酵母雙雜交技術(shù)篩選人95D細(xì)胞中肺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白1相互作用蛋白及其驗(yàn)證

李彥芹，劉 揚(yáng)，梁麗玲，許 陽(yáng)

在我國(guó)乃至全球，肺癌都具有高發(fā)病率和高死亡率的特點(diǎn)，研究與肺癌相關(guān)的基因?qū)Ψ伟┑脑\斷及治療有重要意義。肺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白1(lung cancer metastasisrelated protein 1，LCMR1)基因是從人肺巨細(xì)胞癌細(xì)胞系中分離的與肺癌轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)的基因[1]，GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)注冊(cè)號(hào) (Gene ID：AY148462)。該基因全長(zhǎng)949 bp，分子量約19 kD，編碼177個(gè)氨基酸，在人體多種組織中廣泛分布。前期研究發(fā)現(xiàn)，LCMR1基因的表達(dá)水平可以影響肺癌細(xì)胞的凋亡[2]，并且對(duì)癌癥的侵襲性起關(guān)鍵作用[3]。肺癌的發(fā)生發(fā)展在體內(nèi)存在復(fù)雜的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)，本研究通過(guò)酵母雙雜交技術(shù)及免疫共沉淀、GST pull-down篩選及驗(yàn)證LCMR1基因與其相互作用的蛋白，為肺癌的研究機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與材料 誘餌質(zhì)粒pGBKT7-LCMR1、pGEX-5T質(zhì)粒、pGEX-5T-LCMR1質(zhì)粒、pCMV-Myc質(zhì)粒及pcDNA3.0-flag質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建并保存。pGBKT7 Cloning Vector、陽(yáng)性對(duì)照載體pCL1、酵母菌株AH109、Matchmarker試劑盒購(gòu)自美國(guó)Clontech公司，感受態(tài)大腸桿菌DH5α購(gòu)自北京天根生物公司。人胚腎293細(xì)胞、A549細(xì)胞、95D細(xì)胞、大腸桿菌BL21由我室保存。質(zhì)粒提取純化試劑盒購(gòu)自美國(guó)QIAGEN公司，GST Bind Resin購(gòu)自美國(guó)Novagen公司，TNT T7 Quick體外翻譯轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司。Flag標(biāo)簽抗體購(gòu)自Sigma公司，Myc標(biāo)簽抗體購(gòu)自Abcam公司，β-acting抗體購(gòu)自SantaCruz公司。

1.2 誘餌質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入AH109 復(fù)蘇轉(zhuǎn)化有pGBKT7-LCMR1的凍存菌液于LB培養(yǎng)液中，37 ℃、200 r/min過(guò)夜振蕩培養(yǎng)，增菌后提取質(zhì)粒pGBKT7-LCMR1。按照Clontech說(shuō)明書將pGBKT7-LCMR1轉(zhuǎn)化入AH109中，AH109/pGBKT7作為空載體對(duì)照，轉(zhuǎn)化后的各組菌液取100 μl 接種至SD/- Trp平板，30 ℃倒置培養(yǎng)，觀察克隆生長(zhǎng)情況。未轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的AH109作為陰性對(duì)照，接種至YPDA培養(yǎng)液中，30 ℃ 250 r/min振蕩培養(yǎng)18～20 h。從SD/-Trp平板上挑取1個(gè)轉(zhuǎn)化了誘餌載體的AH109菌落，加入YPDA培養(yǎng)液中30 ℃ 250 r/min振蕩培養(yǎng)，提取酵母蛋白，Western blot 驗(yàn)證BD-LCMR1 融合蛋白的表達(dá)。

1.3 95D細(xì)胞cDNA文庫(kù)的構(gòu)建與篩選 復(fù)蘇肺癌95D細(xì)胞，按照TRIZOL說(shuō)明書提取95D細(xì)胞總RNA，1%甲醛變性凝膠電泳驗(yàn)證RNA完整性，合成cDNA第一鏈后，應(yīng)用長(zhǎng)距離PCR擴(kuò)增ds cDNA，將ds cDNA、pGADT7-Rec、pGBKT7 -LCMR1共轉(zhuǎn)化酵母菌AH109，涂布于150 mm SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp四缺板，以共轉(zhuǎn)pGBKT7-Lam及pGADT7-RecT為陰性對(duì)照，以共轉(zhuǎn)pGBKT7-53、pGADT7 - RecT為陽(yáng)性對(duì)照，30 ℃培養(yǎng)3～8 d。

1.4 排除假陽(yáng)性克隆 選擇SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp培養(yǎng)板上的生長(zhǎng)良好的白色克隆重復(fù)劃線2～3輪，再將克隆涂布于SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal平板培養(yǎng)，觀察菌落生長(zhǎng)及顯色情況，排除假陽(yáng)性克隆。提取候選克隆酵母質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH-5α，涂布于LB/Amp+(60 μg/ml)平板，37 ℃倒置培養(yǎng)過(guò)夜，挑取單個(gè)克隆，接種于5ml LB/Amp+，提取文庫(kù)質(zhì)粒。將單個(gè)文庫(kù)質(zhì)粒與pGBKT7- LCMR1誘餌質(zhì)粒共轉(zhuǎn)入酵母菌AH109。將菌液涂于SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp和SD/ -Ade / -His/-Leu/-Trp/X-α-Gal，回復(fù)驗(yàn)證候選文庫(kù)質(zhì)粒與誘餌蛋白的相互作用。提取陽(yáng)性克隆測(cè)序。

1.5 免疫共沉淀法細(xì)胞內(nèi)驗(yàn)證蛋白相互作用 TRIzol法提取293細(xì)胞RNA，合成cDNA第一鏈，設(shè)計(jì)含特殊酶切位點(diǎn)的基因引物，引物序列如下。RPL29上游：ggaggatccatggccaagtccaagaacc；下游：ggcctcgagctactctgaagcctttgtag。GNG5上游：ggggatccaccatgtctggctcctcc；下游ggcctcgagaggagtggtttgggaaacc。LCMR1上游：atgtgtcgaccatgagggaactgccaggtag；下游：taatgcggccgcttagcgtaggctgctgctgc。按Promega內(nèi)切酶說(shuō)明書對(duì)RPL29的PCR產(chǎn)物、GNG5的PCR產(chǎn)物及pcDNA3.0-flag質(zhì)粒進(jìn)行BamH Ⅰ和Xho Ⅰ雙酶切，對(duì)LCMR1的PCR產(chǎn)物及pCMV-Myc質(zhì)粒進(jìn)行Sal Ⅰ及Not Ⅰ雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)DNA連接酶4 ℃過(guò)夜，轉(zhuǎn)化入感受態(tài)DH5α。提取重組質(zhì)粒，對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行回復(fù)酶切驗(yàn)證及測(cè)序驗(yàn)證。將帶Myc標(biāo)簽的pCMV- Myc- LCMR1質(zhì)粒及有Flag標(biāo)簽的pcDNA3.0- flag- RPL29質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，提取細(xì)胞蛋白，用Flag抗體進(jìn)行免疫共沉淀反應(yīng)，用Myc抗體進(jìn)行Western blot分析，以單獨(dú)轉(zhuǎn)染pCMV- Myc- LCMR1質(zhì)粒及單獨(dú)轉(zhuǎn)染pcDNA3.0- flag- RPL29質(zhì)粒作為陰性對(duì)照。

1.6 GST pull down體外驗(yàn)證蛋白相互作用 將pGEX-5T質(zhì)粒、pGEX-5T- LCMR1質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH-5α，挑取菌落增菌，加入終濃度為0.6 mM 的IPTG，20 ℃誘導(dǎo)4 h，超聲破碎細(xì)菌蛋白，經(jīng)GST瓊脂糖珠純化，12.5%SDS-PAGE 電泳，考馬斯亮蘭染色，檢測(cè)GST蛋白及GST-LCMR1 融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)情況。利用TNT兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解液體系，根據(jù)TNT T7 Quick體外翻譯轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書在體外分別轉(zhuǎn)錄翻譯RPL29蛋白及GNG5蛋白，用35S 標(biāo)記蛋白全長(zhǎng)。向預(yù)處理好的GST Bind Resin中加入GST 融合蛋白粗提液、體外翻譯蛋白、10% BSA及裂解Buffer，共同孵育后，離心收集混合物通過(guò)12.5% SDS-PAGE電泳。凝膠經(jīng)干膠儀60 ℃干膠60 min，置于暗盒，-80 ℃曝光。

2 結(jié) 果

2.1 誘餌質(zhì)粒轉(zhuǎn)化AH109 以pGBKT7-LCMR1質(zhì)粒DNA為模板，經(jīng)PCR反應(yīng)并電泳，獲得600 bp單一特異產(chǎn)物(圖1)。誘餌質(zhì)粒無(wú)自激活作用，對(duì)宿主無(wú)毒性(結(jié)果略)。pGBKT7-LCMR1質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入酵母菌AH109后，涂于SD/-Trp平板，30 ℃倒置培養(yǎng)4 d，出現(xiàn)2～3 mm白色菌落，質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)化酵母菌。提取轉(zhuǎn)化有pGBKT7-LCMR1的酵母菌總蛋白，經(jīng)12%SDS-PAGE電泳，Western blot結(jié)果顯示，所檢測(cè)蛋白分子量約40 kD，條帶單一，表明BD-LCMR1融合蛋白表達(dá)正確。

圖1 LCMR1編碼區(qū)PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳

2.2 95D細(xì)胞cDNA文庫(kù)的構(gòu)建與篩選 肺癌95D細(xì)胞總RNA完整性經(jīng)1%甲醛變性凝膠電泳檢測(cè)，出現(xiàn)3條帶，分別是28S、18S和5S，且28S亮度是18S的2倍，提示總RNA質(zhì)量合格(圖2)。以95D總RNA為模板長(zhǎng)距離PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳結(jié)果顯示出完整彌散狀條帶，大小在250～6000 bp，符合文庫(kù)構(gòu)建要求(圖3)。將共轉(zhuǎn)化菌液涂布于SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp四缺平板，3～8 d后平板上有2～3 mm白色菌落長(zhǎng)出，共獲得20個(gè)候選克隆。

2.3 排除假陽(yáng)性克隆 將20個(gè)候選克隆在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp培養(yǎng)板上劃線培養(yǎng)2～3次，有16個(gè)克隆生長(zhǎng)良好。將16個(gè)克隆在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal平板培養(yǎng)，獲得12個(gè)藍(lán)色克隆。將上述12個(gè)文庫(kù)質(zhì)粒與誘餌質(zhì)粒再次共轉(zhuǎn)化酵母菌，經(jīng)四缺平板及X-α-Gal篩選，最終獲得6個(gè)陽(yáng)性克隆。對(duì)6個(gè)陽(yáng)性克隆質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序分析并BLAST比對(duì)，確定6種文庫(kù)片段，分別是GNG5、核糖體蛋白L29(RPL29)、DEK、CCAR1、G3BP1及LGMN。

圖2 總RNA 1%甲醛變性電泳

圖3 瓊脂糖凝膠電泳

2.4 免疫共沉淀法細(xì)胞內(nèi)驗(yàn)證蛋白相互作用 通過(guò)對(duì)LCMR1及目的文庫(kù)基因RPL29、GNG5設(shè)計(jì)含特殊酶切位點(diǎn)引物，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳驗(yàn)證，擴(kuò)增成功(圖4)。對(duì)PCR產(chǎn)物及工具載體雙酶切連接后，提取重組載體pcDNA3.0-flag -RPL29、pcDNA3.0 -flag-GNG5和pCMV-Myc-LCMR1，經(jīng)雙酶切回復(fù)驗(yàn)證及測(cè)序比對(duì)，證實(shí)重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，單獨(dú)轉(zhuǎn)染pCMV- Myc- LCMR1質(zhì)粒或單獨(dú)轉(zhuǎn)染pcDNA3.0- flag- RPL29質(zhì)粒蛋白上樣孔，利用Flag抗體進(jìn)行免疫共沉淀反應(yīng)，用Myc抗體進(jìn)行Western blot分析，沒(méi)有檢測(cè)到蛋白Myc-LCMR1的存在(陰性對(duì)照)；在pCMV- Myc- LCMR1質(zhì)粒和pcDNA3.0- flag- RPL29質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞蛋白，經(jīng)Flag抗體免疫沉淀下來(lái)的蛋白混合物中，才可檢測(cè)到Myc-LCMR1的存在(圖5)。

圖4 瓊脂糖電泳

圖5 免疫共沉淀方法驗(yàn)證LCMR1與RPL29

2.5 GST pull down體外驗(yàn)證蛋白相互作用 GST及GST-LCMR1經(jīng)過(guò)IPTG誘導(dǎo)后，提取蛋白并純化，經(jīng)12.5%SDS-PAGE ，以GST蛋白為陰性對(duì)照，在分子量26 kD處出現(xiàn)單一特異條帶，而GST-LCMR1融合蛋白在47 kD處有單一特異性蛋白條帶，大小與GST-LCMR1融合蛋白理論分子量相符(圖6)，提示GST 蛋白及GST-LCMR1 融合蛋白純化成功。

圖6 GST瓊脂糖珠純化后的GST及GST-LCMR1融合蛋白

將純化的融合蛋白GST-LCMR1與RPL29共同孵育，混合物經(jīng)洗滌后經(jīng)SDS-PAGE電泳，所得凝膠進(jìn)行放射自顯影實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，在GST-LCMR1泳道出現(xiàn)與Input陽(yáng)性對(duì)照組在同一位置出現(xiàn)單一特異條帶，證明LCMR1蛋白與RPL29蛋白可以在體外發(fā)生特異性結(jié)合，兩者有直接相互作用(圖7)。不同的是，GST-LCMR1組沒(méi)有檢測(cè)到與Input陽(yáng)性對(duì)照組相同的條帶(圖8)，證實(shí)LCMR1與GNG5蛋白不能在體外發(fā)生相互作用。

圖7 GST pull down驗(yàn)證LCMR1與RPL29體外相互作用

圖8 GST pull down驗(yàn)證LCMR1與GNG5體外相互作用

3 討 論

蛋白質(zhì)必須通過(guò)與其他蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用才能實(shí)現(xiàn)其功能，這個(gè)過(guò)程貫穿于細(xì)胞的整個(gè)生理過(guò)程。酵母雙雜交系統(tǒng)正是這樣一種能高效篩選活細(xì)胞體內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用的技術(shù)[4]，能為蛋白質(zhì)功能研究提供大量信息。經(jīng)研究證實(shí)95D細(xì)胞系為非小細(xì)胞肺癌中具有高侵襲性和轉(zhuǎn)移性的肺癌細(xì)胞系[5,6]，因此，本研究應(yīng)用該技術(shù)以LCMR1為誘餌蛋白，對(duì)肺巨細(xì)胞癌95D細(xì)胞cDNA文庫(kù)進(jìn)行篩選，最終獲得了6個(gè)陽(yáng)性克隆，分別是GNG5、核糖體蛋白L29(RPL29)、DEK、CCAR1、G3BP1及LGMN，該6種蛋白對(duì)研究非小細(xì)胞肺癌具有很重要的科學(xué)價(jià)值。

DEK為原癌基因，其編碼蛋白由375個(gè)氨基酸殘基組成，在多種腫瘤組織中高表達(dá)。據(jù)文獻(xiàn)[7]報(bào)道，DEK蛋白與P53、NF-kB等蛋白發(fā)生相互作用，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的凋亡、轉(zhuǎn)移、血管生成等重要功能。CCAR1主要參與細(xì)胞生長(zhǎng)與凋亡，與β-catenin、P53等共同調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)與凋亡，并在多種組織中高表達(dá)[8]。LGMN又名legumain，該蛋白在多種實(shí)體瘤中高表達(dá)[9]。G3BP1能負(fù)向調(diào)節(jié)病毒的轉(zhuǎn)錄水平[10]。由此可見(jiàn)，本研究篩選出的與LCMR1相互作用的蛋白都參與了腫瘤形成的重要環(huán)節(jié)，我們推測(cè)LCMR1與相互蛋白一起，在癌癥復(fù)雜的機(jī)制網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮了重要作用。

由于酵母雙雜交系統(tǒng)也存在假陰性的特點(diǎn)，RPL29蛋白和GNG5蛋白作為最感興趣蛋白，本實(shí)驗(yàn)繼而通過(guò)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)及GST-pull down技術(shù)重點(diǎn)驗(yàn)證了與LCMR1相互作用的RPL29蛋白和GNG5蛋白。GNG5蛋白是一種三聚膜相關(guān)蛋白，能與膜表面相關(guān)受體結(jié)合，參與能量代謝。經(jīng)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)及GST-pull down技術(shù)證實(shí)，LCMR1與其相互作用為假陰性。

RPL29基因定位于染色體3p21.3-p21.2[11]，該基因?qū)儆诤颂求w蛋白L29E家族，編碼大60S亞基核糖體蛋白的部分蛋白，由159個(gè)氨基酸組成。該蛋白除表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)外，還以膜蛋白的形式表達(dá)于細(xì)胞表面。多項(xiàng)研究顯示，RPL29積極參與血管生成[12]，對(duì)腫瘤細(xì)胞血管營(yíng)養(yǎng)再生有重要意義[13]。RPL29又名肝素結(jié)合蛋白 (heparin interacting protein，HIP)，早期研究即發(fā)現(xiàn)該蛋白能與肝素特異性結(jié)合，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的粘附和親和能力[14]。腫瘤細(xì)胞核糖體蛋白異常表達(dá)的一個(gè)最顯著特點(diǎn)就是持續(xù)增殖，而核糖體主要是參與蛋白合成，腫瘤的進(jìn)展需要更高效的核糖體翻譯機(jī)制，因此在結(jié)腸癌和甲狀腺癌組織中觀察到RPL29表達(dá)增加[15,16]，而抑制RPL29的表達(dá)后能激活caspase-3及磷脂酰絲氨酸外翻，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡增加，并增強(qiáng)了腫瘤細(xì)胞的化療敏感性[17]。HIP/RPL29可與細(xì)胞表面及細(xì)胞外基質(zhì)中眾多肝素/硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPGs)相作用[14]，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和分化[18-21]。由此可見(jiàn)，HIP/RPL29在癌癥的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了很重要的作用。核糖體蛋白家族其他成員蛋白在肺癌中的作用已被闡明，在NSCLC患者組織中核糖體蛋白表達(dá)減少或磷酸化水平升高，提示預(yù)后不良[22-24]，但有關(guān)HIP/RPL29與LCMR1相互作用在NSCLC中的研究仍鮮有報(bào)道。

既往成果顯示，LCMR1蛋白表達(dá)與肺癌臨床分期相關(guān)[1]，該基因表達(dá)下調(diào)能抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力[2]。結(jié)合本研究酵母雙雜交技術(shù)及驗(yàn)證結(jié)果，LCMR1與HIP/RPL29在體內(nèi)、體外存在真實(shí)相互作用，但目前兩者在肺癌中的具體機(jī)制還不清楚。我們推測(cè)，LCMR1有可能通過(guò)調(diào)節(jié)HIP/RPL29磷酸化水平或共同作用于下游相關(guān)分子，對(duì)NSCLC發(fā)揮重要作用，這一推測(cè)還有待驗(yàn)證。因此，本研究在95D細(xì)胞中檢測(cè)到多種LCMR1相互作用蛋白，并驗(yàn)證了LCMR1與RPL29蛋白有相互作用，與GNG5蛋白無(wú)相互作用，為進(jìn)一步研究LCMR1蛋白在NSCLC中發(fā)揮的作用建立了科學(xué)的實(shí)驗(yàn)方法。