一家族性肥厚型心肌病致病基因的檢測(cè)及其意義

(上海市兒童醫(yī)院心內(nèi)科，上海交通大學(xué)附屬兒童醫(yī)院心內(nèi)科，上海 200062)

肥厚型心肌病(HCM)是一類以左心室肥厚尤其是非對(duì)稱性室間隔肥厚為特征的心肌病，該病病人年死亡率約為1%[1]，是最常見(jiàn)的單基因遺傳心血管疾病，主要表現(xiàn)為常染色體顯性遺傳，是青少年和運(yùn)動(dòng)員猝死的首要原因[2-3]。HCM分為肥厚型梗阻性心肌病和肥厚型非梗阻性心肌病。HCM在成人的患病率為0.02%～0.23%[4]，我國(guó)成年人群發(fā)病率約為0.08%[2]。HCM占兒科原發(fā)性心肌病的20%～30%，兒童HCM可以累及右心室或者雙側(cè)心室，伴有明顯的右室流出道梗阻，特別是嬰兒病例[5-6]。目前，兒童HCM的發(fā)病率暫無(wú)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，雖然HCM總的發(fā)病率較低，但結(jié)合我國(guó)龐大的人口基數(shù)及其死亡率，推測(cè)兒童HCM發(fā)病率不容樂(lè)觀。近5年來(lái)，我院每年收治的HCM患兒均超過(guò)了100例，因此較早地精準(zhǔn)診斷該病的致病原因，顯得頗為重要[7]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，40.0%～74.2%的HCM病因并不明確，其中小于1歲的嬰兒約占35.8%，而在明確病因的HCM中，以遺傳因素為主，包括家族性/肌節(jié)蛋白基因缺陷、先天性代謝缺陷等[8]。兒童常見(jiàn)非肌小節(jié)HCM包括代謝缺陷、畸形綜合征和神經(jīng)肌肉疾病[9]；成人常見(jiàn)非肌小節(jié)HCM包括代謝蓄積病，如DANON病(LAMP2基因)，F(xiàn)ABRY病(GLA基因)、左室肥厚伴WPW綜合征(PRKAG2基因)、家族性淀粉樣變性(TTR基因)和線粒體心肌病[10]。針對(duì)致病基因進(jìn)行篩查，明確致病突變，有助于HCM病人的診斷和家系成員的早期診斷和排查。最新ACCF/AHA的HCM診治指南推薦對(duì)HCM病人進(jìn)行全面的致病基因檢測(cè)[9]。但是由于HCM致病基因多，Sanger測(cè)序等傳統(tǒng)的篩查方法耗時(shí)長(zhǎng)、費(fèi)用昂貴，難以用于快速全面篩查。另外，由于發(fā)現(xiàn)的HCM致病突變非常多，遺傳異質(zhì)性導(dǎo)致了目前仍難以明確基因型與表型的關(guān)聯(lián)，限制了基因篩查在判斷HCM預(yù)后以及危險(xiǎn)分層中的應(yīng)用[11]。因此本研究利用全外顯子測(cè)序(WES)，對(duì)一個(gè)漢族HCM家系進(jìn)行全面的致病基因檢測(cè)，評(píng)估WES應(yīng)用于HCM遺傳檢測(cè)的可行性，并對(duì)發(fā)現(xiàn)的致病基因突變與其表型的相關(guān)性進(jìn)行分析。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

本研究對(duì)象為一安徽籍家系(圖1)。先證者是一位12歲男性患兒(Ⅲ-1)。因體檢發(fā)現(xiàn)“心動(dòng)過(guò)緩”及心臟雜音來(lái)本院就診，初步診斷為HCM；實(shí)驗(yàn)室檢查示N末端腦鈉肽為933.53 ng/L，既往無(wú)高血壓、冠心病及糖尿病病史，患兒接受了相關(guān)藥物治療。

1.2 研究方法

收集該家系所有成員詳細(xì)的臨床資料，包括體格檢查、發(fā)病年齡、心電圖及超聲心動(dòng)圖結(jié)果，并根據(jù)需要行動(dòng)態(tài)心電圖檢查。本研究獲上海市兒童醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理號(hào)為：2017R047-E02)，所有研究對(duì)象簽署知情同意書(shū)。

1.3 全外顯子組測(cè)序

采集所有研究對(duì)象的外周血2 mL，抽提血液基因組DNA，使用Roche Nimblegen SeqCap EZ Exome V3(羅氏)試劑盒，對(duì)患兒樣本基因外顯子編碼區(qū)及其上下游20 bp區(qū)域進(jìn)行捕獲并擴(kuò)增，建庫(kù)，后采用Hiseq 2500高通量測(cè)序平臺(tái)測(cè)序，每個(gè)樣品產(chǎn)生15 bp的配對(duì)末端測(cè)序數(shù)據(jù)，樣本測(cè)序深度平均為100X，核心目標(biāo)序列區(qū)域的測(cè)序深度不低于20X。

1.4 生物信息學(xué)分析

對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行圖像識(shí)別(Base calling)，統(tǒng)計(jì)測(cè)序的Reads長(zhǎng)度、數(shù)量及數(shù)據(jù)產(chǎn)量。然后比對(duì)參考基因組，獲得比對(duì)到基因組上的Uniquemapped reads，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控、SNP檢測(cè)、InDel檢測(cè)及注釋。測(cè)序完成后，利用自主開(kāi)發(fā)的軟件分析過(guò)濾數(shù)據(jù)，使用BWA-0.7.10軟件與人類基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(GRCh 37 /hg 19)進(jìn)行比對(duì)；再使用GATK軟件，識(shí)別并過(guò)濾單堿基變異和插入缺失變異；利用數(shù)據(jù)庫(kù)如千人基因組、ExAC、 gnomAD、HGMD、 ClinVar、 OMIM及本院的370例樣本的全外顯子測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)等進(jìn)行注釋。然后使用SIFT、 Polyphen2、 MutationTaster、MutationAssessor以及HSF等軟件對(duì)候選基因的致病性進(jìn)行預(yù)測(cè)。登錄https://www.ncbi.nlm.nih.gov/homologene對(duì)突變位點(diǎn)進(jìn)行氨基酸序列同源性比對(duì)。根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)注釋結(jié)果、軟件預(yù)測(cè)結(jié)果及其臨床表型，對(duì)致病突變位點(diǎn)進(jìn)行篩選過(guò)濾。得到候選基因突變列表(Candidates.xlsx)，利用ANNOVAR軟件預(yù)測(cè)候選基因突變，并利用GERP 評(píng)分表對(duì)候選基因的致病性進(jìn)行排名。對(duì)檢測(cè)到的基因突變，按照美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(huì)遺傳變異分類標(biāo)準(zhǔn)的指南解釋[12]。

對(duì)遺傳變異進(jìn)一步采用如下步驟進(jìn)行篩選：優(yōu)先關(guān)注公共數(shù)據(jù)庫(kù)中收錄的可能與疾病相關(guān)的遺傳變異，如小的插入/缺失(INDEL)、典型的剪切位點(diǎn)改變及錯(cuò)義變異；根據(jù)正常人數(shù)據(jù)庫(kù)過(guò)濾大于5%的SNP突變(已知的 MAF≥5%的致病性變異除外)；篩選過(guò)濾掉無(wú)義突變、移碼突變、可變剪切及錯(cuò)義突變等因素；再次與HGMD、ClinVar數(shù)據(jù)庫(kù)收錄的遺傳變異進(jìn)行比對(duì)；根據(jù)保守性和軟件預(yù)測(cè)有害性的結(jié)果，進(jìn)行過(guò)濾篩選；最后根據(jù)臨床表型，進(jìn)一步篩選過(guò)濾致病基因突變。

1.5 Sanger測(cè)序

對(duì)患兒和其父母相關(guān)突變所在區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物送蘇州泓迅生物科技有限公司進(jìn)行一代測(cè)序，進(jìn)一步驗(yàn)證基因突變情況。具體步驟為：從NCBI網(wǎng)站下載MYH7基因DNA全序列(NM_000257.3，Genebank ID:4625)；采用Primer 5軟件設(shè)計(jì)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)引物，由上海生工生物工程有限公司合成；利用PCR試劑盒(天根生化科技有限公司)進(jìn)行擴(kuò)增。引物序列：F:5′-CCAGCAGTC-ATCTCTTTACCAA-3′；R:5′-CCCAGTGGCAT-ATATCACCT-3′。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；然后以94 ℃變性25 s，55 ℃退火25 s，72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。膠回收、純化，采用正向測(cè)序，分析基因序列，然后與標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比對(duì)分析。

2 結(jié) 果

2.1 先證者臨床表型

先證者(Ⅲ-1)為男性(圖1)，12歲。心電圖提示竇性心動(dòng)過(guò)緩、異常Q波、ST改變(Ⅱ、V5、V6、V7導(dǎo)聯(lián)ST壓低0.5～1.2 mm)、T波改變(各導(dǎo)聯(lián)T波低鈍、倒置)；超聲心動(dòng)圖檢查提示心房增大，左心室舒張末期內(nèi)徑為4.2 cm，左心室收縮末內(nèi)徑為2.6 cm，左心室射血分?jǐn)?shù)為69%，左心室縮短分?jǐn)?shù)為39%。左心室流出道流速快(2.4 m/s)，二尖瓣中度反流，三尖瓣前葉脫垂伴輕中度反流(反流壓差為38 kPa)。

2.2 致病基因檢測(cè)

通過(guò)WES總共篩查出5個(gè)致病基因，分別為MYH7(NM_000257.3)、AGL (NM_000028)、KCNV2 (NM_133497)、ILDR1 (NM_001199799)以及RDX (NM_002906)。見(jiàn)表1。查閱OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)，根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)和臨床表型分析，僅MYH7基因突變與臨床表型有關(guān)聯(lián)。WES測(cè)序發(fā)現(xiàn)先證者攜帶MYH7基因雜合突變c.1210G>A，進(jìn)一步通過(guò)Sanger測(cè)序證實(shí)其突變(圖2)，家系遺傳篩查，先證者父親和母親均無(wú)突變。詢問(wèn)家族史，患兒的伯父心源性猝死，未采集到相關(guān)血液樣本等，故無(wú)法推測(cè)是否由于家族性HCM誘導(dǎo)的心源性猝死。該突變導(dǎo)致纈氨酸突變?yōu)榧琢虬彼?，Clustal X分析MYH7基因404 位氨基酸殘基的保守性發(fā)現(xiàn)，其在不同物種之間具有高度保守性(圖3)。

“□”代表正常男性，“○”代表正常女性；Ⅱ-2為患兒伯父，已去世；Ⅲ-1為患兒。

圖1HCM家系圖

紅、綠、藍(lán)、黑四色波峰分別代表胸腺嘧啶脫氧核苷酸、腺嘌呤脫氧核苷酸、胞嘧啶脫氧核苷酸、鳥(niǎo)嘌呤脫氧核苷酸。箭頭所指即為突變位點(diǎn)，綠色主峰下出現(xiàn)黑色套峰，表明發(fā)生雜合突變。

圖2HCM患兒及其家系Sanger測(cè)序圖

人：NP_000248.2，類人猿：XP_001150786.3，家犬：NP_001107183.1，牛：NP_777152.1，鼠：NP_542766.1，大鼠：NP_058936.1，雞：NP_001001302.1，斑馬魚(yú)：NP_001106204.1。

圖3 突變位點(diǎn)在不同物種氨基酸同源序列比對(duì)結(jié)果

3 討 論

HCM是主要由編碼肌小節(jié)蛋白的基因突變所導(dǎo)致的常染色體顯性遺傳病，其中MYH7基因是HCM的主要致病基因之一，占所有遺傳篩查陽(yáng)性病人的35%～40%[13-14]，明確MYH7基因突變所致HCM的臨床特點(diǎn)，對(duì)于精準(zhǔn)判斷此類病人的預(yù)后并進(jìn)行危險(xiǎn)分層具有重要意義。在本研究中，通過(guò)對(duì)1個(gè)漢族HCM家系進(jìn)行全面的致病基因篩查，通過(guò)生物信息學(xué)分析、數(shù)據(jù)庫(kù)注釋、軟件預(yù)測(cè)和臨床表型分析，發(fā)現(xiàn)患兒的表型可能由MYH7基因的V404M突變所致，該突變具有較嚴(yán)重的致病性。本研究進(jìn)一步證實(shí)，MYH7基因的V404M突變?yōu)橛泻ν蛔?，可能為HCM的致病基因。

HCM是常染色體顯性遺傳病，較常見(jiàn)的心血管疾病。HCM相關(guān)的粗肌絲相關(guān)基因MYH7的突變，影響肌纖維產(chǎn)生張力，心肌代償性增生及肥厚[15]，因此，特異性的心肌球蛋白抑制劑可能是此類基因突變疾病的潛在治療方法[16-18]。β受體阻滯劑可以減輕左心室流出道梗阻的癥狀。應(yīng)根據(jù)心率、血壓、流出道壓力階差水平等調(diào)整β受體阻滯劑的使用量，并逐漸增加至最大耐受量，并堅(jiān)持長(zhǎng)期甚至終生服藥，避免突然停藥[19]。本例患兒給予螺內(nèi)酯、卡托普利減輕心臟負(fù)荷治療，給予倍他樂(lè)克改善心功能，經(jīng)過(guò)精準(zhǔn)診治，患兒情況可，無(wú)特殊不適，無(wú)胸悶胸痛等。

隨著二代測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)，特別是WES等二代測(cè)序能快速準(zhǔn)確地了解基因序列信息，可以快速精準(zhǔn)地幫助我們了解遺傳性疾病，通過(guò)對(duì)家族相關(guān)基因的比對(duì)分析，能夠較準(zhǔn)確地發(fā)現(xiàn)致病基因及突變[20]。本研究通過(guò)外顯子捕獲技術(shù)富集全基因組DNA，同時(shí)應(yīng)用SIFT、PolyPhen2、HSF軟件，預(yù)測(cè)基因突變的致病性，分析臨床表型的同時(shí)，能夠較準(zhǔn)確地找出相關(guān)的致病基因。本研究全外顯子測(cè)序發(fā)現(xiàn)了與心肌病緊密相關(guān)的MYH7基因突變。本研究通過(guò)WES發(fā)現(xiàn)了先證者攜帶的MYH7基因雜合c.1210G>A，進(jìn)一步通過(guò)Sanger測(cè)序證實(shí)了其突變，家系遺傳篩查先證者父親和母親均無(wú)突變，提示HCM不僅僅是由遺傳因素決定，后天的環(huán)境因素也可能參與HCM致病調(diào)控。該突變導(dǎo)致纈氨酸變?yōu)榧琢虬彼?，ClustalX分析MYH7基因404位氨基酸殘基的保守性發(fā)現(xiàn)，其在不同物種之間具有高度保守性，若該位置發(fā)生突變，很可能會(huì)影響基因和蛋白質(zhì)的功能。VAN DRIEST等[21]研究顯示，綜合分析389個(gè)HCM病人的基因突變，分析MYH7基因雜合c.1210G>A突變，導(dǎo)致纈氨酸突變?yōu)榧琢虬彼?，但是沒(méi)有詳細(xì)指出該突變的致病性等。

精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)研究前景廣闊，其在心血管領(lǐng)域大有可為[22]。通過(guò)WES測(cè)序，本研究發(fā)現(xiàn)了該家系中MYH7基因的突變位點(diǎn)，并通過(guò)各種預(yù)測(cè)軟件如SIFT、Polyphen2、MutationTaster等，預(yù)測(cè)該突變?yōu)橹虏⊥蛔?，并且該突變與疾病表型一致，攜帶該基因突變的病人應(yīng)考慮安裝植入性除顫器，預(yù)防猝死。其次，對(duì)HCM病人進(jìn)行致病基因檢測(cè)，明確疾病的遺傳因素，對(duì)于家系成員的早期診斷具有重要意義，有助于突變攜帶者的針對(duì)性早期干預(yù)和治療。因此，對(duì)于家系中的攜帶者，可以告知其本人及家屬潛在的風(fēng)險(xiǎn)，注重預(yù)防并定期隨訪，以針對(duì)心功能出現(xiàn)的異常情況及時(shí)給予干預(yù)。