植物乳桿菌HN1發(fā)酵對番石榴多酚的影響

李曉樂，楊瑞麗，張玉瑩，豆榮，李武，*

（1.海南大學食品學院，海南?？?70100；2.廣東省食品質(zhì)量安全重點實驗室/華南農(nóng)業(yè)大學食品學院，廣東廣州510642）

多酚是一類廣泛存在于植物中的具有多元酚結構的化合物，按其結構又可分為酚酸類、黃酮類、芪類和木質(zhì)素四類[1]。研究表明，多酚具有抗氧化、抗炎、抗動脈粥樣硬化、抗腫瘤等多種生物活性[2-4]。茶多酚、蘋果多酚、葡萄多酚等一些酚類物質(zhì)已被用于功能性食品的開發(fā)和相關臨床研究。

果蔬是人體膳食攝入多酚類物質(zhì)的主要來源，盡管酚類物質(zhì)在果蔬中分布較為廣泛，但一些酚類化合物的生物利用度非常低[5]。Scalbert等[6]研究發(fā)現(xiàn)，人體攝入10 mg～100 mg單一酚類物質(zhì)，多數(shù)酚類物質(zhì)的血漿濃度都低于1 μmol/L。同時研究顯示，酚類物質(zhì)的生物利用度與其結構、食品加工因素等密切相關[7]。Manach等[8]對18種主要膳食酚類物質(zhì)的研究顯示，不同酚類物質(zhì)的生物利用度差異極其顯著，其中沒食子酸和異黃酮最易被機體吸收，其次為兒茶素、黃烷酮類和槲皮素糖苷。

植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）是乳酸菌的一種，其在蔬菜和水果表皮分布廣泛。研究發(fā)現(xiàn)，多種植物乳桿菌具有轉(zhuǎn)化多酚的能力[9-11]。Ciafardini等[12]發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌B17、B20、B21可以將橄欖苦苷降解為羥基酪醇和欖香醇酸，將咖啡酸降解為乙烯基兒茶酚和乙基兒茶酚。最近的研究顯示，利用植物乳桿菌發(fā)酵果蔬，可以改變其多酚的組成、提高其抗氧化活性，改善其酚類生物利用度[13]。

番石榴是一種富含多酚的水果，除鮮食外，常用于飲料、果醬等加工[14]。研究顯示，番石榴多酚具有抗腫瘤、降低細胞氧化損傷等多種活性[15]。前期的研究顯示，番石榴鮮果中主要含有表兒茶酸、槲皮素、異香草酸、對香豆酸、咖啡酸等酚類物質(zhì)[16-17]。但是，目前對于番石榴多酚在加工過程中的變化的研究報道還較少。

從香蕉莖葉上分離到1株植物乳桿菌HN1（Lactobacillus plantarum HN1），其具有良好的益生作用和改善青儲飼料品質(zhì)及轉(zhuǎn)化多酚的能力[18]。本文采用HN1發(fā)酵番石榴果漿，分析其酚類物質(zhì)和抗氧化活性在發(fā)酵及巴氏殺菌工藝過程中的變化，為番石榴加工產(chǎn)品的開發(fā)利用提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

番石榴（品種珍珠）：海南省?？谑心蠂小?/p>

沒食子酸、蘆丁、水溶性維生素E（6-hydroxy-2，5，7，8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid，Trolox）、2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（2，2'-Azino-bis-（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid）diammonium salt，ABTS）、2，4，6-三吡啶基三嗪：Sigma-Aldrich公司；甲醇、乙腈（色譜級）：Tedia公司；其他試劑（分析純）：廣州化學試劑廠。

1.2 方法

1.2.1 番石榴果漿發(fā)酵

鮮果用自來水清洗干凈，再用蒸餾水沖洗2遍。按10∶1（g/mL）的比例加入蒸餾水打漿，巴氏殺菌（65℃，30 min）后快速冷卻至室溫，在無菌條件下接種3.0%植物乳桿菌HN1，混勻，37℃發(fā)酵8 h，以不接菌種的果漿作為對照。番石榴果漿的起始pH值為4.2±0.04，8 h發(fā)酵結束后pH值為3.78±0.05，活菌數(shù)為1.60×107cfu/mL。

1.2.2 游離酚提取

游離酚提取參照Wolfe等[19]的方法：挑選成熟度一致水果，自來水洗凈后用蒸餾水沖洗一遍。取水果可食用部分，25 g（3個平行）加入100 mL預冷的80%丙酮，均質(zhì)機提取 6 min（3.0 min×2 停頓 30 s），紗布過濾，果渣復提1次，合并濾液，45℃真空濃縮后用蒸餾水定容至25 mL，-80℃冰箱保存待測。

1.2.3 結合酚提取

結合酚的提取采用NaOH消化法，參照曹雙等[19]的方法。將1.2.2中提取殘渣用雙蒸水除去有機試劑，加入4 mol/L NaOH（1 g∶15 mL），室溫磁力攪拌提取2.0 h后用4 mol/L鹽酸調(diào)整pH值至2.0。乙酸乙酯萃取5次，合并萃取液，45℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，用甲醇定容后儲存于-80℃冰箱待測。

1.2.4 多酚含量的測定

參照Wolfe等[20]的方法，取125 μL稀釋至一定濃度的提取物，加入0.5 mL去離子水和125 μL的Folin-Ciocalteu試劑，混勻后反應6 min，再加入1.25 mL 7%Na2CO3溶液和1 mL蒸餾水，混勻，避光反應90 min后于760 nm測定其吸光值，空白使用125 μL溶劑代替提取物。結果以每100克新鮮果肉所含的沒食子酸當量表示（mg GAE/100g FW）。

1.2.5 黃酮含量的測定

總黃酮含量的測定參考Dewanto等[21]的方法并稍作改進。300 μL酚類物質(zhì)提取物加入1.5 mL蒸餾水和90 μL 5%的亞硝酸鈉溶液，反應6 min后加入180 μL 10%的AlCl3·6H2O溶液，5 min后加入0.6 mL 1 mol/L的NaOH溶液，最后用蒸餾水補足至3 mL，于510 nm下測定其吸光值?？傸S酮含量結果以每100克鮮果肉中所含的蘆丁當量（rutin equivalent，RE）表示，單位為mg RE/100 g，試驗3次重復。

1.2.6 ABTS+·清除能力

采用張金宏[22]的方法。配制7.0 mmol/L ABTS儲備液，140 mmol/L K2S2O8溶液。取5 mL 7 mmol/L ABTS溶液與88 μL 140 mmol/L K2S2O8溶液于離心管中，混勻，室溫下避光反應12 h即為ABTS工作液（現(xiàn)配現(xiàn)用），將ABTS工作液在734 nm處的吸光度用無水乙醇調(diào)整到0.700±0.020后備用。取25 μL稀釋至一定濃度的樣品加入2 mL ABTS工作液，混勻后室溫避光反應6 min，于734 nm處測定吸光值。結果以每100克鮮重中Trolox當量（μmol TE/100g FW）表示。

1.2.7 鐵離子還原法（ferric ion reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP）抗氧化能力測定

采用 Thai等[23]的方法，2 800 μL FRAP 工作液（300 mmol/L醋酸緩沖液，10 mmol/L的TPTZ，20 mmol/L的FeCl3溶液按體積比10∶1∶1混合均勻）中加入200 μL相應水果提取液或其稀釋液，37℃避光反應30 min，593 nm測定其吸光值。各提取物的總抗氧化能力以Trolox為標準進行定量，結果以每100克新鮮果肉中所含的Trolox當量（TE）表示（μmol TE/100 g）。

1.2.8 超高效液相色譜-四級桿-飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用（ultra-performance liquid chromatography-quadrupoletime of flight mass spectrometry，UPLC-Q-TOF-MS/MS）條件

Agilent 1290-6540超高效液相色譜-四級桿-飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用儀（UPLC-Q-TOF-MS/MS）。色譜條件為流動相A：乙腈；流動相B：0.15%甲酸水溶液；洗脫梯度：1 min～6 min，10%～20%A；6 min～10 min，20%～25%A；15 min～20 min，60%～95%A；20 min～25 min，95%A；流速：0.5 mL/min；二極管陣列檢測器（diode array deterctor，DAD），DAD 檢測波長：200 nm～400 nm；進樣體積：20 μL；柱溫：30 ℃。

質(zhì)譜條件為毛細管電壓：3.5 kV，片段電壓：130 V；霧化電壓：241.33×103Pa，干燥氣體溫度：325℃，氣體流速：9 L/min，離子源為電噴霧離子化源（electron spray ionization，ESI），負離子模式掃描，質(zhì)量數(shù)掃描范圍 m/z 100～1 700。

1.2.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)結果以平均值±標準差表示，實驗數(shù)據(jù)的顯著性檢驗運用DPS統(tǒng)計軟件的ANOVA（以p＜0.05為差異顯著）進行分析。

2 結果與分析

2.1 巴氏殺菌和發(fā)酵前后總酚和黃酮含量的變化

巴氏殺菌和發(fā)酵對番石榴果漿中游離酚、結合酚和黃酮含量的影響見圖1。

圖1 巴氏殺菌和發(fā)酵對番石榴果漿中游離酚、結合酚和黃酮含量的影響Fig.1 Effect on the content of free phenolic，bound phenolic and flavonoids in guava pulp of pasterization and fermentation

鮮果中的游離酚、結合酚的含量分別為（227.32±2.14）、（15.26 ± 0.77）mg GAE/100 g FW。經(jīng)巴氏殺菌后，游離酚和結合酚顯著地下降了20.97%和47.51%（p＜0.05），分別為（179.66±3.03）、（8.01±2.06）mg GAE/100 g FW。發(fā)酵后，游離酚和結合酚分別下降6.81%和55.31%（p＜0.05），分別為（167.42± 1.51）、（3.58±0.61）mg GAE/100 g FW。結合酚顯著下降的百分比是游離酚的8.12倍，可能是由于植物乳桿菌HN1將番石榴中的結合酚降解為游離酚所引起，而游離酚在整個代謝過程中也會被植物乳桿菌HN1降解為其他物質(zhì)，因此，發(fā)酵后游離酚僅下降了6.81%。

鮮果中的黃酮含量為（274.09±3.04）mgTE/100gFW，巴氏殺菌后，降低為（182.99±2.09）mg TE/100 g FW，較鮮果顯著（p＜0.05）下降了33.24%。發(fā)酵后降低為（144.55±1.17）mg TE/100 g FW，較巴氏殺菌后顯著（p＜0.05）下降了21.01%。

研究顯示，隨著巴氏殺菌的溫度的提高，果汁中的總酚含量呈下降趨勢，在溫度為90℃和100℃時，總酚含量呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢[24]。本文的結果顯示65℃30 min殺菌處理后，番石榴果漿的總酚含量顯著下降，與前期的結果相類似。

2.2 巴氏殺菌和發(fā)酵前后抗氧化活性的變化

巴氏殺菌和發(fā)酵對番石榴果漿抗氧化活性的影響見圖2。

圖2 巴氏殺菌和發(fā)酵對番石榴果漿抗氧化活性的影響Fig.2 Effect on antioxidant activity in guava pulp of pasteurization and fermentation

鮮果的FRAP抗氧化值為（1193.10±12.24）μmolTE/100gFW，經(jīng)巴氏殺菌后，降低為（901.90±55.82）μmolTE/100 g FW，較鮮果顯著（p＜0.05）下降了24.41%。但發(fā)酵后無顯著性變化（883.93±15.51 μmol TE/100g FW）。

鮮果的 ABTS+·抗氧化值為（1 483.08±21.43）μmol TE/100gFW，經(jīng)巴氏殺菌后，降低為（1368.63±30.23）μmol TE/100 g FW，較鮮果顯著（p＜0.05）下降了 7.72%。發(fā)酵后，ABTS+·抗氧化值為（1 432.69±17.93）μmol TE/100 g FW，與鮮果相比無顯著（p＞0.05）差異。發(fā)酵過程中，結合酚含量顯著下降，而兩種抗氧化活性無顯著變化，這說明酚類物質(zhì)的代謝物具有更強的抗氧化活性，而這一結果與Sun等[25]研究相似。

2.3 發(fā)酵過程中酚類物質(zhì)的分析

根據(jù)UPLC-Q-Tof-MS/MS化合物的保留時間、精確質(zhì)量數(shù)、豐度信息，通過Mass Hunter軟件匹配所建的數(shù)據(jù)庫（Metlin離線數(shù)據(jù)庫）和文獻比對，對番石榴果漿在發(fā)酵過程中的酚類物質(zhì)進行分析鑒定，共發(fā)現(xiàn)9種主要酚類物質(zhì)，如表1所示。

表1 番石榴果漿在發(fā)酵過程中的主要酚類物質(zhì)Table 1 The main phenolic substance in the fermentation of guava pulp

化合物1～9為在番石榴鮮果中檢測到的主要酚類物質(zhì)，其中Díaz等[26]曾報道番石榴葉中存在槲皮素-沒食子酰基己糖苷異構體（Quercetin-galloylhexoside Isomer）、金絲桃甙 （Hyperin）、Guavinoside B 和2，6-二羥基-3-甲基-4-O-（6″-O-沒食子?；?β-D-吡喃葡萄糖基）-苯甲酮（2，6-dihydroxy-3-methyl-4-O-（6″-O-galloyl-β-D-glucopyranosyl）-benzophenone）4種多酚物質(zhì)，本文發(fā)現(xiàn)的其他5種化合物在番石榴中首次報道。

巴氏殺菌對多酚的組成有較大的影響，可以使酚類物質(zhì)發(fā)生氧化降解、分解轉(zhuǎn)化或與多糖等大分子形成復雜化合物[26，33]。巴氏殺菌后，化合物 1、2、4、7 未被檢測到，可能由于其被氧化降解或與多糖等形成復雜的化合物。同時一級質(zhì)譜分析的結果顯示（見表2），巴氏殺菌后，產(chǎn)生了沒食子酸（Gallic acid）、2'，4'，6'-三乙?；S豆黃苷（2'，4'，6'-Triacetylglycitin）、二氫異甘草素（Davidigenin）、山奈酚 7-木糖苷（Kaempferol 7-xyloside）、（8R，8'R）-開環(huán)異落葉松脂素 9-葡萄糖苷（（8R，8'R）-Secoisolariciresinol 9-glucoside） 等 5 種多酚類物質(zhì)，其可能由其他酚類物質(zhì)降解產(chǎn)生。

表2 巴氏殺菌后產(chǎn)生的酚類物質(zhì)Table 2 The phenolic substance appear after pasteurization

研究顯示，乳酸菌在發(fā)酵過程中可以通過β-葡萄糖苷酶、對香豆酸脫羧酶和普通脫羧酶作用，將復雜的酚類物質(zhì)代謝為小分子酚酸或其他酚類物質(zhì)[9]。本文的結果顯示，化合物4和7在巴氏殺菌后消失，而在發(fā)酵后又被檢測到。其可能是由其他酚類物質(zhì)經(jīng)HN1生物轉(zhuǎn)化或分解產(chǎn)生。同時一級質(zhì)譜的結果顯示（見表3），發(fā)酵后產(chǎn)生的2-羥基苯乙酮（2-hydroxyacetophenone） 和 3'-葡萄糖基-2'，4'，6'-三羥基苯乙酮（3'-glucosyl-2'，4'，6'-trihydroxyacetophenone） 兩種酚類物質(zhì)，依據(jù)其結構推測為多酚的發(fā)酵代謝產(chǎn)物。同時，在發(fā)酵后的果漿中還檢測到白當歸素（Byakangelicin）、（+）異豆素（Isoduartin）等幾種活性物質(zhì)。其中，白當歸素具有較強的抗氧化活性和保護腎上皮細胞的作用[33]；（+）異豆素具有良好的抗腫瘤活性[33]。

表3 發(fā)酵后產(chǎn)生的酚類物質(zhì)Table 3 The phenolic substances appear after fermentation

3 結論

番石榴果漿在巴氏殺菌前、后以及發(fā)酵后的游離酚含量依次為（227.32±2.14）、（179.66±3.03）、（167.42±1.51）mg GAE/100 g FW；結合酚的含量依次為（15.26±0.77）、（8.01±2.06）、（3.58 ± 0.61）mg GAE/100 g FW；黃酮含量依次為（274.09±3.04）、（182.99±2.09）、（144.55±1.17）mgTE/100gFW；FRAP抗氧化值依次為（1193.10±12.24）、（901.90±55.82）、（883.93±15.51）μmol TE/100 g FW；ABTS+·抗氧化值依次為（1483.08±21.43）、（1368.63±30.23）、（1 432.69±17.93）μmol TE/100 g FW；番石榴鮮果中主要含有槲皮素-沒食子?；禾擒债悩嬻w、金絲桃甙、Z-astringin、Guavinoside B、異大黃甙、短葉松素、槐異二氫黃酮D、Dorsilurin B和2，6-二羥基-3-甲基-O-（6'-O-沒食子?；?β-D吡喃葡萄糖基）-苯甲酮9種酚類物質(zhì)；巴氏殺菌后新產(chǎn)生沒食子酸、2'，4'，6'-三乙?；S豆黃苷、二羥苯基羥基丙酮、山奈酚7-木糖苷、（8R，8'R）-開環(huán)異落葉松脂素9-葡萄糖甙酚類物質(zhì)；發(fā)酵后新產(chǎn)生2-羥苯乙酮和3’-葡萄糖基-2'，4'，6'-三羥基苯乙酮兩種酚類物質(zhì)；同時番石榴經(jīng)HN1發(fā)酵后產(chǎn)生白當歸素和（+）異豆素等生物活性物質(zhì)。