目標(biāo)外顯子組捕獲測序發(fā)現(xiàn)INPP5E突變致Joubert綜合征1例

羅敏娜 劉志敏 沈 玥 王 昊 曹宗富 陳西華 馬斯禹,3 高華方徐保平 彭 蕓 馬 旭?

1.國家衛(wèi)生計生委科學(xué)技術(shù)研究所(北京,100081);2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院;3.北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院研究生院

Joubert綜合征(JS)是一種罕見的顱腦發(fā)育畸形疾病,發(fā)病率約為1∶100 000[1-2]。Joubert綜合征診斷主要通過MRI結(jié)合臨床表現(xiàn)來確診,MRI顯示的“磨牙征”(MTS)是其診斷的最重要特征[3]。Joubert綜合征患者最主要的臨床表現(xiàn)有:小腦蚓部發(fā)育不良或缺如、肌張力低、發(fā)育遲緩、陣發(fā)性呼吸過度或呼吸暫停、異常的眼球運動,在部分患者中還可能出現(xiàn)視網(wǎng)膜營養(yǎng)不良、腎臟疾病、眼組織缺損、肝纖維化、多指(趾)癥等癥狀[2,4]。目前已有超過30個Joubert綜合征的致病基因被發(fā)現(xiàn),其中C5orf42、CC2D2 A、AHI1、CEP290、T MEM67等是最主要的致病基因[5-8]。Joubert綜合征通常表現(xiàn)為常染色體隱性遺傳的模式,僅在因OFD1所致的Joubert綜合征的家庭表現(xiàn)為X連鎖隱性遺傳模式[2,7-9]。鑒于大部分Joubert綜合征的致病基因都參與了纖毛的功能以及相關(guān)的信號途徑調(diào)控,因此研究者們把Joubert綜合征與Meckel綜合征(MKS)、Bar det Biedl綜合征(BBS)、窒息性胸廓發(fā)育不良(JATD)、常染色體隱性多囊腎(ARPKD)、常染色體顯性多囊腎(ARPKD)、腎單位腎癆(NPHP)等其他因纖毛結(jié)構(gòu)和功能異常而導(dǎo)致的人類疾病統(tǒng)稱為“纖毛相關(guān)疾病(ciliopat hy)”,這些疾病之間不僅臨床表現(xiàn)存在重疊,致病基因也有部分重合[10-12]。此前,解放軍總醫(yī)院301醫(yī)院聯(lián)合北京邁基諾基因科技有限責(zé)任公司研制了一套針對纖毛相關(guān)疾病的目標(biāo)基因捕獲技術(shù)平臺[13]。本研究利用該捕獲技術(shù)平臺和高通量測序技術(shù),對一個Joubert綜合征的先證者DNA進行檢測,分析測序數(shù)據(jù)并按照美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)和基因組學(xué)學(xué)院(ACMG)的解讀規(guī)則[14]進行解讀,在父母中進行Sanger測序驗證,發(fā)現(xiàn)了INPP5E基因上的2個雜合變異位點:c.1524C＞G以及c.1688G＞A是該Joubert綜合征病例的致病原因,這是國內(nèi)第1例報道INPP5E基因?qū)е碌腏oubert綜合征病例,且c.1524C＞G是之前未報道的新變異位點。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

本課題相關(guān)的樣本采集及實驗流程均由國家衛(wèi)生計生委科學(xué)技術(shù)研究所倫理審查委員會審查通過。血樣和臨床資料的收集符合知情同意原則。用于高通量測序分析的血液樣本取自首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院收治的Joubert綜合征患者及其家屬。家屬簽署了針對本研究的知情同意書。全血基因組DNA提取試劑盒購自QIAGEN公司,Taq酶、DNA mar ker購自全式金公司,PCR擴增引物由華大六合科技有限公司合成。

1.2 DNA提取和高通量測序

按照QIAa mp DNA Bl ood Mini Kit(Qiagen,德國)的操作說明從全血中提取基因組DNA,利用Qubit2.0(Invitrogen,美國)進行定量。取0.5μg待測樣品DNA用超聲儀(Covaris,美國)隨機打成180～280bp的片段,利用包括113個纖毛疾病致病基因的外顯子區(qū)域序列捕獲試劑盒(北京邁基諾公司)進行目標(biāo)基因捕獲,構(gòu)建文庫,在Hiseq2500測序儀上(Ill u mina,美國)進行PE150測序。

1.3 測序數(shù)據(jù)分析

測序數(shù)據(jù)經(jīng)去除污染等質(zhì)量控制步驟用BWA軟件以GRCh37.1/hg19基因組為參考序列進行比對。用GATK軟件對SNP和In Del位點進行檢測,用ANNOVAR軟件同時關(guān)聯(lián)dbSNP147、1000g、Ex AC、HGMD以及OMI M等數(shù)據(jù)庫對所有變異位點進行注釋,并進行初步過濾篩選,過濾標(biāo)準(zhǔn)為:① 保留突變堿基測序次數(shù)＞5的位點;②保留在正常人數(shù)據(jù)庫以及內(nèi)部數(shù)據(jù)庫中沒有出現(xiàn)過或者MAF≤0.01的位點;③去除同義突變位點;④保留文獻報道的突變位點。根據(jù)ACMG的解讀規(guī)則對過濾后的變異位點進行分級,確定可能的致病基因及變異位點,并利用MEGA6.0軟件對不同物種的保守性進行分析。

1.4 Sanger測序驗證

針對候選基因變異位點所在的外顯子設(shè)計上下游引物,以患兒及其父母的基因組DNA為模板進行聚合酶鏈?zhǔn)?PCR)反應(yīng),并利用Sanger測序法進行驗證。PCR引物序列見表1。PCR擴增反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后由ABI 3730xl完成Sanger測序;使用Chr o mas軟件查看Sanger測序峰圖,用Seq Man軟件比對Sanger測序結(jié)果。

表1 CSPP1致病位點擴增引物

2 結(jié)果

2.1 臨床表現(xiàn)

患兒,男,出生后5個月因“眼瞼下垂、雙眼不能追物”于北京兒童醫(yī)院就診。主要表現(xiàn)為雙眼追視不靈,聽聲尚可,不會豎頭,喜頭后仰,向前打挺,能逗笑,會咿呀發(fā)音?；純合档谝惶サ谝划a(chǎn),足月,試產(chǎn)后失敗轉(zhuǎn)剖宮產(chǎn),出生體重3.2kg,阿氏評分不詳,無黃疸。母孕期無毒物、藥物及射線接觸史。否認近親結(jié)婚,家族史無特殊。查體:頭圍44.2c m,前囟4.0×3.8c m,尚平坦;面紋對稱,左眼瞼下垂;四肢肌張力低,肌力尚可;膝腱反射能引出;臍疝;右手通貫掌。

2.2 輔助檢查

聽覺誘發(fā)電位反應(yīng)通過;染色體核型46,XY;血氨基酸及尿有機酸代謝篩查無明顯異常;肝、膽、胰、脾及泌尿系統(tǒng)超聲均未見異常;顱腦MRI:T1 WI小腦上腳增粗,中腦呈磨牙狀(圖1),小腦蚓部發(fā)育不良,符合Joubert綜合征的影像學(xué)特點。6個月時復(fù)診行智商測定:適應(yīng)性45分,大運動41分,精細運動33分,語言及個人社交各50分,屬重度智力發(fā)育遲緩。此后進行康復(fù)訓(xùn)練治療,至7～8個月時能抬頭和翻身,頭控欠佳,雙眼能追物,9個月能坐,12個月能扶站,2歲10個月時可獨走,步態(tài)不穩(wěn)。

圖1 患兒頭部MRI影像圖

2.3 測序質(zhì)量及分析

目標(biāo)靶向捕獲測序共產(chǎn)出原始數(shù)據(jù)430.07 M,去除低質(zhì)量的、污染的數(shù)據(jù)以后,得到416.5 M數(shù)據(jù),目標(biāo)捕獲區(qū)域的平均測序深度為208.12×,≥1×測序深度下的覆蓋度為98.7%,≥4×測序深度下的覆蓋度為97.9%,≥10×測序深度下的覆蓋度為96.6%,≥20×測序深度下的覆蓋度為94.1%,數(shù)據(jù)質(zhì)量符合實驗設(shè)計要求。在經(jīng)db SNP147、1000 g、ESP6500、Ex AC以及HGMD數(shù)據(jù)庫的過濾篩選以后,發(fā)現(xiàn)了8號染色體上INPP5E基因(NM_019892.4)的2個錯義突變位點。其中一個錯義突變位點位于7號外顯子區(qū)的1524位,由胞嘧啶突變?yōu)轼B嘌呤(c.1524C＞G),可導(dǎo)致其蛋白質(zhì)翻譯在第508位天冬氨酸變成谷氨酸。該位點在db SNP147、1000g、ESP6500、Ex AC中均未見人群頻率的報道,未收入HGMD數(shù)據(jù)庫,是罕見的變異位點,SIFT以及Phly Phen軟件均預(yù)測有害,保守性分析顯示508位的天冬氨酸在人、猴、小鼠、大鼠、牛、斑馬魚以及線蟲的INPP5E中都非常保守(圖2)。另一個錯義突變位點是在9號外顯子區(qū)的1688位由鳥嘌呤突變?yōu)橄汆堰?可導(dǎo)致其蛋白質(zhì)翻譯在第563位精氨酸變成組氨酸。該位點在dbSNP數(shù)據(jù)庫中的編號為rs121918128,在Ex AC中數(shù)據(jù)庫中顯示其突變頻率為0.00005,Clin Var數(shù)據(jù)庫將其定義為致病性變異,且已被 HGMD收錄(ID:CM095406)。之前有多篇文獻報道過該變異位點[15-16]。

2.4 Sanger測序驗證

先證者的c.1524C＞G位點來自于母親,c.1688G＞A位點來自于父親,符合常染色體隱性遺傳分離規(guī)律(圖3)。其中,c.1688G＞A在過去的文獻中已有報道[16],c.1524C＞G在所有已知的數(shù)據(jù)庫中沒有記錄,屬于極罕見的變異。由此判定,INPP5E基因的c.1524C＞G以及c.1688G＞A的復(fù)合雜合變異為該Joubert綜合征患兒的致病性變異位點。

圖2 INPP5E變異位點的保守性分析

圖3 Sanger測序驗證結(jié)果圖

3 討論

Joubert綜合征最早于1969年被發(fā)現(xiàn),是一種罕見的小腦發(fā)育畸形。Joubert綜合征的臨床表現(xiàn)具有很強的異質(zhì)性,目前國際上將所有具有“磨牙征”的疾病統(tǒng)稱為“Joubert綜合征及相關(guān)疾病”(JSRD),并根據(jù)伴發(fā)癥的不同將其分為6大類[17]。本文報道的家系先證者,小腦蚓部具有明顯的“磨牙征”改變,小腦蚓部發(fā)育不良、四肢肌張力低,發(fā)育落后,符合Joubert綜合征的基本特點。同時,該患兒無多指、腎臟、肝臟及眼睛相關(guān)并發(fā)癥,考慮為單純型的Joubert綜合征。

目前國內(nèi)已報道Joubert綜合征病例80余例[18-20]。少數(shù)病例有致病基因及位點的報道,分別是 CC2D2 A[21-22]、CEP290[23]、OFD1[24]、C5orf 42[25]以及CSPP1[26]基因的突變導(dǎo)致的。國外研究表明,雖然JSRD的致病基因多達30多個,但是2/3患者的致病突變主要集中在C5orf42、CC2D2 A、AHI1、T MEM67、CEP290、CSPP1、KIAA0586這7個基因上,而T MEM231、ZNF423等基因突變則非常少見或者僅在特定的人種或特殊的家系中發(fā)現(xiàn),占比不到1%[7,8,27]。本研究嘗試用針對纖毛相關(guān)疾病的目標(biāo)外顯子組捕獲測序來進行基因檢測。所得測序數(shù)據(jù)經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)分析流程,按照ACMG的解讀規(guī)則[13]對變異位點進行解讀,最終在已知的致病基因INPP5E中篩選到了候選的致病變異位點,c.1524C＞G及c.1688 G＞A,后者是已經(jīng)報道的致病變異位點。蛋白質(zhì)保守性分析顯示這兩個氨基酸位點在不同物種間非常保守,提示該位點的氨基酸改變可能對蛋白功能有重要影響。經(jīng)PCR擴增及Sanger測序驗證,表明INPP5E的c.1524C＞G及c.1688 G＞A的復(fù)合雜合變異符合遺傳共分離的規(guī)律,為該患者的致病性變異位點。

早在1999年,Saar等[28]在2個近親結(jié)婚的阿拉伯Joubert綜合征家系中發(fā)現(xiàn)9號染色體長臂的D9S158位點附近的LOD值為3.7,提示該區(qū)域存在Joubert綜合征的致病基因。直到2009年,Jacoby等[15]通過對7個Joubert綜合征家系的連鎖分析定位到了9q34.2區(qū)域,并在INPP5E基因上發(fā)現(xiàn)了6個不同的錯義突變,進一步證實了INPP5E與纖毛相關(guān)疾病的聯(lián)系。此后在一些不同的研究都發(fā)現(xiàn)了由INPP5E導(dǎo)致的JSRD病例。INPP5E基因位于9號染色體,該基因編碼的蛋白質(zhì)是磷脂酰肌醇-5-磷酸酶(INPP5E),分子量為70205 Da,由644個氨基酸組成。INPP5E的主要功能是催化PI(3,4,5)P3與PI(4,5)P2分別生成PI(3,4)P2與PI4P。Jacoby等[29]研究發(fā)現(xiàn)鼠胚的成纖維細胞經(jīng)過血清饑餓以后誘導(dǎo)產(chǎn)生初級纖毛,INPP5E定位于纖毛的軸絲中。INPP5E的失活并不影響纖毛的組裝,但是加入血清以后會破壞纖毛內(nèi)已建立的穩(wěn)態(tài)。阻斷磷酸肌醇-3-磷酸酶(PI3 K)的活性或者阻斷纖毛中血小板衍生生長因子受體α(PDGFRα)可以修復(fù)纖毛的穩(wěn)態(tài)。Bielas等[15]研究發(fā)現(xiàn)與JSRD有關(guān)的INPP5E錯義突變主要集中分布在磷酸酶結(jié)構(gòu)域中,影響了磷酸酶的活性,導(dǎo)致細胞內(nèi)磷酸肌醇的濃度改變,使得纖毛在外界刺激時表現(xiàn)不穩(wěn)定。2016年,Xu等[30]用模式動物斑馬魚研究了INPP5E的作用機制,他們發(fā)現(xiàn)INPP5E在腎臟上皮細胞中是一個關(guān)鍵的細胞極性調(diào)控因子,它通過水解抑制PI(3.4.5)P3從而穩(wěn)定PI(4,5)P2在細胞表面的分布,同時募集Ezrin和F-actin并把基體(basal body)錨定到細胞表面,從而促進纖毛生成。Har dee等[31]發(fā)現(xiàn)在INPP5E突變導(dǎo)致的Joubert綜合征患者的成纖維細胞表現(xiàn)出無纖毛或者短纖毛的表型,表明這些患者的纖毛發(fā)生和維持機制受到了損害。

本文采用目標(biāo)捕獲測序技術(shù),結(jié)合Sanger測序驗證,檢測到了Joubert綜合征家系中INPP5E基因的兩個雜合變異(c.1524C＞G及c.1688 G＞A),是國內(nèi)首次報道由INPP5E基因變異引起的Joubert綜合征病例,其中c.1524C＞G是新發(fā)現(xiàn)的變異位點。這一研究結(jié)果不僅拓寬了INPP5E的突變譜,也為將來可能進行的產(chǎn)前診斷提供了分子基礎(chǔ)。