PI3K/AKt/eNOS信號(hào)通路在硫化氫抑制ET-1誘導(dǎo)的心肌肥大中的作用

王雅婧，張學(xué)志，刁力，王其新

硫化氫氣體（H2S）自被發(fā)現(xiàn)具有類似一氧化氮（NO）和一氧化碳的某些生理作用后，在心血管、神經(jīng)、消化等多個(gè)系統(tǒng)受到諸多關(guān)注。研究[1]顯示內(nèi)源性H2S發(fā)揮舒張血管、調(diào)節(jié)血壓的效應(yīng)在NO存在的條件下能夠明顯增強(qiáng)。PI3K上調(diào)AKt的磷酸化以激活內(nèi)皮型-一氧化氮合酶（eNOS），是調(diào)控內(nèi)源性NO合成的最經(jīng)典途徑之一。邊云飛等[2]在應(yīng)用過氧化氫誘導(dǎo)建立心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激模型的過程中發(fā)現(xiàn)，硫氫化鈉預(yù)處理能使Akt的磷酸化水平升高，在一定程度上減輕心肌細(xì)胞損傷及凋亡，發(fā)揮保護(hù)作用。也有研究[3]顯示在缺血預(yù)適應(yīng)時(shí)，H2S可通過上調(diào)AKt/eNOS信號(hào)通路來改善心肌損傷，ET-1作為肥大刺激因子是研究較多的因子之一，已經(jīng)證實(shí)[4]其最佳有效濃度約為10-9～10-7mol/L。本實(shí)驗(yàn)旨在通過ET-1建立心肌肥大模型，探索H2S能否通過上述信號(hào)通路抑制ET-1的誘導(dǎo)效應(yīng)，并尋找可能有效的抑制方法。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與主要試劑 清潔級(jí)Wistar乳鼠，1～3日齡，由青島派特福德白鼠養(yǎng)殖專業(yè)合作社提供；內(nèi)皮素-1、5′-溴-2-脫氧尿嘧啶核苷（5'-BrdU）由Sigma公司提供；胰蛋白酶、高糖DMEM、青霉素+鏈霉素、胎牛血清等均購自Hyclone公司；膠原酶Ⅱ型、RIPA細(xì)胞裂解液由北京索來寶公司提供；兔抗AKt抗體和兔抗磷酸化AKt抗體購自美國CST公司；總RNA提取試劑盒購自O(shè)miga公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒由碧云天生物技術(shù)研究所提供；NO濃度測(cè)試盒由南京建成生物工程研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 肥大心肌細(xì)胞模型的建立及細(xì)胞分組 胰蛋白酶和膠原酶Ⅱ消化法獲取心肌細(xì)胞并接種到培養(yǎng)板，滴入5'-BrdU使其終濃度為0.1 mmol/L，培養(yǎng)72 h后將細(xì)胞分為對(duì)照組、肥大組和實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行處理，為了解H2S的有效藥物濃度，因此采用不同濃度梯度的NaHS對(duì)實(shí)驗(yàn)組進(jìn)一步進(jìn)行處理，具體如下：①對(duì)照組：加入等體積無血清的DMEM培養(yǎng)基；②肥大組：加入終濃度為10-8mol/L 的ET-1；③10-15M NaHS組：加入10-15mol/lNaHS+10-8mol/L ET-1；④10-14M NaHS組：加入10-14mol/L NaHS+10-8mol/L ET-1；⑤10-13M NaHS組：加入10-13mol/L NaHS+10-8mol/L ET-1；⑥10-12M NaHS組：加入10-12mol/L NaHS+10-8mol/L ET-1。

1.2.2 心肌細(xì)胞表面積的測(cè)定 參照文獻(xiàn)方法[5]，ET-1和或NaHS持續(xù)刺激24 h后用ImageJ圖像處理軟件測(cè)定心肌細(xì)胞的表面積，每個(gè)孔測(cè)5個(gè)視野，每個(gè)視野測(cè)10～15個(gè)細(xì)胞，取其平均值，作為細(xì)胞形態(tài)學(xué)的指標(biāo)。

1.2.3 培養(yǎng)液NO含量和各組細(xì)胞總蛋白含量的測(cè)定 各組實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，獲取待測(cè)培養(yǎng)液，按照NO含量測(cè)定試劑盒說明書操作，酶標(biāo)儀550 nm比色，測(cè)定各組OD值，NO含量（umol/L）= （測(cè)定OD值-空白OD值）/（標(biāo)準(zhǔn)OD值-空白OD值）×標(biāo)準(zhǔn)品濃度×稀釋倍數(shù)；用RIPA細(xì)胞裂解液獲得細(xì)胞蛋白液，根據(jù)BCA法測(cè)定試劑盒說明書操作，酶標(biāo)儀562 nm比色，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定細(xì)胞總蛋白質(zhì)濃度。

1.2.4 Western Blot法檢測(cè)AKt蛋白的表達(dá) 分別提取各組細(xì)胞蛋白30 μg，聚丙烯酰胺變性凝膠分離，濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1.5 h，加一抗（AKt或磷酸化AKt 1:1000稀釋，GAPDH 1:3000稀釋）4℃過夜孵育，洗膜，加辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（1:6000稀釋）室溫下孵育1 h。洗膜，ECL顯色，凝膠成像儀及Quanlity One軟件顯影。以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算各組AKt表達(dá)的相對(duì)量。每組重復(fù)3次。

1.2.5 PCR法檢測(cè)心房鈉利尿肽（ANP）、腦鈉肽（BNP）、eNOS mRNA的表達(dá) 用總RNA提取試劑盒提取各組細(xì)胞總RNA，A260/A280測(cè)定總RNA純度和濃度，取100 ng遵照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA。根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫提供的ANP、BNP、PI3K、AKt、eNOS和β-action mRNA基因序列，由上海生工公司合成6對(duì)引物。ANP引物序列為：Forward：5'-ACCGAAGATAA CAGCCAAATC-3'，Reverse：5'-GGGTATTCACC ACCTCTCAGTG-3'，PCR反應(yīng)產(chǎn)物107bP，退火溫度61.5℃；BNP引物序列為：Forward：5'-GA GACAAGAGAGAGCAGGACAC -3'，Reverse：5'-GAAAAGCAGGAGCAGAATCATC -3'，PCR反應(yīng)產(chǎn)物103bP，退火溫度63℃；PI3K引物序列為：Forward：5'-AAGCCTCTTCCTCCTCCAAT -3'，Reverse：5'-ACGATGGGTCAAATCCACTT -3'，PCR反應(yīng)產(chǎn)物374bP，退火溫度62℃；AKt引物序列為：Forward：5'-GCCCACACGCTTACTGAGA-3'，Reverse：5'-AGCCCGAAGTCCGTTATCTT-3'，PCR反應(yīng)產(chǎn)物308bP，退火溫度62℃；eNOS引物序列為：Forward：5'-AGGTA TTTGATGCTCGGGACTG -3'，Reverse：5'-AAGATTGCCTCGGTTTGTTG -3'，PCR反應(yīng)產(chǎn)物97bP，退火溫度65℃；β-action引物序列為：Forward：5'-CACCCGCGAGATCAACCTTC-3'，Reverse：5'-CCCATACCCACCATCACACC-3'，PCR反應(yīng)產(chǎn)物324bP，退火溫度59℃。以cDNA為模板，分別進(jìn)行ANP、BNP、PI3K、AKt、eNOS和β-action的共同擴(kuò)增。反應(yīng)體系為20 ul，擴(kuò)增條件：94℃，5 min進(jìn)入循環(huán)；94℃，30 s，退火溫度30 s，72℃，30 s，循環(huán)35次；72℃，7 min。使用PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳分離。

2 結(jié)果

2.1 各組心肌細(xì)胞表面積結(jié)果 與對(duì)照組相比，ET-1組心肌細(xì)胞表面積明顯增加（P＜0.05)，10-15mol/L-10-12mol/L NaHS可濃度依賴性的降低細(xì)胞表面積（F=1078.00，P＜0.01），見表1。

2.2 各組心肌細(xì)胞總蛋白含量結(jié)果 與對(duì)照組相比，ET-1組心肌細(xì)胞總蛋白含量明顯增加，NaHS可濃度依賴性的抑制各組心肌細(xì)胞蛋白合成（F=209.09，P＜0.01）見表1。

2.3 各組培養(yǎng)液NO含量結(jié)果 ET-1組較對(duì)照組能夠明顯降低NO含量（P＜0.05），給予NaHS刺激后NO含量隨藥物濃度的升高而逐漸增加（F=87.69，P＜0.05），10-12mol/L NaHS組可基本恢復(fù)至正常水平（P＞0.05），見表1。

2.4 各組ANP、BNP mRNA水平檢測(cè)結(jié)果 ET-1組與對(duì)照組比較結(jié)果有顯著差異（P＜0.05），不同濃度的NaHS能夠不同程度的抑制ANP mRNA合成（FANP=27.88，F(xiàn)BNP=12.58，P＜0.05），10-13mol/L、10-12mol/L NaHS組較10-15mol/L、10-14mol/L NaHS組抑制BNP mRNA合成的效應(yīng)明顯（P＜0.05），兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖1、2。

2.5 各組PI3K、AKt、eNOS mRNA表達(dá)結(jié)果 ET-1顯著降低了PI3K/AKt/eNOS通路三者的mRNA水平（P＜0.05），NaHS能夠濃度依賴性的改善表達(dá)量（FPI3K=48.63，F(xiàn)AKt=85.88，F(xiàn)eNOS=35.60，P＜0.05），但10-15mol/L組和10-14 mol/L組的PI3K、AKt水平，10-13mol/L組和10-12 mol/L組的eNOS水平無明顯差異（P＞0.05），見圖3、4、5。

表1 各組心肌細(xì)胞表面積、總蛋白含量、培養(yǎng)液NO含量測(cè)定結(jié)果（±s）

表1 各組心肌細(xì)胞表面積、總蛋白含量、培養(yǎng)液NO含量測(cè)定結(jié)果（±s）

注：與①對(duì)照組比較，aP＜0.01；與②肥大組比較，bP＜0.01；各組間比較，P＜0.05

測(cè)定指標(biāo) ①對(duì)照組 ②肥大組（ET-1） ③10-15M NaHS組 ④10-14 M NaHS組 ⑤10-13 M NaHS組 ⑥10-12M NaHS組心肌細(xì)胞表面積（n=75），um2/cell 787.27±107.66 1933.80±143.06a 1785.20±73.77ab 1574.00±158.41ab 1194.90±120.60ab 831.87±148.93b心肌細(xì)胞總蛋白含量（n=27），ug/ml 218.55±21.28 367.51±25.90 346.49±22.11 319.33±18.78 289.52±17.55 243.31±19.05培養(yǎng)液NO含量（n=9），umol/L 8.63±0.30 4.60±0.73 5.29±0.65 6.41±0.56 7.29±0.38 8.26±0.31a

圖1 不同濃度NaHS對(duì)ET-1誘導(dǎo)的肥大心肌ANP mRNA表達(dá)量的影響

圖2 不同濃度NaHS對(duì)ET-1誘導(dǎo)的肥大心肌BNP mRNA表達(dá)量的影響

圖3 不同濃度NaHS對(duì)ET-1誘導(dǎo)的肥大心肌PI3K mRNA表達(dá)量的影響

圖4 不同濃度NaHS對(duì)ET-1誘導(dǎo)的肥大心肌AKt mRNA表達(dá)量的影響

2.6 各組磷酸化AKt蛋白表達(dá)量結(jié)果 ET-1組AKt的磷酸化水平低于正常組（P＜0.01)，NaHS能夠有效改善這種抑制效應(yīng)，恢復(fù)AKt的磷酸化水平（F=36.10，P＜0.01)，但仍低于正常水平（P＜0.05），且10-13mol/L、10-12mol/L NaHS的作用差異不顯著（P＞0.05）見圖6。

圖5 不同濃度NaHS對(duì)ET-1誘導(dǎo)的肥大心肌eNOS mRNA表達(dá)量的影響

圖6 不同濃度NaHS對(duì)ET-1誘導(dǎo)的肥大心肌磷酸化AKt表達(dá)量的影響

3 討論

既往研究[6]提示ET-1能夠在納摩爾水平通過多種調(diào)控方式包括L型鈣通道、鈣激活氯通道、蛋白激酶C和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）通路等增加細(xì)胞蛋白質(zhì)合成，誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大，有效建立心肌肥厚模型。早期高血壓機(jī)制研究已經(jīng)證實(shí)ET-1內(nèi)源性的生成與NO存在動(dòng)態(tài)平衡，兩者相互拮抗維持正常心血管的生理作用[7]。在心血管系統(tǒng)中NO主要由內(nèi)皮型NOS（eNOS）催化底物左旋精氨酸合成，心肌細(xì)胞本身可于細(xì)胞膜和橫管之間的小窩處合成eNOS，后者與小窩受體通過caveolin-3形成eNOS-caveolin-3-小窩受體復(fù)合物[8]。包括內(nèi)皮素受體、緩激肽β2受體、β3-腎上腺素能受體等多種受體便可以與eNOS在小窩處共定位，發(fā)揮相應(yīng)的生物作用[9-11]。與野生型小鼠的離體心肌細(xì)胞相比，eNOS基因敲除的小鼠離體心肌細(xì)胞對(duì)心肌肥大誘導(dǎo)藥物的敏感性升高出現(xiàn)過度增殖反應(yīng)[12]。在本實(shí)驗(yàn)中，外源性給予ET-1誘導(dǎo)處理后，eNOS mRNA的表達(dá)量及培養(yǎng)液NO含量較對(duì)照組減少，ET-1/NO平衡被打破，同時(shí)心肌細(xì)胞表面積及蛋白含量、ANP及BNP mRNA水平均明顯增加，證實(shí)了通過破壞該平衡能夠建立較完善的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/p>

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在ET-1誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大下，PI3K、AKt、eNOS mRNA的表達(dá)均被明顯抑制，AKt蛋白下調(diào)，培養(yǎng)液中NO的釋放也減少，這些結(jié)果提示PI3K-AKt-eNOS信號(hào)途徑受損在ET-1誘導(dǎo)心肌肥大過程中有重要意義。在應(yīng)用NaHS處理肥大的心肌細(xì)胞后，磷酸化AKt表達(dá)上調(diào)，PI3K、AKt、 eNOS mRNA的表達(dá)量及培養(yǎng)液NO含量均較肥大組明顯增加，提示該藥物可能通過PI3K-AKt-eNOS信號(hào)途徑改善NO的合成，抑制ET-1的生成水平。在上述指標(biāo)中，NO含量的變化與信號(hào)通路的變化不完全相同，尤其以10-12mol/L NaHS組為著，提示在該信號(hào)通路控制NO生成的過程中可能存在其他因子的正向調(diào)節(jié)，促進(jìn)上游AKt、eNOS的活性表達(dá)。

雖然給予較低濃度的NaHS（10-15-10-14mol/L）后，兩組eNOS與NO水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但在PI3K及AKt水平變化并不顯著。PI3K具有絲氨酸/蘇氨酸（Ser/Thr）激酶活性，在被G蛋白偶聯(lián)受體、蛋白酪氨酸激酶受體和Ras蛋白活化后產(chǎn)生第二信使磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸（Phosphatidylinositol 3,4,5-triphosphate，PIP3），它能與AKt氨基末端的PH結(jié)構(gòu)域結(jié)合，使AKt發(fā)生構(gòu)象改變并暴露Thr308和Ser473磷酸化位點(diǎn)，進(jìn)一步激活下游底物形成較完整獨(dú)立的信號(hào)通路。既往也有研究[13]顯示，ET-1作為屬于G蛋白偶聯(lián)家族受體配體，可激活PI3K/AKt信號(hào)通路，滅活GSK3β，抑制其參與的負(fù)向調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞肥大的過程[14]。兩種截然相反的實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示在ET-1誘導(dǎo)心肌肥大的過程中，雖存在PI3K/AKt/eNOS信號(hào)通路的受損，但少量存留的磷酸化PI3K、AKt仍可以激活其他通路的下游底物促進(jìn)ET-1的肥大效應(yīng)，二者可能同時(shí)具有相反的生物效應(yīng)，H2S是否也能通過調(diào)節(jié)其他信號(hào)通路抑制心肌肥大尚需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

綜上所述，H2S可能通過PI3K/AKt/eNOS信號(hào)通路抑制ET-1誘導(dǎo)的心肌肥大，但在激活PI3K/AKt通路后除eNOS外有無調(diào)控其他下游效應(yīng)分子發(fā)揮作用需要進(jìn)一步探討。

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