牡蠣皰疹病毒流行病學(xué)及其防控研究進(jìn)展

胡宗福，任紹杰，?；溃诮ㄈA，常 杰，李樹國(guó)

( 內(nèi)蒙古民族大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，內(nèi)蒙古 通遼 028000 )

作為迄今為止僅有的一種軟體動(dòng)物皰疹病毒，牡蠣皰疹病毒(Ostreidherpesirus-1，OsHV-1)的分類地位及命名是由國(guó)際病毒分類委員會(huì)于2012年正式確立的，即皰疹病毒目、軟體動(dòng)物皰疹病毒科、皰疹病毒屬(Ostreavirus)[1]。由此看來(lái)，牡蠣及其他貝類的皰疹病毒皆屬牡蠣皰疹病毒種類。自20世紀(jì)90年代以來(lái)，由該病毒引起的牡蠣及其他貝類疾病在以歐洲為主要發(fā)病區(qū)的世界范圍內(nèi)頻繁爆發(fā)，感染幼蟲及貝苗死亡率常常達(dá)90%以上，對(duì)產(chǎn)業(yè)的危害非常嚴(yán)重。歐盟也多次出資設(shè)立研究基金及組織團(tuán)隊(duì)進(jìn)行科學(xué)研究和疾病的防控指導(dǎo)，并在2010年立法試圖通過(guò)限制長(zhǎng)牡蠣(Crassostreagigas)的流通及介入監(jiān)控程序來(lái)控制病毒的傳播[2]。

牡蠣皰疹病毒結(jié)構(gòu)上屬于正二十面體有囊膜的病毒，其組成從外到內(nèi)依次是囊膜、核衣殼及雙鏈DNA形成的病毒核心。病毒基因組大小207.439 kb，基因組結(jié)構(gòu)上包括一個(gè)兩端帶有反向重復(fù)序列(TRL/IRL, 7.584 kb)的長(zhǎng)獨(dú)特序列區(qū)(UL,167.843 kb)和一個(gè)同樣兩端帶有反向重復(fù)序列(TRS/IRS, 9.774 kb)的短獨(dú)特序列區(qū)(US,3.370 kb)，其間是一個(gè)更短的獨(dú)特序列區(qū)X(1.510 kb)，從而形成一個(gè)TRL-UL-IRL-X-IRS-US-TRS的基因組組成模式[3]，這個(gè)模式代表了大多數(shù)已知的不同病毒株，但牡蠣皰疹病毒魁蚶株(OsHV-1-SB)缺少短獨(dú)特序列區(qū)，其模式為TRL-UL-IRL-IRS-US-TRS[4]。囊膜蛋白也是組成病毒囊膜的成分，其中糖蛋白Gp與病毒對(duì)宿主細(xì)胞膜的識(shí)別和吸附有關(guān)，在選擇壓力下可能會(huì)發(fā)生高頻的變異[5]。目前病毒有多個(gè)變異株流行于世界各地，如歐洲的牡蠣皰疹病毒-1μvar株[6]，我國(guó)扇貝的急性病毒性壞死病毒(Acuteviralnecrobioticvirus, AVNV)[7]及牡蠣皰疹病毒魁蚶株[4]。

1 流行情況

1.1 感染宿主

牡蠣皰疹病毒的感染宿主主要為牡蠣，貝苗、幼貝及成貝均可引起感染并死亡，但成貝敏感性及死亡率較低[3,6]。已知多種牡蠣均可感染牡蠣皰疹病毒：歐洲平牡蠣(Ostreaedulis)[8]、長(zhǎng)牡蠣[9]、澳大利亞扁牡蠣(O.angasi)[10]、智利牡蠣(Tiostreachilensis)[11]、葡萄牙牡蠣(C.angulata)[12]、美洲牡蠣(C.virginica)[13]、香港巨牡蠣(C.hongkongensis)[14]等。與牡蠣皰疹病毒不同，急性病毒性壞死病毒在我國(guó)主要危害1齡及2齡扇貝[15]。

除牡蠣外，牡蠣皰疹病毒及其變種還可感染其他雙殼類或腹足類：雙殼類簾蛤科的菲律賓蛤仔(Ruditapesphilippinarum)、溝紋蛤仔(R.decussates)[16]等，扇貝科的歐洲大扇貝(Pectenmaximus)[17]、櫛孔扇貝(Chlamysfarrier)及蝦夷扇貝(Patinopectenyessoensis)[14]等，蚶科的魁蚶(Scapharcabroughtonii)[4]，貽貝科的紫貽貝(Mytilusgalloprovincialis)[18]；腹足類主要感染鮑科的動(dòng)物，如雜色鮑(Haliotisdiversicolor)[19]、日本盤鮑(H.discusdiscus)[20]、皺紋盤鮑(H.discushannai)[21]等。

1.2 地區(qū)分布

牡蠣皰疹病毒最初由Farley發(fā)現(xiàn)于美國(guó)，20世紀(jì)90年代開始在歐洲頻繁爆發(fā)，之后在全球各地廣泛流行。牡蠣皰疹病毒及其相關(guān)變異毒株在歐洲的分布特別廣泛，從北部的愛爾蘭[22]、英國(guó)[16]及荷蘭[23]到南部的意大利[18]、西班牙、葡萄牙[12]等廣大海岸線上都有流行，特別是在法國(guó)危害尤其嚴(yán)重[17,24]；澳洲主要流行于新西蘭[25]、澳大利亞[26]；美洲主要發(fā)生在美國(guó)[27]、墨西哥[28]；亞洲主要為中國(guó)[4,7,14]、韓國(guó)[29]和日本[30]。

與其他毒株較為廣泛的分布屬性不同的是，急性病毒性壞死病毒和牡蠣皰疹病毒魁蚶株兩個(gè)毒株僅分布于我國(guó)北方沿海，分別危害櫛孔扇貝和魁蚶兩個(gè)養(yǎng)殖種類[4,7]。這種在宿主、地理分布等方面的獨(dú)特性，也使得國(guó)內(nèi)學(xué)者認(rèn)為急性病毒性壞死病毒是一個(gè)新種[31]。其他牡蠣皰疹病毒毒株在我國(guó)也存在，但未達(dá)到危害的程度，Bai等[14]在山東、遼寧、廣西、廣東、福建等地的養(yǎng)殖貝類中均檢測(cè)到陽(yáng)性樣本，涉及到的種類有櫛孔扇貝、魁蚶、蝦夷扇貝、文蛤(Meretrixmeretrix)、菲律賓蛤仔、香港巨牡蠣、長(zhǎng)牡蠣等，檢測(cè)到牡蠣皰疹病毒參考株、牡蠣皰疹病毒-1μvar變異株及急性病毒性壞死病毒等諸多病毒毒株。

1.3 流行毒株

該病毒最初在美國(guó)發(fā)現(xiàn)，但當(dāng)時(shí)只僅限電子顯微鏡進(jìn)行的形態(tài)識(shí)別，尚無(wú)變異毒株的識(shí)別[13]。分子生物學(xué)的發(fā)展促進(jìn)了牡蠣皰疹病毒變異株的識(shí)別與劃分，在牡蠣皰疹病毒參考株全基因組序列測(cè)定的基礎(chǔ)上[3]，又發(fā)現(xiàn)了許多變異毒株,如牡蠣皰疹病毒-1var株、牡蠣皰疹病毒-1μvar株、牡蠣皰疹病毒-1μvarΔ9株、牡蠣皰疹病毒-1μvarΔ15株及中國(guó)的牡蠣皰疹病毒魁蚶株和急性病毒性壞死病毒等[6,12,32-33]。這些毒株的出現(xiàn)具有一定的時(shí)序性。例如，病毒在法國(guó)的發(fā)生分為兩個(gè)階段，2008年之前流行的主要毒株是牡蠣皰疹病毒-1參考株，而2008年之后流行的毒株以牡蠣皰疹病毒-1μvar株為主[12]。

從起源上來(lái)看，基于大量數(shù)據(jù)的病毒基因多樣性和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，這些毒株具有明顯的分群現(xiàn)象和源流，歐洲流行的牡蠣皰疹病毒-1參考株最初來(lái)源于亞洲[9]，而牡蠣皰疹病毒-1μvar株則起源于歐洲[34]。國(guó)內(nèi)的急性病毒性壞死病毒及牡蠣皰疹病毒魁蚶株屬牡蠣皰疹病毒-1系統(tǒng)進(jìn)化群，牡蠣皰疹病毒-1var株、牡蠣皰疹病毒-1μvarΔ9株、牡蠣皰疹病毒-1μvarΔ15株等屬牡蠣皰疹病毒-1μvar系統(tǒng)進(jìn)化群。

表1 牡蠣皰疹病毒-1及其變異毒株的主要流行國(guó)家及感染宿主

1.4 發(fā)病季節(jié)

已有的大量數(shù)據(jù)表明，牡蠣皰疹病毒的爆發(fā)具有明顯的季節(jié)性，即主要集中在夏季這個(gè)時(shí)間段。例如，北半球的法國(guó)，病毒引起貝苗大規(guī)模死亡的時(shí)間在5—9月[6]，而南半球的澳大利亞，牡蠣皰疹病毒主要流行于11月至次年3月[26]。牡蠣皰疹病毒流行的季節(jié)周期性與水溫具有明顯的相關(guān)性。報(bào)道顯示，牡蠣皰疹病毒多在較高的水溫條件下爆發(fā)，低于16 ℃則很少發(fā)生重大的貝類死亡事件[35]。例如，在美國(guó)西海岸，22～25 ℃是牡蠣皰疹病毒引起的養(yǎng)殖牡蠣爆發(fā)性死亡的起始水溫[27]，而在法國(guó)，起始水溫最初為19 ℃，但2008年以來(lái)牡蠣皰疹病毒-1μvar毒株的出現(xiàn)，使得這一溫度降至16 ℃[38]。這表明水溫可能通過(guò)影響宿主生理或者直接影響病毒增殖過(guò)程而參與病毒感染機(jī)制的調(diào)控，從而成為影響牡蠣皰疹病毒流行發(fā)展的關(guān)鍵因子。

1.5 傳播途徑

牡蠣皰疹病毒可通過(guò)多種途徑傳播，包括貝類個(gè)體間的水平傳播及垂直傳播、海水傳播、水中顆粒傳播、其他生物傳播等。

感染試驗(yàn)證明，通過(guò)患病貝體，牡蠣皰疹病毒可在貝類種內(nèi)或種間水平傳播[24,39]。實(shí)際上，由于貝類移動(dòng)性極差，限制了其接觸傳播的機(jī)會(huì)，但現(xiàn)代化的高密度養(yǎng)殖模式可能使這一過(guò)程得以實(shí)現(xiàn)[24]。關(guān)于垂直傳播，基于親貝性腺內(nèi)病毒顆粒存在的證據(jù)，很多學(xué)者認(rèn)可其存在的可能性[9,37]。但對(duì)櫛孔扇貝急性病毒性壞死病毒的研究表明，雖然親貝性腺中存在病毒粒子，但其產(chǎn)生的卵及幼蟲卻未受病毒感染，因此認(rèn)為病毒存在卵內(nèi)垂直傳播的可能性較小[40]。很多孵化場(chǎng)的牡蠣幼蟲在孵化后2～3 d就患病死亡，可能是由于水環(huán)境中存在的病毒顆粒經(jīng)其他途徑傳播所致。

此外，其他途徑也是病毒傳播的重要方式。研究發(fā)現(xiàn)，牡蠣皰疹病毒能夠在海水中存活一段時(shí)間并維持感染力，如果附著或寄生于水中有機(jī)顆粒、浮游生物及大型海藻上，則存活及維持感染力的時(shí)間更長(zhǎng)[41-42]，貝類有可能通過(guò)攝食過(guò)程接觸這些病毒而感染。因此，海水、水中顆粒物及其他生物均可成為病毒傳播的重要途徑。

2 臨床癥狀及病理特征

2.1 臨床癥狀

自然發(fā)病的牡蠣幼蟲表現(xiàn)為食欲和游泳活力的衰退，通常孵化后幾日內(nèi)即可感染牡蠣皰疹病毒，癥狀出現(xiàn)后5～6 d開始出現(xiàn)嚴(yán)重死亡，通常8～10 d全部死亡。瀕死的幼蟲表現(xiàn)為活力減弱，旋轉(zhuǎn)式游泳，面盤緣膜受損并脫落，此時(shí)幼蟲為80～150 μm[36]；變態(tài)后的貝類，感染病毒后表現(xiàn)為食欲減退，進(jìn)食減少，神經(jīng)損害導(dǎo)致反應(yīng)遲鈍，閉殼肌收縮緩慢而無(wú)力，黏液分泌增加[26]。1～5月齡的苗種通常是急性死亡，5 d內(nèi)死亡率可達(dá)50%～70%，發(fā)病1個(gè)月后最終死亡率超過(guò)90%，稍大規(guī)格的貝類，如9～18月齡的幼貝累計(jì)死亡率亦達(dá)40%～90%?？傊?，患病貝類的死亡率隨年齡的增大而降低，還隨毒株、環(huán)境的不同而變化[6,26]。

人工感染試驗(yàn)表明，牡蠣皰疹病毒的致病性隨毒株和貝類種類而不同。注射牡蠣皰疹病毒-1參考株后的1齡長(zhǎng)牡蠣(殼長(zhǎng)40 mm)在2 d后死亡率即達(dá)55%，到10 d接近90%。而注射牡蠣皰疹病毒-1μvar后的歐洲平牡蠣，第4 d才出現(xiàn)死亡，10 d后死亡率為25%[43]。牡蠣皰疹病毒-1μvar完全不能在合浦珠母貝(Pinctadamargaritifera)體內(nèi)增殖，也不能造成死亡[44]。這種敏感性隨貝類種類不同而有差別的現(xiàn)象及原因值得深入探討和研究。

2.2 病理特征

牡蠣皰疹病毒感染引起的組織學(xué)損傷在不同貝類之間差別不大，主要發(fā)生在外套膜、唇瓣及消化腺的結(jié)締組織，表現(xiàn)為結(jié)締組織溶解、消化管腫脹及血細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象等[6,37,42]。細(xì)胞病變方面，成纖維細(xì)胞主要表現(xiàn)為胞漿嗜堿性，細(xì)胞核體積增大且染色質(zhì)邊緣化、凝縮及碎片，球形細(xì)胞如血細(xì)胞等，表現(xiàn)為細(xì)胞收縮，核染色質(zhì)濃縮，胞漿濃度增大[27,36]。感染急性病毒性壞死病毒的扇貝與牡蠣皰疹病毒-1參考株感染的牡蠣病理特征相似，可見外套膜及鰓等器官的上皮組織細(xì)胞腫脹、核固縮、細(xì)胞脫落等現(xiàn)象[45]。

2.3 致病機(jī)制

臨床試驗(yàn)通常通過(guò)貝類閉殼肌注射而感染病毒，但病毒的早期復(fù)制器官卻是心臟[39,46]。而血液循環(huán)則將病毒快速傳播至其他組織器官。

病毒感染后可在多個(gè)組織器官?gòu)?fù)制與分布。感染牡蠣皰疹病毒的天然海區(qū)牡蠣中，病毒檢出率在消化腺、唇瓣、鰓、外套膜、心臟、閉殼肌等器官依次升高，檢出率為12.5%～75%[9]。而急性病毒性壞死病毒在櫛孔扇貝中主要分布在外套膜、肝胰腺、腎、腸、鰓及閉殼肌等[45,47]。

病毒在宿主體內(nèi)的復(fù)制模式因不同毒株和宿主有所不同。用牡蠣皰疹病毒攻毒的7月齡長(zhǎng)牡蠣，2 h后就檢測(cè)到多個(gè)基因表達(dá)，18 h后39個(gè)目標(biāo)基因全部檢出[48]，值得指出的是，所測(cè)基因中只有凋亡抑制家族基因在2 h后全部檢出，說(shuō)明病毒復(fù)制時(shí)首先對(duì)宿主細(xì)胞做出調(diào)控。而與之不同的是，牡蠣皰疹病毒-1μvar攻毒的9月齡歐洲平牡蠣，48 h后仍未檢測(cè)到病毒DNA，直到10 d后才檢測(cè)到了病毒DNA[37]。成年魁蚶在牡蠣皰疹病毒攻毒后60 h斧足內(nèi)病毒復(fù)制達(dá)到峰值，72 h后血淋巴細(xì)胞內(nèi)病毒復(fù)制達(dá)到峰值[49]。由此說(shuō)明，不同病毒毒株、宿主種類及年齡、感染條件等均可影響病毒復(fù)制過(guò)程和結(jié)果，這也從深層次上反應(yīng)了病毒與宿主互作的復(fù)雜性。

Corporeau等[50]應(yīng)用雙向電泳蛋白質(zhì)組學(xué)的方法，以牡蠣皰疹病毒-1μvar攻毒后2 d的長(zhǎng)牡蠣為研究對(duì)象，進(jìn)行了病毒致病機(jī)理的研究，發(fā)現(xiàn)了25個(gè)蛋白斑點(diǎn)顯著變化，包括細(xì)胞骨架的解體、蛋白轉(zhuǎn)化、應(yīng)急信號(hào)的誘導(dǎo)及能量代謝等多個(gè)代謝途徑，攻毒的牡蠣細(xì)胞表現(xiàn)出了類似癌細(xì)胞中的瓦氏效應(yīng)，如糖酵解及電壓依賴性陰離子通道的增加等。這說(shuō)明病毒引起了宿主細(xì)胞代謝途徑多方面的變化，尤其是能量代謝方式的轉(zhuǎn)變。這一研究為理解病毒致病機(jī)制提供了新的視野。

3 牡蠣皰疹病毒的預(yù)防與控制

3.1 海水處理

3.1.1 海水陳化與過(guò)濾

牡蠣皰疹病毒不僅在海水中游離存在，更多的是附著于各種顆粒物上，包括浮游生物、飼料、糞便、組織碎片等。因而過(guò)濾可以較好的去除海水中的病毒，減少病毒傳播[51-52]。5 μm濾孔過(guò)濾后的海水不需紫外線照射，即可防止貝類感染，55 μm濾徑過(guò)濾的海水雖不能完全防止貝類受感染而死亡，但也能一定程度上延遲貝類死亡[52]。游離于海水中的病毒，經(jīng)過(guò)2～3 d后基本失去感染能力[41]。海水使用前陳化48 h 能夠有效防止貝類因感染病毒而死亡[41,52]，原因在于，一是陳化使水中顆粒物沉降，二是陳化使病毒失活。

3.1.2 海水消毒

使用合理的消毒程序?qū)Ｋ柏愺w消毒，可有效預(yù)防牡蠣皰疹病毒傳播。根據(jù)Hick等[41]的試驗(yàn)結(jié)果，有效的消毒方式包括化學(xué)制品消毒法和物理消毒法?；瘜W(xué)消毒劑包括氫氧化鈉(20 g/L，10 min)、碘(1 g/L，5 min)、福爾馬林 (40 g/L，30 min)等；次氯酸鈉(0.05 g/L有效氯，15 min)在相對(duì)干凈的海水中有效，但對(duì)富含有機(jī)質(zhì)的海水效果較差；商業(yè)消毒產(chǎn)品Virkon也是有效的消毒劑。物理消毒法主要為海水加熱(如50 ℃，5 min)和紫外線照射(1000 mW/cm2，10 min)。

3.2 養(yǎng)殖過(guò)程中的疾病控制

根據(jù)已有研究資料，對(duì)于牡蠣皰疹病毒的防控，養(yǎng)殖過(guò)程中存在很多可以改善的環(huán)節(jié)，包括養(yǎng)殖方式、密度、水溫及操作等多個(gè)方面。

3.2.1 延長(zhǎng)潮間帶養(yǎng)殖貝類的露空時(shí)間

延長(zhǎng)潮間帶養(yǎng)殖貝類的露空時(shí)間可減少染毒貝類的死亡。試驗(yàn)表明，將成貝的養(yǎng)殖托盤高度提高30 cm，可使成貝的成活率提高2.1～2.5倍[26]。但這種方式并不能提高稚貝或幼貝的成活率，這是因?yàn)?，一是幼小的貝類能量?jī)?chǔ)備較少，大部分用于生長(zhǎng)消耗，而不能滿足其免疫系統(tǒng)需求[53]，二是幼小的貝類適應(yīng)力差，延長(zhǎng)露空時(shí)間降低了其濾食時(shí)間，食物攝入的減少及暴露的環(huán)境影響了其對(duì)病毒的抵抗力。

3.2.2 降低養(yǎng)殖密度

高密度養(yǎng)殖模式使貝類生活空間局促，體質(zhì)下降，病毒傳播距離縮短，從而加劇了病毒的爆發(fā)與流行。甚至有學(xué)者認(rèn)為，牡蠣皰疹病毒源自養(yǎng)殖貝類[54]。為了避免病毒的爆發(fā)，有必要降低養(yǎng)殖密度。

3.2.3 水溫

如上所述，較高的水溫是牡蠣皰疹病毒爆發(fā)的重要條件，水溫動(dòng)力學(xué)與病毒感染模式具有極大的相關(guān)性。研究表明，水溫降至16 ℃以下雖然不能阻止病毒的復(fù)制與傳播，但可控制感染貝類的死亡狀況[35,38,54]。因此，實(shí)際養(yǎng)殖中，室內(nèi)水池等可控水體可直接將水溫降低2～3 ℃，而海區(qū)大水面可通過(guò)調(diào)節(jié)水層來(lái)降低水溫，進(jìn)而控制貝類死亡。

3.2.4 其他因素

食物質(zhì)量與豐度也影響病毒的危害性，以硅藻為主要食物來(lái)源的貝類，能量?jī)?chǔ)備較為充足，一定程度上能夠降低病毒帶來(lái)的危害[52,54]。應(yīng)激(如人工操作、運(yùn)輸、擁擠、餌料的變化、殺蟲劑及繁殖等)也會(huì)導(dǎo)致貝類免疫力下降，容易感染病毒。因此，在實(shí)際養(yǎng)殖中應(yīng)注意加強(qiáng)管理，降低應(yīng)激的發(fā)生。

4 展 望

牡蠣皰疹病毒在世界各地廣流泛行，給牡蠣及貝類產(chǎn)業(yè)造成了巨大損失，對(duì)其深入研究迫在眉睫。目前已經(jīng)在基因組學(xué)、流行病學(xué)等方面對(duì)該病毒進(jìn)行了一定的研究，新的檢測(cè)技術(shù)也不斷涌現(xiàn)并得到應(yīng)用。但目前對(duì)其爆發(fā)的機(jī)制缺乏足夠的了解，以致難以預(yù)測(cè)其爆發(fā)趨勢(shì)。另一方面，對(duì)該病毒致病的分子機(jī)制尚缺乏了解，因此需要結(jié)合基因組學(xué)、蛋白質(zhì)學(xué)及代謝組學(xué)的原理及技術(shù)對(duì)病毒吸附、入侵、繁殖、擴(kuò)散等各個(gè)環(huán)節(jié)進(jìn)行深入研究，為病毒的防治提供理論支持。另外，對(duì)牡蠣皰疹病毒的防控還缺乏有效措施，這是因?yàn)樨愵愺w型小、生活環(huán)境開放性大，缺乏后天免疫，有效藥物及疫苗的開發(fā)和使用難度較大。因此，應(yīng)該在三個(gè)方面加強(qiáng)對(duì)疾病的防控：一是加強(qiáng)病毒生態(tài)學(xué)及致病機(jī)制的研究，以便在養(yǎng)殖模式及管理方法上形成有效控病手段，要特別重視環(huán)境因子和養(yǎng)殖管理在控制及延遲病毒引起的大規(guī)模死亡方面的重要作用；二是加強(qiáng)病毒區(qū)域性分子流行病學(xué)的調(diào)查研究，探明地方主要流行毒株及其危害，有針對(duì)性的進(jìn)行致病性機(jī)制及其防控的研究；三是基于貝類對(duì)病毒敏感性差異較大的特點(diǎn)，加強(qiáng)育種研究，開發(fā)抗病力強(qiáng)的新品種，對(duì)防病具有重要的意義。