯和丙酮(比例1∶1)共5 mL進(jìn)行洗脫，收集濾液，再用氮?dú)獯蹈上疵撘?。加? mL 乙腈復(fù)溶，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

取上述樣品，精密吸取0.5 mL于離心管，加入0.5 mL AEA衍生化試劑DBD-COCl, 50 ℃恒溫反應(yīng) 2 h。100 μL去離子水終止反應(yīng)。進(jìn)樣，高效液相色譜分析檢測。

2.8PVN組織Ca2+濃度的測定 用脫臼的方法處死大鼠，分開顱骨，在冰臺上用打孔法快速取出PVN組織，精密稱重后，按0.1 g∶1 mL的腦∶生理鹽水比例制備組織勻漿，設(shè)定參數(shù)4 ℃、2 500 r/min離心10 min后取上清。723型分光光度計(jì)參數(shù)設(shè)定為610 nm，光徑為1 cm，蒸餾水調(diào)零，記錄各管吸光度(A)值，計(jì)算Ca2+含量。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)通過GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示，單因素方差分析(one-way ANOVA)用于分析心功能和血流動(dòng)力學(xué)等指標(biāo)，多組數(shù)據(jù)兩兩比較用Bonferroni法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 心衰模型的成功建立

冠脈結(jié)扎術(shù)后 8周，檢測假手術(shù)組及心衰組大鼠各項(xiàng)指標(biāo)，結(jié)果顯示與假手術(shù)組相比，心衰組大鼠肺體比(lung/body weight, lung/BW)、心臟重量(heart weight，HW)及體重(body weight，BW)均明顯增加(P<0.05)，提示心衰大鼠有肺淤血等跡象。心衰組大鼠左心室壓力最大上升/下降速率(±dp/dtmax)及左室短軸縮短率(fractional shortening，F(xiàn)S)等明顯下降；而心衰組大鼠的LVEDP顯著升高(P<0.05)；其次，較假手術(shù)組而言，心衰組大鼠心肌梗死面積(infarct size,IS)明顯增加(P<0.05)，梗死面積在32%～41%之間，而假手術(shù)組大鼠心肌未出現(xiàn)梗死的現(xiàn)象，見表1。以上結(jié)果均顯示心衰大鼠心臟功能發(fā)生顯著變化，心衰模型構(gòu)建成功。

表1CHF組與假手術(shù)組大鼠解剖學(xué)、血流動(dòng)力學(xué)和交感驅(qū)動(dòng)指標(biāo)檢測

Table 1. The indexes of anatomy, hemodynamics and sympathe-tic drive in CHF group and sham group (Mean±SEM.n=12)

IndexShamCHF BW (g)366.0±4.5391.0±7.0 HW (g)1.38±0.031.66±0.06? RV/BW (mg/g)0.65±0.051.59±0.12? Lung/BW (mg/g)6.22±0.2714.01±0.32? IS (%)039.1±2.8? LVEDV (mL)0.31±0.100.85±0.05? LVDd (mm)6.29±0.219.81±0.33? FS (%)41.30±1.2827.80±1.38? EF (%)65.00±1.8938.00±2.13? LVSP (mmHg)122±5 100±5? LVEDP (mmHg)3.63±0.02 20.90±2.20? +dp/dtmax (mmHg/s)7 325±437 5 621±446? -dp/dtmax (mmHg/s)6 311±201 4 084±351? MAP (mmHg)99.5±3.4 91.6±3.8 HR (min-1)378.4±18.7 400.5±11.5 Basal RSND (% of maxinum)21.8±1.9 34.9±3.5? NE (ng/L)288.4±11.2 498.7±17.8?

*P<0.05vssham group.

2 PVN內(nèi)微量灌注AEA降低心衰大鼠死亡率

麻醉大鼠PVN內(nèi)微量灌注AEA和對照溶劑(vehicle，VEH)，一周后進(jìn)行冠脈結(jié)扎手術(shù)，手術(shù)結(jié)束開始記錄存活率，結(jié)果顯示心肌梗死(myocardial infarction，MI)+AEA組大鼠的存活率達(dá)80%，而MI+VEH組大鼠的存活率僅64%，sham+VEH組和sham+AEA組大鼠存活率均為100%，即AEA僅增加了CHF大鼠存活率，但未對sham組大鼠存活率產(chǎn)生顯著影響，見圖1，提示PVN內(nèi)微量灌注AEA能顯著降低心衰大鼠死亡率。

Figure 1. The survival curves of CHF and sham rats at the end of the study.

圖1CHF和sham組大鼠在研究結(jié)束時(shí)的存活曲線

3 PVN內(nèi)微量灌注AEA、KN-93、CPZ、BAPTA-AM和apamin對心功能、血流動(dòng)力學(xué)和解剖學(xué)指標(biāo)的影響

選用結(jié)扎后4周的大鼠進(jìn)行為期4周的PVN微量灌注實(shí)驗(yàn)。PVN分別微量灌注AEA、KN-93、CPZ、BAPTA-AM和apamin后，進(jìn)行超聲心動(dòng)圖、血流動(dòng)力學(xué)和解剖學(xué)等指標(biāo)檢測。結(jié)果顯示AEA能夠顯著降低心衰大鼠的LVDd、LVEDV、LVEDP、Lung/BW和RV/BW，顯著提高±dp/dtmax、EF和FS，從而改善心功能。然而，KN-93、CPZ、BAPTA-AM和apamin則分別顯著降低心功能，惡化心衰，見表2～4。

4 PVN內(nèi)微量灌注AEA、KN-93、CPZ、BAPTA-AM和apamin對交感驅(qū)動(dòng)指標(biāo)的影響

與溶劑對照組相比，PVN內(nèi)微量灌注AEA導(dǎo)致心衰組及假手術(shù)組的MAP、HR、RSND和血漿去甲腎上腺素(norepinephrine，NE)均顯著降低(P<0.05)；PVN內(nèi)分別微量灌注KN-93、CPZ、BAPTA-AM和apamin導(dǎo)致心衰組及假手術(shù)組的MAP、 HR、 RSND和NE均顯著增強(qiáng)(P<0.05)，但假手術(shù)組較心衰組反應(yīng)更為明顯，見圖2。這些結(jié)果提示PVN內(nèi)CaMKII/TRPV1/Ca2+/SK2信號通路可能參與了AEA對心衰大鼠交感神經(jīng)活動(dòng)的抑制作用。

5 皮下微量灌注AEA、KN-93、CPZ、BAPTA-AM和apamin對交感驅(qū)動(dòng)指標(biāo)的影響

與溶劑對照組相比，分別在假手術(shù)組和CHF組大鼠皮下微量灌注2倍于PVN內(nèi)微量灌注劑量的AEA、KN-93、CPZ、BAPTA-AM和apamin對MAP、HR、RSNA和NE均無明顯影響(數(shù)據(jù)未在文中顯示)。這些結(jié)果提示AEA、KN-93、CPZ、BAPTA-AM和apamin分別對交感驅(qū)動(dòng)指標(biāo)的影響是由下丘腦室旁核介導(dǎo)，而非藥物擴(kuò)散至外周組織產(chǎn)生的效應(yīng)。

表2PVN內(nèi)微量灌注AEA、KN-93、CPZ、BAPTA-AM和apamin對心功能指標(biāo)的影響

Table 2. The effects of PVN microinfusion of AEA, KN-93, CPZ, BAPTA-AM and apamin on cardiac function indexes (Mean±SEM.n=6)

TreatmentLVDd (mm)ShamCHFLVEDV (mL)ShamCHFEF (%)Sham CHFFS (%) Sham CHFaCSF6.27±0.309.78±0.21?0.34±0.070.87±0.05?83.50±2.0150.70±1.98?41.70±1.0227.50±1.23?AEA3.97±0.23?8.92±0.37??0.22±0.05?0.77±0.03??97.20±1.98?61.10±1.74??64.90±0.97?41.20±1.28??KN-938.74±0.14?11.25±0.18??0.56±0.10?0.99±0.03??61.70±1.95?40.50±2.01??30.20±0.89?21.60±0.78??CPZ8.69±0.12?11.80±0.20??0.59±0.08?1.01±0.02??60.90±2.03?41.10±1.85??30.90±1.01?20.90±0.74??BAPTA-AM8.61±0.14?11.30±0.17??0.60±0.06?1.06±0.08??61.20±1.78?40.80±1.54??31.20±1.12?20.70±0.76??Apamin8.89±0.21?11.70±0.24??0.58±0.02?1.02±0.09??62.30±2.11?41.20±1.36??31.80±1.28?21.30±0.71??

*P<0.05vssham+aCSF group;?P<0.05vsCHF+aCSF group.

表3PVN內(nèi)微量灌注AEA、KN-93、CPZ、BAPTA-AM和apamin對血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)的影響

Table 3. The effects of PVN microinfusion of AEA, KN-93, CPZ, BAPTA-AM and apamin on haemodynamic indexes (Mean±SEM.n=6)

TreatmentLVSP (mmHg)ShamCHFLVEDP (mmHg)ShamCHF+dp/dtmax (mmHg/s)ShamCHF-dp/dtmax (mmHg/s) Sham CHFaCSF120±3 100±4? 3.29±0.03 21.20±1.98 7 790±201 5 621±187? 6 301±207 4 124±310?AEA141±2?113±5?? 2.01±0.04?20.30±1.32??8 145±124?5 949±162??7 991±198?5 721±223??KN-93102±3?91±2??6.61±0.04?24.10±1.34??5 438±198?3 318±132??5 012±211?3 025±196??CPZ101±4?90±3??6.54±0.05?23.10±1.28??5 325±201?3 321±146??5 106±209?3 054±203??BAPTA-AM102±5?91±4??6.23±0.02?23.80±1.19??5 384±189?3 315±139??5 099±196?3 009±301??Apamin100±2?89±6??6.79±0.04?22.90±1.09??5 345±179?3 319±201??5 014±184?3 015±297??

*P<0.05vssham+aCSF group;?P<0.05vsCHF+aCSF group.

表4PVN內(nèi)微量灌注AEA、KN-93、CPZ、BAPTA-AM和apamin對心臟解剖學(xué)指標(biāo)的影響

Table 4. The effects of PVN microinfusion of AEA, KN-93, CPZ, BAPTA-AM and apamin on anatomical indexes (Mean±SEM.n=6)

TreatmentHW (g)RV/BW (mg/g)Lung/BW (mg/g)ShamCHFShamCHFShamCHFaCSF1.37±0.041.68±0.03?0.66±0.051.61±0.08?6.21±0.2714.07±0.31?AEA1.21±0.07?1.55±0.02??0.39±0.03?1.48±0.04??5.02±0.21?12.96±0.29??KN-931.98±0.03?1.86±0.04??0.97±0.02?1.79±0.10??8.74±0.21?15.85±0.22??CPZ1.96±0.04?1.90±0.02??0.98±0.01?1.81±0.14??8.71±0.13?15.75±0.34??BAPTA-AM1.99±0.07?1.91±0.03??0.97±0.03?1.89±0.13??8.80±0.15?15.80±0.37??Apamin2.01±0.06?1.93±0.02??0.98±0.09?1.90±0.14??8.83±0.20?15.81±0.28??

*P<0.05vssham+aCSF group;?P<0.05vsCHF+aCSF group.

6 心衰大鼠PVN內(nèi)AEA含量、Ca2+濃度及CaMKII、SK2和磷酸化TRPV1蛋白水平的檢測

冠脈結(jié)扎8周后，檢測大鼠PVN內(nèi)AEA含量、Ca2+濃度及CaMKII、SK2和磷酸化TRPV1蛋白水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與假手術(shù)組相比，心衰組大鼠PVN內(nèi)AEA含量、Ca2+濃度及CaMKII、SK2和磷酸化TRPV1蛋白水平均顯著降低(P<0.05)，見圖3。這些結(jié)果提示PVN內(nèi)AEA含量、Ca2+濃度及CaMKII、SK2和磷酸化TRPV1蛋白水平降低可能與心衰發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

Figure 2. The effects of microperfusion of AEA, KN-93, CPZ, BAPTA-AM and apamin in PVN on the sympathetic drive indexes. A: original tracings of artery blood pressure (ABP) and renal sympathetic nerve discharge (RSND); B: heart rate (HR); C: mean arterial pressure (MAP); D: RSND; E: plasma norepinephrine (NE). Mean±SEM.n=6.*P<0.05vssham+VEH group;?P<0.05vsCHF+VEH group.

圖2PVN內(nèi)微量灌注AEA、KN-93、CPZ、BAPTA-AM和apamin對交感驅(qū)動(dòng)指標(biāo)的影響

7 AEA孵育NG108細(xì)胞后細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度及CaMKII、SK2和磷酸化TRPV1蛋白水平的檢測

離體培養(yǎng)NG108細(xì)胞，分別用5、10、15、20和25 μmol/L的AEA孵育NG108細(xì)胞24 h后，與正常組相比，AEA孵育可劑量依賴性增加NG108細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度及CaMKII、SK2和磷酸化TRPV1蛋白水平(P<0.05)，見圖4、5。這一結(jié)果提示CaMKII/TRPV1/Ca2+信號通路可能介導(dǎo)了AEA對NG108細(xì)胞內(nèi)SK2通道蛋白表達(dá)的抑制作用。

討 論

本研究運(yùn)用神經(jīng)核團(tuán)微量灌注、神經(jīng)電生理、細(xì)胞培養(yǎng)及Western blot等技術(shù)，首次發(fā)現(xiàn)在心衰大鼠PVN內(nèi)AEA含量、Ca2+濃度及CaMKII、SK2和磷酸化TRPV1蛋白水平均顯著減少，PVN內(nèi)微量灌注AEA能顯著降低交感驅(qū)動(dòng)指標(biāo)(包括HR、MAP、RSND和NE)；然而，分別微量灌注KN-93、CPZ、BAPTA-AM和apamin能顯著增強(qiáng)交感驅(qū)動(dòng)指標(biāo)。

Figure 3. AEA content (A), intracellular Ca2+concentration ([Ca2+]i; B), and CaMKII (C), SK2(D) and phosphorylated TRPV1 (E) protein levels in PVN of the rats with CHF. Mean±SEM.n=6.*P<0.05vssham group.

圖3大鼠PVN內(nèi)AEA含量、胞內(nèi)Ca2+濃度及CaMKII、SK2和磷酸化TRPV1蛋白水平的比較

Figure 4. The effect of AEA on intracellular Ca2+concentration ([Ca2+]i) in NG108 cells. A: representative confocal images showing the changes of [Ca2+]i; B: the quantitative analysis of [Ca2+]i. Mean±SEM.n=6.*P<0.05vs0 μmol/L group.

圖4AEA孵育NG108細(xì)胞對胞內(nèi)Ca2+濃度的影響

在離體實(shí)驗(yàn)部分，AEA孵育可劑量依賴性增加NG-108細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度及CaMKII、SK2和磷酸化TRPV1蛋白水平。以上結(jié)果提示室旁核內(nèi)CaMKII/TRPV1/Ca2+/SK2信號通路可能介導(dǎo)了AEA對心衰大鼠交感神經(jīng)活動(dòng)的影響。

本研究對AEA、CaMKII選擇性抑制劑KN-93、TRPV1通道特異性阻斷劑CPZ、Ca2+螯合劑BAPTA-AM和SK通道阻斷劑apamin的溶劑都進(jìn)行了心衰及假手術(shù)大鼠PVN注射，記錄了各種溶劑對交感驅(qū)動(dòng)指標(biāo)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)各種溶劑對交感驅(qū)動(dòng)指標(biāo)均無顯著影響，因此，本文展示的數(shù)據(jù)中選取aCSF組作為溶劑對照組。在離體實(shí)驗(yàn)部分，本研究采用AEA孵育NG108細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)AEA誘導(dǎo)了磷酸化TRPV1蛋白水平的增加，同時(shí)也增加了CaMKII和SK2蛋白表達(dá)量，提示CaMKII活性增強(qiáng)可能誘導(dǎo)了TRPV1磷酸化，進(jìn)而激活SK2，這一結(jié)果與Liu等[13]的報(bào)道相一致。本研究還發(fā)現(xiàn)當(dāng)分別微量灌注AEA、KN-93、CPZ、BAPTA-AM和apamin時(shí)，雖然心衰組及假手術(shù)組交感驅(qū)動(dòng)指標(biāo)均發(fā)生顯著變化，但假手術(shù)組反應(yīng)更為明顯。這可能與心衰大鼠減壓反射發(fā)生鈍化有關(guān)；另外，心衰大鼠PVN內(nèi)的CaMKII/TRPV1/Ca2+/SK2信號通路功能鈍化也可能是導(dǎo)致心衰大鼠交感驅(qū)動(dòng)指標(biāo)對AEA、KN-93、CPZ、BAPTA-AM和apamin的敏感性降低的主要原因之一。

Figure 5. The results of Western blot showed the effects of AEA on the protein levels of CaMKII, SK2, TRPV1 and phosphorylated TRPV1 in the NG108 cells. Mean±SEM.n=6.*P<0.05vscontrol (without treatment) group.

圖5AEA孵育NG108細(xì)胞后對CaMKII、SK2及磷酸化的TRPV1蛋白水平的影響

與本研究結(jié)果相矛盾的是，另一課題組的研究顯示AEA注入兔腦室可導(dǎo)致交感神經(jīng)活動(dòng)亢進(jìn)[14]，但該課題組采用的給藥方式是腦室注射，因腦室注射法無法定位到具體的神經(jīng)核團(tuán)，所以不能確定AEA具體是通過哪個(gè)神經(jīng)核團(tuán)發(fā)揮作用；此外，雖然兔與鼠都屬于小型哺乳動(dòng)物，但因二者基因差異較大，所以很可能是因遺傳背景不同導(dǎo)致交感神經(jīng)活動(dòng)對AEA的反應(yīng)不一致，但確切機(jī)制仍有待進(jìn)一步深入研究。另有研究報(bào)道長期使用低劑量辣椒素激活TRPV1后，交感神經(jīng)興奮性未發(fā)生顯著改變，其原因可能與長期辣椒素刺激引起生物耐受性有關(guān)。值得注意的是，有報(bào)道顯示抑制CaMKII對阿爾茨海默癥大鼠有神經(jīng)保護(hù)作用[15]，但在心衰模型與阿爾茨海默癥發(fā)病機(jī)制不同，藥物作用核團(tuán)亦不相同，所以在CHF大鼠PVN內(nèi)CaMKII發(fā)揮作用如何，有待進(jìn)一步研究。陳佳等[16]曾指出心衰患者血漿中AEA含量有所升高，然而，本研究發(fā)現(xiàn)心衰大鼠PVN內(nèi)AEA含量顯著降低，其中矛盾的原因很可能與我們在研究中采用的心衰動(dòng)物模型與陳佳等在臨床研究中心衰患者的疾病嚴(yán)重程度不完全一致有關(guān)；此外，也可能與中樞PVN內(nèi)AEA與外周血漿中的AEA在心血管系統(tǒng)中調(diào)控機(jī)制存在差異有關(guān)。但在心衰狀態(tài)下中樞和外周AEA參與心血管活動(dòng)調(diào)節(jié)的確切機(jī)制如何仍有待進(jìn)一步深入研究。有趣的是，也有研究顯示CaMKII可調(diào)節(jié)TRPV1受體通道蛋白的磷酸化水平，AEA進(jìn)入細(xì)胞后可激活TRPV1受體，引起細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度增加；鈣內(nèi)流增加及CaMKII介導(dǎo)的磷酸化作用均能介導(dǎo)SK信號通路激活，且在NTS中微量注射AEA能夠延長壓力反射時(shí)間，抑制交感神經(jīng)活性；PVN內(nèi)注射AEA可明顯降低動(dòng)脈血壓等，這部分研究結(jié)論均與本研究中AEA介導(dǎo)TRPV1磷酸化從而抑制交感神經(jīng)興奮性的結(jié)果相一致。

當(dāng)然，本研究中也存在著許多的不足之處，我們將其歸納為以下幾點(diǎn)：(1)本研究雖然證實(shí)在心衰大鼠PVN內(nèi)AEA能抑制交感神經(jīng)興奮，但是否有其它因子輔助AEA對交感神經(jīng)興奮性產(chǎn)生影響，目前仍無法排除；(2)本研究中雖然證實(shí)AEA對心衰大鼠交感神經(jīng)興奮性產(chǎn)生影響與SK信號通路密切相關(guān)，但SK通道存在4種亞型(即SK1～SK4)，這些通道亞型是否分別或共同參與調(diào)控交感神經(jīng)興奮，在本研究中未進(jìn)行分類探究，需要進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究結(jié)果提示在心衰狀態(tài)下，PVN內(nèi)AEA含量降低，進(jìn)而抑制了CaMKII/TRPV1/Ca2+/SK信號通路，最終導(dǎo)致交感神經(jīng)興奮亢進(jìn)。本研究所證實(shí)的心衰狀態(tài)下PVN內(nèi)CaMKII/TRPV1/Ca2+/SK信號通路介導(dǎo)AEA對心衰大鼠交感神經(jīng)激活產(chǎn)生抑制作用，雖不能直接應(yīng)用于臨床，但本研究所驗(yàn)證的假說可為心衰治療提供實(shí)驗(yàn)室理論依據(jù)，為心衰疾病的治療提供新的靶點(diǎn)。