3D生物打印技術(shù)在皮膚科的應(yīng)用研究進(jìn)展

沈婷婷 高慧

[摘要]精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)是新世紀(jì)醫(yī)學(xué)發(fā)展的重要方向，而3D生物打印技術(shù)得益于轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)的興起和迅速發(fā)展，通過個(gè)性化、定制化的生產(chǎn)在臨床實(shí)踐中挽救了許多人的生命。3D生物打印技術(shù)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用已遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出了我們的想象，如今在皮膚科及相關(guān)領(lǐng)域也倍受關(guān)注。本文將重點(diǎn)闡述3D生物打印技術(shù)的原理和其在皮膚血管、干細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)等方面的演變，以及在皮膚病模型方面的潛在臨床應(yīng)用，并探討其目前的局限性和未來的研究方向。

[關(guān)鍵詞]3D皮膚生物打印；皮膚病學(xué)；演變；臨床應(yīng)用

[中圖分類號(hào)]R785 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A [文章編號(hào)]1008-6455（2018）06-0155-03

Abstract： Accurate medicine is the important direction of medical development in the new century， and thanks to the rise and rapid development of translational medicine 3D-biological-printing has saved many lives in clinical practice through personalized and customized production.3D-biological-printing technology in the wide range of application in the field of medicine has gone far beyond our imagination， now it has also gained considerable attention in dermatology and other related fields. This article will focus on the principle of 3D-biological-printing，and its technological breakthroughs in skin blood vessels，stem cells and extracellular matrix as well as its potential clinical application in skin-disease-related model. At last， I will discuss its current limitation and research direction in the future.

Key words： 3D skin bio-printing； dermatology； evolution； clinical application

皮膚是人體最大的器官，它覆蓋于人體表面，具有屏障、吸收、感覺、分泌和排泄、體溫調(diào)節(jié)和免疫等多種功能，對(duì)保護(hù)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定十分重要。皮膚的這些作用在中毒性表皮松解癥、大面積的慢性皮膚潰瘍、嚴(yán)重?zé)齻约熬薮笃つw腫瘤患者身上顯得尤為重要。一方面，由于自體/異體皮膚移植的來源和應(yīng)用常常受限；另一方面，目前應(yīng)用較多的組織工程皮膚又缺乏表皮或者真皮成分的支持，移植后很容易出現(xiàn)感染和瘢痕攣縮等并發(fā)癥[1]，并沒有實(shí)現(xiàn)真正意義上的恢復(fù)皮膚完整功能。因此，積極尋找理想的生物皮膚替代品還在不斷探索中。3D打印技術(shù)在制作醫(yī)學(xué)模型、骨替代品、個(gè)性化假肢及假體方面已相當(dāng)成熟，但是在皮膚科及相關(guān)領(lǐng)域的應(yīng)用還處于起步階段，本文就其在皮膚科的應(yīng)用現(xiàn)狀綜述如下。

1 3D打印技術(shù)的概述

1.1 3D打印技術(shù)的概念及分類：3D打?。?D Printing）技術(shù)誕生于20世紀(jì)80年代，又稱為“增材制造”[2]。其首次被應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域可追溯至20世紀(jì)90年代，醫(yī)生通過3D打印技術(shù)將顱骨的CT掃描數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為實(shí)物模型[3]，其原理是將計(jì)算機(jī)三維數(shù)字成像技術(shù)和多層次連續(xù)打印技術(shù)相結(jié)合，簡單來說就是利用重建的三維數(shù)字模型，將其分割成層狀，然后逐層堆積成實(shí)體模型。

3D打印在臨床上可以分為生物打印和非生物打印，3D生物打印是在3D打印基礎(chǔ)上以活細(xì)胞及其它細(xì)胞活性成分作為打印材料，最終實(shí)現(xiàn)生物活性組織的打印和制作[4]，兩者最大的區(qū)別就是有無細(xì)胞的參與。生物打印包括生物支架打印、細(xì)胞打印等，非生物打印包括打印醫(yī)學(xué)模型、口腔種植體、假肢假體等。

1.2 3D生物打印的技術(shù)與材料：用于3D生物打印的技術(shù)[5]主要包括四種：①激光燒結(jié)打印，按照預(yù)先設(shè)定好的程序，通過計(jì)算機(jī)的控制對(duì)粉末材料進(jìn)行激光加熱、燒結(jié)逐層累積形成所需的模型[6]；②噴墨細(xì)胞打印，3D噴印技術(shù)是根據(jù)電流體動(dòng)力學(xué)原理，使用特定的噴頭，噴印流態(tài)材料，直接形成模型器件的技術(shù)[7]；③立體平板印刷打印，以液態(tài)光敏樹脂為原料，通過紫外光掃描液態(tài)光敏樹脂使其固化，層層疊加，形成所需模型；④微擠壓成形打印，其原理是在加熱器內(nèi)融化熱熔性材料，之后抽成絲狀送進(jìn)熱熔噴頭，在噴頭內(nèi)再次被融化。其應(yīng)用于生物打印的主要缺點(diǎn)是打印出的組織中細(xì)胞存活率低。

在打印技術(shù)不斷成熟的過程中，打印材料的局限性致使其無法滿足醫(yī)療領(lǐng)域的苛刻要求，從而阻礙了3D生物打印技術(shù)更廣泛地應(yīng)用于臨床實(shí)踐。為突破打印材料的瓶頸，研究者們開展了許多相關(guān)的基礎(chǔ)研究，近年來取得較大突破。不斷有新材料應(yīng)用于醫(yī)學(xué)打印，從生物相容性、生物降解性、生物惰性、強(qiáng)度、耐久性和延展性方面考慮，如含有聚氨酯二丙烯酸酯和線性半結(jié)晶聚合物的油墨等[8]。細(xì)胞的選擇是第二個(gè)重要的步驟，很多研究者關(guān)注于角質(zhì)細(xì)胞（容易培養(yǎng)培養(yǎng)）和成纖維細(xì)胞（多向潛能）[9]。不同打印技術(shù)對(duì)打印材料有不同要求，一種材料可能只適合其中一種或幾種打印技術(shù)[10]。

2 3D皮膚生物打印的演變

一直以來，巨大皮膚腫瘤、嚴(yán)重皮膚燒傷等引起的皮膚大面積缺損所致的皮膚移植免疫排斥反應(yīng)等都是困擾人類的重大醫(yī)學(xué)問題。鑒于目前3D打印技術(shù)的發(fā)展水平有限，打印皮膚還局限在對(duì)皮膚表層（表皮和真皮，不超過200μm）進(jìn)行再造，不包括血管組織。3D生物打印人工皮膚還只是處于實(shí)驗(yàn)階段，未真正應(yīng)用于臨床。

Binder[11]是第一個(gè)用豬的傷口模型（背部10cm×10cm的皮膚缺損）在體外打印出皮膚。他們對(duì)傷口的皮膚厚度和寬度以及皮膚替代物（包含膠原蛋白、纖維蛋白原、角質(zhì)細(xì)胞以及成纖維細(xì)胞）進(jìn)行激光掃描并且使用噴墨生物打印機(jī)精準(zhǔn)輸送到要求的空間。2012年，基于激光誘導(dǎo)前向的原理，Koch等[12]使用激光輔助技術(shù)進(jìn)行生物打印，他觀察到基底膜的形成，提示皮膚組織的形成有Cx43（一種縫隙連接）在膜上的表達(dá)。2013年，麥克等[13]同樣利用激光輔助技術(shù)在小鼠背部完整的傷口上打印成纖維細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞和皮質(zhì)醇的混合物。用Ki67染色技術(shù)顯示細(xì)胞的增殖，但是缺少角質(zhì)形成細(xì)胞的分化以及皮膚血管的形成。

威克森林大學(xué)再生醫(yī)學(xué)研究院的研究員們研究了一種用噴墨打印技術(shù)制造皮膚薄層的方法[14]。制皮之前需要取傷者身上一塊不大于郵票的皮膚組織，分析這塊皮膚的層數(shù)分布后，將這塊組織放置在經(jīng)過消毒的噴墨盒中，研究員進(jìn)行編程并輸入打印機(jī)中，三維打印機(jī)將會(huì)按照程序參照供體的細(xì)胞，利用一種膠體和特殊材料，打印出與舊皮膚組織結(jié)構(gòu)相同的新皮膚組織[15]。

2.1 皮膚生物打印與血管：皮膚內(nèi)含有豐富血管，皮膚細(xì)胞要靠血液的供應(yīng)才能存活。因此，打印血管是打印皮膚的基礎(chǔ)。在組織工程應(yīng)用中，血管的形成可以通過組織形成細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞共同植入來實(shí)現(xiàn)，其中后者能形成功能性血管。3D生物打印技術(shù)的使用，具有改進(jìn)經(jīng)典組織工程方法的潛力，因?yàn)樗梢栽试S產(chǎn)生具有高空間控制的內(nèi)皮細(xì)胞分配的支架[16]。皮膚打印中最困難的就是實(shí)現(xiàn)多血管，早期企圖利用血管內(nèi)皮生長因子和角化細(xì)胞或支架來克服這一困難，卓有成效，但是在這個(gè)領(lǐng)域還需要更多研究。

德國弗朗霍夫激光技術(shù)研究所研究人員成功利用丙烯酸酯基的合成聚合物打印出血管，這種材料使得打印血管表面分布許多直徑數(shù)百微米的微孔，這有利于血細(xì)胞和組織的營養(yǎng)交換。新近有研究人員采用噴墨打印與立體光刻相結(jié)合的方法，解決了打印只有20um厚的多孔、多分叉人造血管的關(guān)鍵技術(shù)[17]。

2.2 皮膚生物打印與細(xì)胞外基質(zhì)：細(xì)胞外基質(zhì)是表皮細(xì)胞生長和分化的內(nèi)環(huán)境，如何構(gòu)建這個(gè)內(nèi)環(huán)境來誘導(dǎo)皮膚的生成，是當(dāng)前國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)[10]。汗腺在哺乳動(dòng)物中發(fā)揮著重要的體溫調(diào)節(jié)作用，像其他皮膚附屬器一樣，它們起源于表皮祖細(xì)胞，然而它們對(duì)損傷反應(yīng)的再生能力低，并且是否可以指定表皮祖細(xì)胞分化成汗腺細(xì)胞譜系，這在很大程度上仍然是未知的。使用3D生物打印技術(shù)來制造功能性體外細(xì)胞負(fù)載（基于明膠和海藻酸鈉的復(fù)合水凝膠）：3D細(xì)胞外基質(zhì)模擬物（3D-ECM），可有效為表皮祖細(xì)胞創(chuàng)造限制性生態(tài)位，確保單側(cè)分化為汗腺細(xì)胞。此外，將生物打印的3D-ECM直接遞送到小鼠的燒傷爪中可有助于汗腺功能性恢復(fù)，這對(duì)于治療深度燒傷或其他傷口至關(guān)重要[18]。

2.3 皮膚生物打印與干細(xì)胞：干細(xì)胞可以分化成內(nèi)皮細(xì)胞促進(jìn)血管生成，用于皮膚組織工程或者上皮本身促進(jìn)上皮再生。Skardal[19]使用激光沉積生物打印技術(shù)聯(lián)合具有分化成血管潛能的干細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)它們極大地促進(jìn)了傷口損傷后的愈合。骨源間充質(zhì)干細(xì)胞通過促進(jìn)血管生成、上皮化、造粒和組織形成表現(xiàn)出有效的體內(nèi)皮膚再生，羊水干細(xì)胞由于他們的高增殖能力，更強(qiáng)的血管生成反應(yīng)和可被忽略的免疫原性被選中。至第7天，這兩種類型的干細(xì)胞都消失了，說明皮膚傷口的再生作用可能歸因于干細(xì)胞生長因子的釋放以及某些常駐細(xì)胞的聚集而不是干細(xì)胞分化為角質(zhì)細(xì)胞或成纖維細(xì)胞。對(duì)于大面積燒傷的患者來說，尋找自體移植細(xì)胞是困難的，體外培養(yǎng)單種細(xì)胞，皮脂腺和毛囊的生長也受到限制。而干細(xì)胞可以自我更新并且分化成多種細(xì)胞類型。

3 皮膚病模型的潛在臨床應(yīng)用

潛在的皮膚病學(xué)應(yīng)用包括用3D生物皮膚來開發(fā)和測試新型生物療法，如燒傷、皮膚腫瘤、銀屑病、白癜風(fēng)等，此類疾病是皮膚科領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。這為備受皮膚病困擾的患者帶來了佳音[4]。許多疾病以及藥物的副作用都通過皮膚癥狀表現(xiàn)出來，3D生物打印等微細(xì)加工技術(shù)的最新突破使建立用于藥物篩選的更可靠的體外皮膚模型成為可能。對(duì)于人體相關(guān)的藥物測試通過結(jié)合不同的皮膚成分（如附屬器，毛細(xì)血管，神經(jīng)等）可用于皮膚疾病的藥物開發(fā)[20]。最近在組織再生和皮膚燒傷治療中具有巨大潛力的突破性技術(shù)就是3D打印[21]，通過3D打印對(duì)皮膚燒傷或皮膚腫瘤術(shù)后導(dǎo)致的大面積皮膚缺損的微循環(huán)進(jìn)行概括，這可能需要研究細(xì)胞增殖，轉(zhuǎn)移和化療藥物測試，相比于2D細(xì)胞能更有效地模仿體內(nèi)反應(yīng)。Eves等[22]體外培育角質(zhì)形成細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及黑素瘤細(xì)胞，經(jīng)過3D生物打印生成黑色素瘤皮膚模型，體外研究細(xì)胞外基質(zhì)及鄰近皮膚細(xì)胞對(duì)皮膚黑素瘤細(xì)胞侵襲的影響。Harvey等[23]利用3D生物打印機(jī)打印出正常皮膚模型后，首先將其置于氣液界面，7d后加入白細(xì)胞介素22（IL-22）共培養(yǎng)14d，即誘導(dǎo)出銀屑病疾病模型，期間通過阿爾瑪藍(lán)染色觀察細(xì)胞分化及代謝情況。

4 局限性與展望

3D生物打印皮膚仍存在較多缺陷，其韌性及機(jī)械性能同正常在體皮膚仍有較大差距，其不具有毛囊、血管、汗腺等皮膚附屬器官，同時(shí)缺乏黑色素細(xì)胞、朗格罕氏細(xì)胞等成分[1]。 在這種新技術(shù)的臨床潛力被實(shí)現(xiàn)前，血管化、最佳細(xì)胞、支架組合和3D生物打印的成本是亟需克服的困難[24]。

用生物兼容的“墨水”打印角質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和干細(xì)胞都是可能的，但是重新獲得皮膚完整的結(jié)構(gòu)和功能使得傷口修復(fù)控制溫度覺以及感覺還有待實(shí)現(xiàn)。同時(shí)尋找低成本高性能的新型生物打印材料將是醫(yī)學(xué)3D生物打印的發(fā)展方向之一。

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[收稿日期]2018-03-21 [修回日期]2018-05-30

編輯/李陽利