豬源產(chǎn)細(xì)菌素腸球菌的分離鑒定

張永紅，阮文科，李煥榮，楊 瑞，崔德鳳，2＊

（1.北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京102206；2.獸醫(yī)學(xué)（中醫(yī)藥）北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京102206；3.農(nóng)業(yè)應(yīng)用新技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京102206）

我國(guó)是一個(gè)畜牧業(yè)大國(guó)，也是動(dòng)物產(chǎn)品消費(fèi)大國(guó)。動(dòng)物性食品抗生素超標(biāo)而導(dǎo)致的出口損失以及公共衛(wèi)生安全問(wèn)題引起了人們的廣泛關(guān)注。細(xì)菌素是某些細(xì)菌核糖體合成的初級(jí)代謝產(chǎn)物，是一類具有抑菌活性的多肽或蛋白質(zhì)，抑菌范圍不局限于近緣的細(xì)菌，細(xì)菌素產(chǎn)生菌的免疫蛋白對(duì)其細(xì)菌素有自身抗性［1］。乳酸鏈球菌肽Nisin是世界上公認(rèn)安全的防腐劑，已有52個(gè)國(guó)家和地區(qū)使用Nisin作為食品防腐劑，Nisin抑菌譜窄，僅對(duì)革蘭陽(yáng)性菌有抑菌作用，能抑制鏈球菌屬、葡萄球菌屬、小球菌屬、梭菌屬和芽胞桿菌屬的細(xì)菌等［2－3］。Nisin的商品化促進(jìn)了其他種類細(xì)菌素的研究及其在食品防腐劑之外領(lǐng)域的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用。腸球菌作為動(dòng)物腸道的優(yōu)勢(shì)菌群，具有耐膽鹽、耐酸及耐高溫等微生物學(xué)特征，是一種發(fā)酵糖產(chǎn)生大量乳酸的兼性厭氧乳酸菌，與厭氧、培養(yǎng)保存條件苛刻的雙歧桿菌等乳酸菌相比，更適合于生產(chǎn)和應(yīng)用。作為乳酸菌，腸球菌參與了食品發(fā)酵，如乳酪、香腸，同樣也應(yīng)用于青貯飼料的發(fā)酵，由于腸球菌產(chǎn)生細(xì)菌素的多樣性和食品保鮮及畜牧業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用潛力，在過(guò)去幾年中產(chǎn)細(xì)菌素腸球菌激發(fā)了人們的研究熱情，然而豬源腸球菌細(xì)菌素的研究仍較少，更未見(jiàn)替代抗生素作為飼料添加劑的報(bào)道。近年來(lái)細(xì)菌素已被用于病原菌的預(yù)防和治療等研究。Morovsky M等［4］從犢牛和羔羊分離的葡萄球菌產(chǎn)生的細(xì)菌素對(duì)瘤胃球菌和大腸埃希菌具有抑制活性［3］。

本研究從北京優(yōu)良地方品種北京黑豬胃腸道分離篩選對(duì)大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌具有抑菌活性的細(xì)菌素產(chǎn)生菌，采用微生物學(xué)和分子生物學(xué)方法綜合鑒定分離菌株，以期獲得可應(yīng)用動(dòng)物生產(chǎn)和活菌生物制劑的優(yōu)良菌種，為產(chǎn)細(xì)菌素菌株在飼料添加劑中的應(yīng)用提供理論和實(shí)踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、培養(yǎng)基及試劑 大腸埃希菌（E.coli k88）、金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）由北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供，標(biāo)準(zhǔn)菌株糞腸球菌B1和屎腸球菌B2由中科院微生物研究所提供；PYG培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基自制；胰蛋白酶、蛋白酶為K Sigma公司產(chǎn)品；Taq DNA聚合酶，dNTPs，10×PCR buffer為北京匯天東方有限公司產(chǎn)品；BamHⅠ，HindⅢ，EcoRⅠ和SalⅠ酶為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；Rnasin、Peasy－T克隆載體為北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；高純度質(zhì)粒提取試劑盒為Tiangen公司產(chǎn)品；DNA片段快速膠回收試劑盒為博大泰克生物科技公司產(chǎn)品。

1.1.2 培養(yǎng)材料 無(wú)菌采取健康豬的整個(gè)消化道包括胃、小腸、大腸和直腸，分別用滅菌藥勺刮取各個(gè)部位黏膜組織1g于平皿中剪碎，加5mL滅菌生理鹽水混懸，取100μL組織懸液至腸球菌增菌培養(yǎng)基，采用燭缸法37℃培養(yǎng)24h。

1.2 方法

1.2.1 分離純化 選取腸球菌選擇培養(yǎng)基，將有細(xì)菌生長(zhǎng)的增菌液進(jìn)行分離，37℃培養(yǎng)24h。挑取疑似腸球菌菌落，進(jìn)行分離、純化，并分別保存于4℃和－20℃冰箱中備用。

1.2.2 抑菌試驗(yàn) 采用瓊脂打孔擴(kuò)散法，將各指示菌培養(yǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，用滅菌生理鹽水稀釋到107cfu／mL，取100μL涂布PYG培養(yǎng)基平板，打孔。將已分離純化的細(xì)菌接種至MRS培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24h，8 000r／min離心10min，取上清液加至已接種指示菌的PYG平板孔中，以MRS培養(yǎng)基為空白對(duì)照，4℃冰箱中擴(kuò)散后，置37℃培養(yǎng)24h觀察結(jié)果。

1.2.3 過(guò)氧化氫檢測(cè) 將腸球菌分別發(fā)酵培養(yǎng)，8 000r／min離心10min，取上清液。采用H2O2酶法進(jìn)行H2O2的檢測(cè)。同時(shí)將H2O2酶處理前后的上清液進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，比較抑菌活性。

1.2.4 酸排除試驗(yàn) 采用NaOH中和法排除細(xì)菌發(fā)酵產(chǎn)物中酸性物質(zhì)，用6mol／L NaOH調(diào)節(jié)細(xì)菌發(fā)酵上清液至pH 7.0作用30min，以未調(diào)pH發(fā)酵原液及pH為4.5的乳酸、鹽酸為對(duì)照，進(jìn)行指示菌抑菌試驗(yàn)，37℃培養(yǎng)24h測(cè)量抑菌圈直徑。

1.2.5 蛋白酶處理 取培養(yǎng)24h細(xì)菌發(fā)酵上清液，分別加入蛋白酶K、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶，使其終濃度為5g／L，37℃水浴2h后取100μL，測(cè)定抑菌活性，以未加蛋白酶的細(xì)菌上清液作為對(duì)照。

1.2.6 生化試驗(yàn) 將分離純化的細(xì)菌進(jìn)行生化鑒定試驗(yàn)，包括 H2O2酶、pH 9.6營(yíng)養(yǎng)肉湯、400mL／L膽汁七葉苷生長(zhǎng)，45℃營(yíng)養(yǎng)肉湯生長(zhǎng)以及65g／L NaCl營(yíng)養(yǎng)肉湯生長(zhǎng)試驗(yàn)，同時(shí)接種各類糖發(fā)酵培養(yǎng)基，并進(jìn)行細(xì)菌涂片、染色，鏡檢。

1.2.7 乳酸菌16SrDNA基因鑒定 引物參照文獻(xiàn)Halami的通用引物序列，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。預(yù)期擴(kuò)增片段大小為1 500 bp。正向引物p1加入EcoRⅠ和SalⅠ酶切位點(diǎn)，反向引物p2加入BamHⅠ和HindⅢ酶切位點(diǎn)，引物 序 列 如 下：P1：5′－TCATCTGTCCCACCTTGCGC－3′，P2：5′－GAGTTTGATCCTGGCTCAGG－3′。

采用常規(guī)酚／氯仿抽提方法進(jìn)行基因組DNA提取與檢測(cè)，建立PCR反應(yīng)體系50μL其中模板DNA 4μL、Taq DNA 聚 合 酶 1μL、25mmol dNTPs 1μL、10×PCR buffer 5μL、20pmol／μL上下游引物各1μL，加三蒸水至50μL。反應(yīng)程序如下：95 ℃ 5min；94℃ 30s，54 ℃ 30s，72 ℃ 2 min，共35個(gè)循環(huán)；最后于72℃延伸10min。用三蒸水作為陰性對(duì)照。取10μL PCR產(chǎn)物，10g／L瓊脂糖凝膠電泳，采用凝膠成像系統(tǒng)分析擴(kuò)增片斷的長(zhǎng)度，用DNA凝膠回收試劑盒收取鑒定正確的PCR產(chǎn)物。

將純化回收的PCR產(chǎn)物與PGEM－T Easy載體連接，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α載體菌，選取酶切鑒定正確的克隆菌，進(jìn)行序列測(cè)定。利用DNA Star Gentyx等軟件對(duì)分離株16SrDNA基因序列與GenBank中參考菌株序列進(jìn)行同源性比對(duì)，繪制細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié)果

2.1 菌株篩選

利用腸球菌鑒別培養(yǎng)基從健康豬的胃腸道分離到56株細(xì)菌，采用紙片擴(kuò)散法初篩得到對(duì)大腸埃希菌與金黃色葡萄球菌均有抑菌作用的30株菌，隨后采用雙層瓊脂擴(kuò)散法復(fù)篩獲得12株抑菌活性較強(qiáng)的菌株，命名為E1～E12，添加甘油，在－80℃冰凍保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 抑菌物質(zhì)的初步確定

2.2.1 過(guò)氧化氫抑菌作用的排除 某些細(xì)菌的代謝產(chǎn)物H2O2能夠抑制其他細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖，革蘭陰性細(xì)菌對(duì)其尤為敏感。腸球菌在培養(yǎng)過(guò)程中，培養(yǎng)液始終無(wú)紅色產(chǎn)物形成。說(shuō)明沒(méi)有形成H2O2或其含量微乎其微。

采用過(guò)氧化氫酶處理后的細(xì)菌發(fā)酵上清液，進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，與未處理對(duì)照組比較，發(fā)酵上清液的抑菌活性沒(méi)有變化，排除了H2O2對(duì)指示菌的抑制作用。

2.2.2 酸類抑菌物質(zhì)的排除 乳酸菌產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)還包括大量酸性代謝產(chǎn)物如乳酸、乙酸和細(xì)菌素類物質(zhì)等，為了排除酸性代謝產(chǎn)物的作用，取培養(yǎng)24h的菌株發(fā)酵上清液，用6mol／L NaOH調(diào)節(jié)pH至7.0后，進(jìn)行抑菌試驗(yàn)（表1）。結(jié)果顯示，pH為7.0的細(xì)菌上清液仍具有較強(qiáng)的抑菌活性，說(shuō)明酸被中和后的細(xì)菌上清液中仍有抑菌活性物質(zhì)。

表1 酸排除后的抑菌作用Table 1 The results of antibacterial effects by supernatant without acid mm

2.2.3 蛋白酶降解檢測(cè) 取細(xì)菌培養(yǎng)上清液分別進(jìn)行胰蛋白酶、蛋白酶K和木瓜蛋白酶處理，以未經(jīng)酶液處理的原液作對(duì)照。結(jié)果見(jiàn)圖1，經(jīng)胰蛋白酶、蛋白酶K和木瓜蛋白酶處理后的細(xì)菌上清液抑菌活性明顯降低，說(shuō)明培養(yǎng)菌上清液中的抑菌物質(zhì)中含有蛋白質(zhì)或多肽成分，可以初步判斷細(xì)菌發(fā)酵產(chǎn)生了一類具有蛋白性質(zhì)的細(xì)菌素類抑菌物質(zhì)。

圖1 蛋白酶處理后的抑菌活性Fig.1 Results of antibacterial activity from treatment with protease

2.3 菌株鑒定

2.3.1 細(xì)菌形態(tài)與培養(yǎng)特性 分離菌革蘭染色呈陽(yáng)性，圓形或卵圓形，單在、成對(duì)或形成短鏈狀排列，無(wú)莢膜、無(wú)芽孢、無(wú)鞭毛的球菌。該菌在腸球菌選擇培養(yǎng)基上形成紫紅色，表面光滑凸起，周邊整齊，直徑0.5mm～1.0mm的菌落見(jiàn)圖2，在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，形成圓形灰白色，針尖狀或露滴狀的小菌落，濕潤(rùn)、半透明，邊緣整齊，無(wú)溶血性。

圖2 分離菌株特征Fig.2 Gram staining trait and growth trait of isolated bacteria

2.3.2 生化特征 分離菌接觸酶陰性，膽汁七葉苷試驗(yàn)陽(yáng)性，65g／L的NaCl生長(zhǎng)陽(yáng)性、45℃生長(zhǎng)陽(yáng)性，細(xì)菌運(yùn)動(dòng)力陰性符合腸球菌屬的鑒別特征，結(jié)合v－p試驗(yàn)、馬尿酸、精氨酸、糖發(fā)酵等試驗(yàn)結(jié)果，表明E1、E9和E12，3株細(xì)菌為屎腸球菌（Enterococcus faecium），E2、E3、E4、E5、E6、E7、E8、E10和 E11 9株為糞腸球菌（Enterococcusfaecalis）見(jiàn)表2、表3。2.3.4 PCR擴(kuò)增及重組質(zhì)粒鑒定 以12株分離菌和陽(yáng)性參考菌基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳，PCR擴(kuò)增結(jié)果。產(chǎn)物片段大小約1.5kb，與預(yù)期目的片段相符。陰性對(duì)照未出現(xiàn)特異性條帶。對(duì)重組質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果（圖3）。

形態(tài)學(xué)和生理生化鑒定結(jié)合16SrDNA序列分析結(jié)果顯示，E2、E3、E4、E5、E6、E7、E8、E10和E11 9株分離菌與參考菌株FJ749378糞腸球菌同源性高達(dá)99.6% ～100% （圖4）；3株分離菌E1、E9、E12與B2、參考菌株FJ749740屎腸球菌組成一個(gè)分支（圖5），與同源性結(jié)果一致。根據(jù)腸球菌生化特征及16SrDNA序列鑒定，判定9株菌E2、E3、E4、E5、E6、E7、E8、E10和 E11為糞腸球菌，3株E1、E9和E12為屎腸球菌。

表2 分離菌生理生化鑒定Table 2 Physiological and biochemical characteristics of the strains

表3 分離菌糖發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果Table 3 The results of carbohydrate fermentation of the strains

圖3 12株分離菌及參考菌株16SrDNA基因重組質(zhì)粒鑒定Fig.3 Identification of 16SrDNA gene recombination plasmid of isolated bacteria and standard bacteria

圖4 12株分離菌與參考菌株的16SrDNA基因序列同源性Fig.4 The homology of twelve isolated bacteria and standard bacteria

圖5 12株腸球菌與參考菌株的16SrDNA基因進(jìn)化樹(shù)Fig.5 Phylogenetic tree of 16SrDNA sequences of 12strains

3 討論

現(xiàn)代細(xì)菌學(xué)分類一般采用細(xì)菌的基因型特征結(jié)合生物型特征的方法，比較公認(rèn)的是依據(jù)細(xì)菌16S rDNA序列進(jìn)行分類。目前分類的標(biāo)準(zhǔn)是：99%～100%全序列相似性的細(xì)菌判定為同一個(gè)種，97%～100%全序列相似性的細(xì)菌判定為同一屬。

因此，16SrDNA基因序列可作為細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育分析、鑒定的最合適指標(biāo)。自從Woese等將16S rDNA序列同源性用于生物的系統(tǒng)發(fā)育研究以來(lái)，細(xì)菌的鑒定手段也從以生物表型特征為依據(jù)發(fā)展到以系統(tǒng)發(fā)育分子為依據(jù)的分子生物學(xué)鑒定。Reysenbach A L 等［7－8］試 驗(yàn) 證 明16SrDNA 序 列 分 析法是鑒定益生菌株的一種非常有效的方法 。

腸球菌是美國(guó)FDA 1989年公布的動(dòng)物益生菌種之一，腸球菌是一類革蘭陽(yáng)性、兼性厭氧乳酸菌，是人類及動(dòng)物胃腸道的主要菌群，在調(diào)節(jié)動(dòng)物腸道菌群平衡中起著重要的作用，具有恢復(fù)感染腸道的菌群平衡，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，促進(jìn)動(dòng)物健康的作用。

本研究以致病性大腸埃希菌K88、K99、金黃色葡萄球菌作為指示菌，利用鑒別培養(yǎng)基從健康北京黑豬胃腸道分離、篩選腸球菌，以期獲得對(duì)革蘭陽(yáng)性和革蘭陰性病原菌具有抑制作用的廣譜菌株。通過(guò)形態(tài)學(xué)、生理生化特征分析結(jié)合16SrDNA系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化研究對(duì)12株具有較強(qiáng)抑菌活性的菌株進(jìn)行種屬鑒定。結(jié)果表明E2、E3、E4、E5、E6、E7、E8、E10、E11和B1與GenBank中收錄的糞腸球菌FJ749378同源性在99.3%～100%；3株分離菌E1、E9、E12和B2與屎腸球菌FJ749740組成一個(gè)大的分支，生物表型與基因型二種方法的分析鑒定結(jié)果相一致，本試驗(yàn)分離菌株E2、E3、E4、E5、E6、E7、E8、E10和E11為糞腸球菌，E1、E9、E12為屎腸球菌。

乳酸菌的抑菌作用由多種因素構(gòu)成，包括甲酸、乙酸等有機(jī)酸、過(guò)氧化氫和細(xì)菌素等物質(zhì)。篩選產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌，一般采用有機(jī)酸和過(guò)氧化氫排除抑菌試驗(yàn)后，發(fā)酵液仍具有抑菌活性，可以初步確定菌株產(chǎn)生細(xì)菌素。本試驗(yàn)采用紙片擴(kuò)散法從健康豬胃腸道分離到56株細(xì)菌，初篩得到對(duì)金黃色葡萄球菌及大腸埃希菌（包括了革蘭陽(yáng)性菌和革蘭陰性菌）均有抑制作用30株菌，隨后采用瓊脂擴(kuò)散法復(fù)篩得到12株具有較強(qiáng)抑菌活性的菌株，在排除過(guò)氧化氫、有機(jī)酸等抑菌物質(zhì)作用后仍具有較強(qiáng)抑菌活性，說(shuō)明發(fā)酵液中有其他抑菌活性物質(zhì)的存在，采用蛋白酶處理發(fā)酵上清液后抑菌活性明顯下降，說(shuō)明這種活性物質(zhì)具有蛋白質(zhì)性質(zhì)，初步判斷為一種細(xì)菌素類物質(zhì)。

能夠產(chǎn)生細(xì)菌素的細(xì)菌包括革蘭陽(yáng)性菌和革蘭陰性菌。革蘭陽(yáng)性菌的研究主要集中在乳酸菌，發(fā)酵工業(yè)中應(yīng)用的乳酸菌主要包括片球菌（Pediococcus）［9］，明串珠菌（Leuconostoc）［10］，乳桿菌（Bacterium lacticum），雙歧桿菌（Bacillus bifidus），腸球菌（Enterococcus），鏈球菌（Streptococcus）［11］以及肉食桿菌（Carnobacterium）屬等［12］。乳酸菌幾乎每個(gè)屬種，甚至每一株菌都能產(chǎn)生細(xì)菌素。Green G等［15］報(bào)道了從片球菌屬分離的NCFB 1832菌產(chǎn)生的Pediocin PD－1對(duì)食物腐敗菌和病原菌的抑制作用，對(duì)片球菌屬其他細(xì)菌無(wú)活性［13－14］。產(chǎn)生細(xì)菌素的口腔優(yōu)勢(shì)非致病菌唾液鏈球菌具有成為益生菌制劑的潛力。

Corvey C等［16］從枯草芽胞桿菌提取出的枯草菌素（subticin），是一種環(huán)多肽，能抑制真菌，但對(duì)細(xì)菌作用很小。Kramer J等［17］鑒定的糞腸球菌（Enterococcus faecalis）所產(chǎn)細(xì)菌素能抑制李斯特菌（L.monocytogenes）和酪丁酸梭菌（Clostridium tyroburicum）等病原菌和污染菌，本研究分離獲得的腸球菌來(lái)自優(yōu)良地方品種－北京黑豬，并具有益生菌耐熱、耐酸、抗膽鹽，容易培養(yǎng)等特征［18］。其抗菌活性的特性有待進(jìn)一步研究，并在動(dòng)物傳染病的防控中具有一定的應(yīng)用前景。

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