宏基因組學及其在魚類腸道微生物中的研究進展

陳泓宇，閆海亞，趙胤丞，肖 蘅，陳善元

( 云南大學 生命科學學院，云南 昆明 650091 )

傳統(tǒng)的微生物研究方法主要利用微生物培養(yǎng)技術，但自然界中只有不到1%的微生物可以通過傳統(tǒng)培養(yǎng)方法獲得[1]，極大的限制了微生物相關研究。宏基因組學最早由Handelsman等提出，自環(huán)境樣品中提取出含有的總微生物DNA構建微生物宏基因組文庫[2]。宏基因組學方法共包括全宏基因組技術及16S rRNA片段擴增技術，通過高通量測序，打破了傳統(tǒng)以培養(yǎng)為主的微生物研究方式，又比變性梯度凝膠電泳和末端片段長度多態(tài)性等早期用于微生物研究的分子生物學技術效率更高，花費更少。利用宏基因組學方法可以準確獲得樣品微生物物種組成及豐度等信息[3]，進入數(shù)據(jù)庫預測微生物功能，還能分析微生物代謝網(wǎng)絡等多方面的信息[4]，為微生物的研究提供了便利的工具。

魚類腸道微生物被認為對宿主生命活動有重要影響，在宿主免疫、宿主適應性及宿主營養(yǎng)代謝等方面均有一定作用。魚類作為食品中重要的蛋白質來源，也是主要的飼養(yǎng)觀賞動物。利用宏基因組學手段研究魚類腸道微生物組成并分析魚類免疫、食性等，對了解魚類腸道微生物生理生化功能，水產(chǎn)經(jīng)濟魚類的養(yǎng)殖繁育、病害防治及觀賞魚類的培育有重要意義?；谝淹瓿珊昊蚪M測序的部分魚類腸道微生物及其相關食性研究信息，筆者從魚類腸道微生物組成、魚類腸道微生物與免疫、魚類腸道微生物與食性等3個方面進行綜述，并對之后的魚類腸道宏基因組測序工作作出展望，以期了解魚類腸道微生物的結構組成模式，分析魚類腸道微生物與宿主免疫及食性間的關系，為今后魚類腸道微生物相關研究提供參考。

1 宏基因組學

1.1 樣品總DNA提取

宏基因組學以微生物生態(tài)群落中所有微生物基因組為研究對象，以基因組學技術為依托[5]，其主要研究程序包括：(1)自樣品中提取DNA；(2)DNA克隆到合適載體；(3)載體轉化并構建基因組文庫；(4)對基因組文庫進行分析和篩選。

獲取高純度、高質量的宏基因組DNA是后續(xù)宏基因組學生物信息分析的基礎，宏基因組DNA提取方法根據(jù)樣品的差異進行不同選擇，提取手法主要分為直接提取法(原位裂解法)及間接提取法(異位裂解法)，提取試劑常為細菌基因組提取試劑盒及氯仿抽提。原位裂解法主要通過去污劑(SDS等)、機械破碎(玻璃珠攪拌等)、酶處理(蛋白酶K等)釋放DNA，加以重提純化。劉艷超等[6]提取自來水中細菌宏基因組DNA時，直接將醋酸纖維濾膜上收集的自來水菌體加入裂解液進行裂解并提取DNA。在泥土及活性污泥微生物研究的DNA提取過程中，Xia等[7]在細胞裂解前直接利用緩沖液對環(huán)境樣品進行洗滌處理再將微生物細胞與雜質分離，有助于去除腐殖酸、重金屬離子等溶解抑制劑。Li等[8]發(fā)現(xiàn)先利用液氮冰凍研磨土壤等環(huán)境宏基因樣品，再提取樣品宏基因組DNA的效果最好。單獨使用試劑盒提取雖操作簡便，但提取效果最差，產(chǎn)物雜質多且干擾測序，在提取前用TENC緩沖液預處理，可以有效去除腐殖酸和濾雜質，有利于DNA提取[9]。除環(huán)境微生物樣品外，腸道微生物DNA提取也通常使用間接提取法。Barry等[10]提取貓腸道微生物DNA時，使用滅菌玻璃珠攪拌分解糞便雜質后利用試劑盒提取。異位裂解提取法需先將微生物細胞提取出來后用溫和的處理方法(脈沖凝膠電泳DNA回收法等)提取DNA，但由于操作繁瑣，效率較低，使用相對較少[11]。

1.2 載體構建及克隆

宏基因組文庫的構建形式沿用了分子克隆的基本原理及技術方法，在DNA提取之后與載體連接并轉入宿主中。載體的選擇主要針對感興趣的功能基因或目標產(chǎn)物基因的特點分為大片段連接載體、表達載體、穿梭載體等幾大類。

微生物產(chǎn)生的活性物質代謝途徑常由多個基因簇聯(lián)合調控，長片段的插入有助于獲得完整的代謝途徑調控基因簇[12]。目前常用的大片段插入載體有人工染色體和黏粒。細菌人工染色體插入片段長(350 kb)，但克隆效率低；黏粒如pWE15可插入片度中等(40 kb)但克隆效率高。Entcheva等[13-14]利用細菌人工染色體載體和黏粒載體構建了插入片段大于50 kb和平均30 kb的宏基因組文庫，成功合成抗菌素紫色桿菌素等。重組克隆子后，利用表達載體構建宏基因組文庫既有利于提高宏基因表達，又方便活性檢測。Henne等[15]就通過直接利用表達載體pBluescript SK+克隆獲得了表達脂酶、酯酶及4-羥基丁酸脫氫酶的重組克隆子。相對于長片段載體，表達載體插入片段僅約10 kb，只適合于單一基因及小操縱子產(chǎn)物。穿梭載體能有效的擴大宿主范圍，有助于提高外源基因的表達。外源基因的表達受宿主細胞的遺傳類型(順式元件、反式因子、tRNA豐度、密碼子偏好等)、細胞基質、細胞的生理狀態(tài)及初級代謝產(chǎn)物等的影響，Brady等[16]采用黏粒 pOS700Ⅰ穿梭載體，將其用大腸桿菌(Escherichiacoli)構建的宏基因組文庫中感興趣的克隆子外源片段轉移到了鏈霉菌(Streptomyces)中，有效提高了轉載基因的表達量。宿主的選擇主要需考慮重組載體的穩(wěn)定性及轉化效率，大腸桿菌作為目前遺傳背景研究最為透徹，應用最廣泛的菌種。是宏基因組來源基因最常用的表達宿主，但大腸桿菌并不是一個高效表達外源基因的宿主細菌，對篩選新基因造成障礙。穿梭宏基因組文庫，如利用穿梭載體將大腸桿菌等文庫轉入鏈霉菌或假單胞菌屬(Pseudomonas)中，將會大大提高篩選效率[17]。

1.3 宏基因組文庫篩選

宏基因組文庫的篩選方式多樣，主要有功能驅動篩選、化合物機構水平篩選、序列驅動篩選及底物誘導基因表達篩選等，每種篩選方法各有優(yōu)缺點，可結合使用。

功能驅動篩選法是生物活性水平層面的篩選，通過檢測并挑選活性的重組克隆子進行篩選，如通過可見性狀篩選到了七葉苷水解酶，甘油脫水酶等[18]，是新發(fā)現(xiàn)分子化合物的常用方法。功能性篩選依賴于功能基因或編碼功能蛋白質的表達，常有外源宿主中基因不表達或表達產(chǎn)物活性低，造成了上千個克隆中僅有1%具有活性[15]。并且檢測的手段很局限，工作量大且效率很低。

化合物結構水平篩選一定程度上避免了功能驅動篩選依賴生物活性的弊端，通過不同物質在色譜中的峰值差異，比較轉入和未轉入外源基因的宿主細胞或提取物色譜圖，篩選出新結構化合物的克隆子。該篩選方式不一定要具有生物活性，可直接篩選出新結構化合物。Wang等[19]以鏈霉菌為宿主構建宏基因組文庫，利用化合物結構水平篩選法從1020個克隆子中篩選出2個產(chǎn)生新化合物的克隆子并獲得了全新小分子物質。

序列驅動篩選是DNA序列水平層面的篩選，根據(jù)同類酶基因可能具有的序列相似性為基礎，利用相關功能基因的保守序列或相似序列設計雜交探針或PCR引物擴增及挑選陽性克隆[20]。Knietsch等[21]根據(jù)已知脫水酶基因保守序列設計PCR引物用于宏基因組DNA擴增，最后篩選出活性較強的產(chǎn)1,3-丙二醇脫水酶克隆子。序列驅動篩選不必依賴宿主表達克隆基因，篩選效率高。但在設計引物及探針時需了解目的基因片段相關信息，不適用于新物質挖掘。

底物誘導表達篩選基于相關基因表達需某些化合物(底物等)的誘導這一特性，通過建立特定的宏基因組文庫，利用流式細胞儀篩選出表達受底物誘導的克隆子[22]。

2 宏基因組學在魚類腸道微生物的應用

2.1 魚類腸道微生物組成

動物復雜而具有動態(tài)的腸道生態(tài)系統(tǒng)對營養(yǎng)的吸收具有重要的作用，腸道微生物不僅與宿主生長發(fā)育和代謝等功能密切相關[23]，還與很多疾病的發(fā)生有關(肝硬化、阿茲海默氏癥等)[24-25]。1990年Moriarty等開始研究水生動物腸道微生物，水生動物的腸道微生物已被證實有利于宿主的營養(yǎng)、生理(產(chǎn)生維生素、氨基酸、消化酶和某些代謝產(chǎn)物)與免疫過程[26-28]，但由于很多微生物無法通過實驗室培養(yǎng)得到，傳統(tǒng)的以培養(yǎng)為主的微生物研究方式受到了很多限制[29]。將宏基因組學研究手段運用于水生生物，對其胃腸道內含物及黏膜等的微生物進行測序，分析其微生物豐度、種類、結構組成和功能等方面的信息，不僅對魚類生長發(fā)育調控、疾病預防等方面具有重要的意義，還規(guī)避了傳統(tǒng)培養(yǎng)手段的不足[30]。

魚類腸道中的優(yōu)勢微生物通常為細菌[31]，主要由好氧菌和兼性厭氧菌組成，酵母菌也常在海水或淡水魚類腸道微生物中發(fā)現(xiàn)，通常有三門核心微生物：厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門[32-33]。與恒溫動物相比，魚類腸道微生物豐度和復雜程度較低。外在或內在的因素變化(腸道的結構、水溫、飲食因素、飼養(yǎng)條件等)都會影響魚類腸道微生物的多樣性和結構組成[34-35]。淡水魚類與海水魚類腸道微生物結構組成具有明顯差異[36]，在淡水魚類物種中，氣單胞菌屬(Aeromonads)、假單胞菌屬和A型擬桿菌(Bacteroides)是主要優(yōu)勢菌群，而海洋魚腸道優(yōu)勢菌群組成則更豐富。如弧菌屬(Vibrio)、無色菌屬(Achromobacter)、交替單胞屬(Alteromonas)、黃桿菌屬(Flavobacterium)等[37]，這或許與海洋魚類更復雜的生境和多樣化的飲食有關。Verner-Jeffreys等[38]利用宏基因組16S rRNA技術對不同生長時期的大西洋比目魚(Hippoglossushippoglossus)腸道微生物進行研究發(fā)現(xiàn)，在未進食的幼魚腸道中就發(fā)現(xiàn)弧菌屬細菌，進食后亮弧菌(V.splendidu)、溶藻弧菌(V.alginolyticus)為優(yōu)勢菌群。但氣單胞菌屬和弧菌屬用常規(guī)分離培養(yǎng)手段極難獲得，Pond等[39]對虹鱒(Oncorhynchusmykiss)腸道微生物16S rRNA測序并分析腸道微生物組成，對比了傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)技術，結果顯示，利用宏基因組學手段從虹鱒腸道中找到嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)、真養(yǎng)羅爾斯通菌(Ralstoniaeutrophia)等傳統(tǒng)手段無法獲取的腸道微生物。單獨使用常規(guī)微生物分離培養(yǎng)技術造成微生物信息不全面，分析結果往往產(chǎn)生偏離。而通過宏基因組手段?？砂l(fā)現(xiàn)無法培養(yǎng)的微生物，Einar等[40]通過對大西洋鮭(Salmosalar)腸道分離出的752個微生物16S rRNA測序，還發(fā)現(xiàn)了枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、氧化微桿菌(Microbacteriumoxydans)等大量被認為無法培養(yǎng)的微生物。魚類腸道微生物組成受多因素影響，食性偏好及生境影響最為明顯，為研究魚類腸道微生物與宿主適應性之間的聯(lián)系，Sullam等[41]對不同河流捕捉的的兩種不同食性孔雀魚(Trinidadianguppies)與人工培育孔雀魚腸道微生物16S rRNA測序，比較其腸道微生物組成結構，研究發(fā)現(xiàn)，不但野生孔雀魚與飼養(yǎng)孔雀魚腸道微生物組成具有顯著差異，同種不同河流生存的野生魚腸道微生物組成也不同。Marianne河孔雀魚梭桿菌目為優(yōu)勢微生物，而Guannpo港的孔雀魚優(yōu)勢微生物為支原體目。實驗室養(yǎng)殖孔雀魚腸道微生物多樣性低于野生魚，個體差異小于野生孔雀魚。Hennersdorf等[42]也利用宏基因組學技術研究印度尼西亞養(yǎng)殖褐點石斑魚(Epinephelusfuscoguttatus)和野生石斑魚腸道微生物，對比飼養(yǎng)與野生魚腸道微生物組成發(fā)現(xiàn)，人工飼養(yǎng)的石斑魚腸道微生物組成結構比野生石斑魚更加平衡，腸道微生物多樣性及豐度均較野生魚低，而野生魚腸道微生物組成個體間差異大于人工飼養(yǎng)魚?？赡苡捎陲曫B(yǎng)條件形成的規(guī)律食物和生境使宿主腸道微生物處于穩(wěn)態(tài)，形成了固定的優(yōu)勢腸道微生物。魚腸道微生物組成還與環(huán)境微生物存在正相關關系，通過對不同生長時期的羅非魚(Oreochromis)幼魚腸道微生物16S rRNA測序研究發(fā)現(xiàn)，隨著幼魚的生長發(fā)育，其腸道微生物種類與環(huán)境微生物種類部分重疊，表明水中的微生物會轉移至腸道中，可能對宿主環(huán)境適應等具有重要的作用[43]。

2.2 魚類腸道微生物與免疫

魚類腸道微生物在抑制病原微生物方面具有重要作用，腸道內的優(yōu)勢菌群可以保護宿主免受環(huán)境復雜微生物的感染與侵害，某些腸道微生物代謝物質還能促進腸道上皮細胞增殖，促進免疫系統(tǒng)的應答反應[44]。Stagaman等[45]對68個正常野生型斑馬魚(Daniorerio)及61個缺乏B或T細胞受體功能的斑馬魚腸道微生物16S rRNA V4區(qū)測序比較，結果表明，適應性免疫對腸道微生物的組成具有過濾作用，腸道微生物的組成或許可以反映出宿主的免疫狀況。Li等[46]對圓口銅魚(Coreiusguichenoti)11個腸道內含物樣品16S rRNA測序，對比健康魚與病變魚腸道微生物組成，研究發(fā)現(xiàn)，病變魚腸內細菌多樣性低于健康魚，而病變魚中變形菌門豐度顯著高于健康魚，其中氣單胞菌屬可能是造成感染疾病的關鍵。環(huán)境壓力，如污染、低氧、溫度驟變會使宿主免疫系統(tǒng)受損，導致病原體的入侵，使得腸道微生物組成出現(xiàn)改變。Jankauskien?等[47]發(fā)現(xiàn)，在海洋魚類和淡水魚類腸道中共有的乳酸菌通常不是腸道優(yōu)勢菌群，但生境出現(xiàn)變化后(如當其處于特定池塘培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)時)乳酸菌會成為腸道優(yōu)勢菌群并保持穩(wěn)定，用以增進對新生境的適應性，增強免疫能力。通過改變腸道微生物結構來增強免疫能力的適應性手段不只在魚類中發(fā)現(xiàn)，通常一些化學元素(抗生素、污染物、農藥、殺蟲劑)進入動物消化道中，均會對其腸道微生物組成產(chǎn)生重要影響[48]。在對雉科鳥類腸道內含物進行宏基因測序，并在京都基因與基因組百科全書代謝通路注釋腸道微生物后表明，雉科鳥類腸道微生物組成中變形菌門明顯高于已知的其他鳥類，在微生物代謝通路中化學物質降解占據(jù)較大比重。也許與雉科鳥類不善于飛翔導致其在地面土壤生境進食時攝入大量土壤有害物質有關[49]。除致病微生物(黃桿菌屬、氣單胞菌屬、假單胞菌屬)會影響魚類腸道微生物組成以外，寄生蟲也對魚類腸道及黏膜微生物造成影響。Llewellyn等[50]對被鮭魚虱(Lepeophtheirussalmonis)寄生后的大西洋鮭皮膚微生物進行16S rRNA V4區(qū)測序分析，結果顯示，被寄生后的大西洋鮭體表微生物豐富度明顯降低。有趣的是，被致病微生物感染的個體通常都伴隨著魚虱的寄生?？赡苁怯捎诒桓腥竞蟮膫€體免疫能力下降而易被寄生蟲入侵。

2.3 魚類腸道微生物與食性

通過分析魚類腸道微生物的結構組成能反映出其生境狀況、飲食等信息，而利用宏基因組學技術，探尋魚類食性與腸道微生物間的關系，是宏基因組學研究的重要部分，也是目前關注度較高，研究開展較多的微生物宏基因組研究領域[51-52]。

不同食性魚類腸道微生物中，為消化吸收不同類型的營養(yǎng)物質，常有標志性微生物存在[48]。Li等[53]利用宏基因組16S rRNA測序技術研究了8種自然環(huán)境下不同食性(肉食性為主、植食性為主和雜食性為主)魚類與腸道微生物的關系。結果表明，不同食性的魚類腸道微生物多樣性和優(yōu)勢微生物群結構組成都具有明顯差異，為通過魚類腸道微生物組成分析魚類主要食性提供了重要指標。通常認為，宿主食物偏好與其腸道微生物組成存在重要聯(lián)系[54]。Ingerslev等[55]利用宏基因組測序技術研究虹鱒腸道微生物發(fā)現(xiàn)，虹鱒腸道微生物的組成由生境及所攝入的食物共同塑造，并且首次攝食可能起到主要的定殖作用。不同食性魚類腸道微生物組成具有明顯差異，并會隨宿主攝食和生長狀況改變出現(xiàn)變化[48]，有些魚類如孔雀魚，在生長不同階段會具有不同的食性偏好，這時其腸道微生物組成也會做出相應調整，協(xié)助宿主更好的吸收營養(yǎng)。不同食性魚類腸道微生物組成由于功能不同(纖維素降解、蛋白質降解、幾丁質降解等)具有差異?，F(xiàn)有魚類食性主要分為植食性魚類、肉食性魚類、濾食性魚類、雜食性魚類4大類。植食性魚類以植物為主要營養(yǎng)來源，食物富含纖維素和多糖。纖維素的降解依賴于多種纖維素酶，但魚類自身無法產(chǎn)生纖維素酶，對纖維素的利用只有依賴腸道微生物分解吸收[56]，植食性魚類腸道中特有微生物多為與纖維素降解有關的微生物。Ni等[57]對草魚(Ctenopharyngodonidellus)腸道微生物16S rRNS測序研究發(fā)現(xiàn)，以植物為主要食物的草魚腸道微生物中，鯨桿菌屬(Cetobacterium)、氣單胞菌屬為優(yōu)勢菌群。Wu等[58]對草魚腸道微生物宏基因組測序后結果表明，除氣單胞菌屬外，檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)、明串珠菌屬(Leuconostoc)也在草魚腸道微生物組成中占據(jù)較大比例。與投喂植物性食物飼養(yǎng)的虹鱒腸道微生物具有類似的組成結構[26]。氣單胞菌屬是淡水植食性魚類腸道微生物優(yōu)勢菌群，與鯨桿菌屬和明串珠菌屬均為主要的纖維素降解菌[59]。鯨桿菌屬還能發(fā)酵碳水化合物，產(chǎn)生維生素B12供宿主吸收利用。腸道微生物中，芽孢桿菌屬也是主要生產(chǎn)纖維素酶的微生物之一。Ghosh等[60]對南亞野鯪(Labeorohita)腸道微生物16S rRNA測序后，在其腸道微生物中找到大量環(huán)狀芽孢桿菌(B.circulans)和短小芽孢桿菌(B.pumilus)；Saha等[33]發(fā)現(xiàn)在食植莫桑比克羅非魚(O.mossambica)和草魚腸道微生物中，環(huán)狀芽孢桿菌和巨大芽孢桿菌(B.megaterium)為優(yōu)勢菌群；Peixoto等[61]對在亞馬遜盆地食草野魚腸道微生物16S rRNA基因測序也發(fā)現(xiàn)大量枯草芽孢桿菌。在多種不同的植食性魚類腸道微生物中均發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌屬微生物的存在，并均為優(yōu)勢腸道菌群，這可能與植食魚類需要其幫助消化吸收植物營養(yǎng)物質有關。肉食性魚類腸道微生物多樣性相比植食性和濾食性魚類要略低，也許與該魚類較為單一的食性偏好有關，肉食性魚類腸道微生物組成中也有與纖維素代謝有關的微生物(鯨桿菌屬、檸檬酸桿菌屬)但量較少。Liu等[62]利用宏基因組16S rRNA技術研究了8種不同食性的野生魚類，將兩種肉食性魚類翹嘴鱖(Sinipercachuatsi)和翹嘴鲌(Culteralburnus)腸道微生物與植食性魚類腸道微生物對比研究，結果表明，兩種肉食性魚類腸道微生物以鹽單胞菌屬(Halomonas)、梭桿菌屬(Fusobacterium)等以產(chǎn)生蛋白酶為主要功能的微生物為優(yōu)勢腸道菌群，酶代謝活性顯示，肉食性魚類中胰蛋白酶活性較高而纖維素酶代謝活性低，植食性魚類中結果相反。草魚腸道中產(chǎn)生纖維素酶的優(yōu)勢菌類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)只在植食性魚類中發(fā)現(xiàn)，在肉食性魚類中并不存在。Ghanbari等[63]通過宏基因組學手段研究濾食性魚類并進行功能預測和對比其他食性魚類發(fā)現(xiàn)，濾食性魚類及雜食性魚類腸道微生物種類及數(shù)量最高，結構組成最豐富，功能預測結果主要集中于碳水化合物代謝方面，腸道微生物組成除變形菌門、梭桿菌門、厚壁菌門這幾種“核心菌群”外，還存在肉食性、植食性魚類腸道中少見的放線菌、藍藻細菌等多種微生物類型。這可能與濾食性雜食性魚類不但攝食常見植物性蟲幼體，還可以濾取個體微小的浮游動植物、有機碎屑、細菌凝聚體等有關，極大擴大了攝食種類，需要復雜的腸道微生物來進行分解吸收[64]。

表1 不同食性代表性魚類腸道優(yōu)勢微生物

3 結語與展望

宏基因組學研究手段繞過了傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)的弊端，以大數(shù)據(jù)測序文庫覆蓋樣品中所含有的盡可能多的微生物基因信息，能夠全面的分析樣本內微生物的種類、豐度以及微生物的功能和代謝通路等信息，現(xiàn)大量運用于動物胃腸道微生物多樣性分析，研究宿主、微生物與生境因素之間的相互關系。但是依然存在一些不足，就環(huán)境樣品微生物研究方面而言，基因組學的手段無法說明微生物基因的表達量情況，當生境或其他因素變化時，同一微生物個體的基因表達也會由于適應環(huán)境出現(xiàn)變化，需結合宏轉錄組學，從轉錄組水平分析樣本微生物的組成及活性基因表達情況，揭示特定生境因素，特定時間下微生物基因表達和調控機制，并且更易發(fā)現(xiàn)新的基因，這些基因在某些特定環(huán)境條件下可能發(fā)揮很大作用[66]。腸道微生物對宿主免疫功能具有重要作用，但由于目前對腸道微生物功能及作用研究有待深入，對魚類腸道微生物與宿主間的互作機制還需加深了解。就研究魚類腸道微生物與食性相關性方面。雖目前許多重要經(jīng)濟養(yǎng)殖魚類(草魚、鯉魚、鮭魚等)都已經(jīng)進行腸道微生物相關方面的研究，但僅停留在客觀描述層面，大多只對腸道微生物的種類及主要結構組成進行了簡要概括，未深入探討腸道微生物結構組成與食性間存在的關系，也少見將腸道微生物功能進行細化并與食性聯(lián)合分析。在4種食性魚類物種中，植食性魚類腸道微生物及食性相關研究開展相對較多，肉食性、雜食性及濾食性魚類物種腸道微生物研究較少。但魚類少有單一性、專有性食性，而多為植食性或肉食性為主的雜食性。雖然16S rRNA擴增后測序對腸道樣品要求(含量等)略低，但與全宏基因組直接高通量測序相比還存在一些問題，如擴增過程中對不同菌群具有偏好性，無法全面的反映微生物的真實信息。相信隨著宏基因組測序成本的下降，分析手段常規(guī)化、簡便化，越來越多的魚類腸道微生物相關研究也會更加全面和深入。