乳沒活絡(luò)散的質(zhì)量控制及穩(wěn)定性研究

孫佳 田勇 楊淑婷

【摘 要】 目的：建立乳沒活絡(luò)散（Rumohuoluo San）中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1含量測定方法，以控制產(chǎn)品質(zhì)量。方法：以高效液相色譜法，采用Inertsil ODS-3（4.6mm×250mm，5 μm），Phenomonex C18（4.6mm×250mm，4μm），Hypersil C18（5.0mm×200mm，5μm），流動相乙腈（A）-水（B）梯度洗脫（0～12min，19%A；12～32min，19%～30%A；32～40min，30%A；40～54min，30%～38%A；54～60min，38%A），檢測波長203nm，流速1.0mL/min，柱溫45℃，對本方君藥三七中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1特征性成分含量進行同時測定。結(jié)果：本方法可同時檢測乳沒活絡(luò)散中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1；上述3種成分進樣濃度分別在0.04268～0.4268mg/L、0.07564～0.7564mg/L和0.08672～0.8672mg/L時線性關(guān)系良好（r> 0.9994），平均回收率分別為100.1%、99.78%和101.4%，RSD 在1.3%～2.5%（n=9）。穩(wěn)定性方面，3批乳沒活絡(luò)散經(jīng)過6個月加速試驗和24個月長期試驗，各項指標均符合要求。結(jié)論：所建立的方法專屬，準確度、精密度及耐用性良好，可用于乳沒活絡(luò)散的質(zhì)量控制。乳沒活絡(luò)散質(zhì)量可控穩(wěn)定性好。

【關(guān)鍵詞】 乳沒活絡(luò)散；高效液相色譜；三七皂苷R1；人參皂苷Rg1；人參皂苷Rb1

【中圖分類號】R284.1 【文獻標志碼】 A 【文章編號】1007-8517（2018）16-0022-04

Abstract：Objective To established a method for the determination of the contents of Notoginsenoside R1， Ginsenoside Rg1 and Rb1 inRumohuoluo San and provide a reference for its quality control.Method High performance liquid chromatography （HPLC） method was employed to simultaneously determine the contents of Notoginsenoside R1， Ginsenoside Rg1 and Rb1 inRumohuoluo San. The HPLC method was performed on Inertsil ODS-3 column （4.6mm×250mm， 5 μm）， Phenomonex C18 column （4.6mm×250mm， 4μm） and Hypersil C18 column （5.0mm×200mm， 5μm） with acetonitrile （A）-water （B） as mobile phase for gradient elution （0～12min， 19%～30%A； 32～40min， 30%A； 40～54min， 30%～38%A； 54～60min， 38%A）. The detection wavelength was 203nm， the flow rate was 1.0mL·min-1 and the column temperature was 45℃. Results The HPLC method can simultaneously evaluate the contents of Notoginsenoside R1， Ginsenoside Rg1 and Rb1 inRumohuoluo San. Notoginsenoside R1 showed a good linear relationship from 0.04268～0.4268mg/L， Ginsenoside Rg1 from 0.07564～0.7564mg/L and Ginsenoside Rb1 from 0.08672～0.8672mg/L（R>0.9994）. The average recovery of Notoginsenoside R1， Ginsenoside Rg1 and Rb1was 100.1%、99.78% and 101.4% respectively with RSD of 1.3 %～2.5% （n=9）. The stability test showed that the various indexes of 6 pilot test samples met the quality standard of Rumohuoluo San. Conclusion The established HPLC method is specific， accurate， reproducible and robust， whcih is suitable for the quality control of Rumohuoluo San. Rumohuoluo San is stable and controllable in quality.

Keywords：Rumohuoluo San；HPLC；Notoginsenoside R1；Ginsenoside Rg1；Ginsenoside Rb1

乳沒活絡(luò)散源于貴州省土家族民族處方，由三七、沒藥、乳香和制川烏等十味中藥制成的散劑，具有活血化瘀、舒經(jīng)活絡(luò)、消腫止痛，促進骨折愈合功能，用于氣滯血瘀型骨折、腫脹、瘀斑、肢節(jié)活動障礙等疾病，民間藥用歷史已有兩百余年，臨床療效確切。貴州省思南田氏民族傳統(tǒng)骨傷醫(yī)院根據(jù)該驗方開發(fā)了醫(yī)療機構(gòu)制劑（批準文號：黔藥制字Z20170134），該制劑已臨床使用三十余年，療效顯著，深受患者歡迎。為有效控制乳沒活絡(luò)散的質(zhì)量，本研究擬以乳沒活絡(luò)散中主藥三七的人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1和三七皂苷R1為特征性指標成分，建立乳沒活絡(luò)散的含量測定控制方法，并對乳沒活絡(luò)散的穩(wěn)定性進行考察。

1 儀器與材料

1.1 儀器 ULmate3000高效液相色譜儀（美國Thermo公司），LC-20AD高效液相色譜儀（日本島津公司）；TGL-16G高速離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）；AE240十萬分之一電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）。

1.2 材料 乳沒活絡(luò)散（批號：20160113、20160116、20160121、20170708、20170712、20170915，規(guī)格：20g/袋）；人參皂苷Rg1 對照品（批號：110703-201529）、人參皂苷Rb1對照品（批號：110704-201424）和三七皂苷R1對照品（批號：110745-201318）均購自中國藥品生物制品鑒定所；乙腈（色譜純，天津科密歐化學(xué)制劑有限公司），其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

2.1.1 對照品溶液的制備 分別稱取三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1對照品10.67，18.91，21.68mg，置10mL量瓶中，加50%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制得每1mL含三七皂苷R1 1.067g/L、人參皂苷Rg1 1.891g/L和人參皂苷Rb1 2.168g/L的混合對照品儲備液。分別精密吸取混合對照品儲備液0.2、0.4、0.8、1.6、2mL分別置5個5mL量瓶中，分別加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，制得三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1系列對照品工作液。

2.1.2 供試品溶液及缺三七藥材陰性對照液的制備 取乳沒活絡(luò)散供試品1g，精密稱定，置索式提取器中，加乙醚50mL，加熱回流1h，放冷，棄去乙醚液，藥渣揮干，加甲醇50mL，加熱回流5h，放冷，提取液蒸至近干，殘渣加氨試液10mL使溶解，移置分液漏斗中，用水飽和的正丁醇振搖提取4次，每次20mL，合并正丁醇液，用正丁醇飽和的水20mL洗滌1次，分取正丁醇液，蒸至近干，殘渣用適量50 %甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至10mL量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。另取按本品制備工藝制備的缺三七藥材陰性制劑1g，精密稱定，同法制備陰性對照液。

2.2 色譜條件及專屬性考察 色譜柱：Inertsil ODS-3（4.6×250mm，5μm）；流動相：乙腈（A）-水（B）梯度洗脫，洗脫程序（0～12min，19%A；12～32min，19%～30%A；32～40min，30%A；40～54min，30%～38%A；54～60min，38%A）；流速：1.0mL/min；柱溫45℃；檢測波長203nm。在該色譜條件下，各色譜峰與樣品中其他組分色譜峰達基線分離，三七皂苷R1理論板數(shù)大于79000，如圖1所示。

2.3 線性關(guān)系考察 分別精密吸取上述對照品系列工作液10μL，注入液相色譜儀，記錄峰面積，以峰面積Y為縱坐標，進樣濃度（mg/L）為橫坐標進行線性回歸，分別計算線性回歸方程，結(jié)果見表1。

2.4 精密度試驗

2.4.1 重復(fù)性試驗 精密稱定取本品0.5，1，1.5g，照供試品溶液制備方法制備供試品溶液，精密量取供試品溶液10μL進樣測定，并計算平均含量。每個稱量做3個平行。在取樣為0.5～1.5g時，三七皂苷R1，平均含量為0.1054%，RSD為1.7%（n=9）；人參皂苷Rg1平均含量為0.5781%，RSD為1.9%（n=9）；人參皂苷Rb1平均含量為0.5234%，RSD為1.4%（n=9）。表明在稱量0.5～1.5g范圍內(nèi)該方法重復(fù)性良好。

2.4.2 中間精密度 以不同的實驗人員在不同時間按供試品溶液制備方法分別制備3份供試品溶液并測定。三七皂苷R1平均含量為0.1061%，RSD為1.6%（n=6）；人參皂苷Rg1平均含量為0.5788%，RSD為1.8%（n=6）；人參皂苷Rb1的平均含量為0.5202%之間，RSD為2.0%（n=6）。測定結(jié)果顯示表示方法的中間精密度良好。

2.5 加樣回收率 取已測定三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1和含量的制劑（三七皂苷R1 0.1054%，人參皂苷Rg1 0.5781%，人參皂苷Rb1 0.5234%）0.5g，精密稱定，每個稱量平行3份，分別按所取樣品量中人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1和三七皂苷R1質(zhì)量數(shù)的50%、100%和150%的量精密加入對照品，照供試品溶液制備方法制備供試液，測定結(jié)果顯示三種被測定化合物的回收率在99.78%～101.4%之間，RSD 在1.3 %～2.5%（n=9）之間，說明加樣回收率良好。

2.6 耐用性試驗 為考察所建立的分析方法耐用性，對供試品溶液的穩(wěn)定性、不同色譜柱溫、不同檢測波長、不同流速、不同品牌色譜柱、不同品牌的儀器分別進行考察。

2.6.1 供試品溶液穩(wěn)定性考察 取同一供試品，按供試品溶液制備方法制備供試液，分別于0、2、4、8、24h進樣，結(jié)果人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1和三七皂苷R1峰面積的RSD分別為0.62%～1.5%（n=5），表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6.2 不同色譜柱分析結(jié)果比較 按擬定的色譜條件，用Inertsil ODS-3（4.6mm×250mm， 5μm）、Phenomonex C18（4.6mm×250mm， 4μm）和伊利特C18（5.0mm×200mm， 5μm）3種色譜柱對同一批號供試品進行測定。三七皂苷R1平均含量為0.1056%，RSD為2.2%（n=6）；人參皂苷Rg1平均含量為0.5784%（n=6），RSD為1.5%（n=6）；人參皂苷Rb1的平均含量為0.5233%，RSD為1.9%（n=6）。

2.6.3 不同流速測定結(jié)果比較 以Inertsil ODS-3（4.6mm×250mm， 5μm）色譜柱，以相同的流動相和洗脫梯度條件，分別按0.95、1.00和1.05mL/min不同流速的進行分析。三七皂苷R1平均含量為0.1079%，RSD為2.7%（n=9）；人參皂苷Rg1平均含量為0.5790%，RSD為1.0%（n=9）；人參皂苷Rb1的平均含量為0.5201%之間，RSD為2.3%（n=9）。結(jié)果表明三種流速測試的結(jié)果基本一致。

2.6.4 不同柱溫測定結(jié)果比較 以Inertsil ODS-3（4.6mm×250mm， 5μm）色譜柱，按相同梯度和流速進行洗脫，分別33℃、35℃、和37℃進行分析。三七皂苷R1平均含量為0.1110%，RSD為2.2%（n=9）；人參皂苷Rg1平均含量為0.5790，RSD為1.7%（n=9）；人參皂苷Rb1的平均含量為0.5264%，RSD為1.0%～2.6%（n=9）。

2.6.5 不同檢測波長測定結(jié)果比較 以Inertsil ODS-3（4.6mm×250mm， 5μm）色譜柱，分別以201nm、203nm和205nm進行檢測，其余色譜條件不變進行測定。三七皂苷R1平均含量為0.1107%，RSD為1.7%（n=9）；人參皂苷Rg1平均含量為0.5974%，RSD為2.0%（n=9）；人參皂苷Rb1的平均含量為0.5285%之間，RSD為2.3%（n=9）。結(jié)果表明波長的小幅變動對測定結(jié)果基本不影響。

2.6.6 不同型號儀器分析結(jié)果比較 按擬定的色譜條件，采用Inertsil ODS-3（4.6mm×250mm， 5μm）色譜柱，以Thermo ULmate3000和島津 LC-20AD高效液相色譜儀對同一批號供試品進行測定，結(jié)果三七皂苷R1平均含量為0.1092%，RSD為1.7%（n=6）；人參皂苷Rg1平均含量為0.5790%，RSD為1.3%（n=6）；人參皂苷Rb1的平均含量為0.5248%，RSD為2.3%（n=6）。

2.6.7 制劑中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1含量測定 取三批次乳沒活絡(luò)散，按照本方法進行樣品處理和成分測定，結(jié)果見表2。

2. 7 乳沒活絡(luò)散穩(wěn)定性研究

2.7.1 加速穩(wěn)定性考察 取模擬醫(yī)院制劑包裝樣品（20160113、20160116和20160121批次），置溫度（40±2）℃，相對濕度75%±5%，分別于0、1、2、3、6月取樣進行檢測。測定結(jié)果表明，本品所測三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1含量。試驗結(jié)果表明，經(jīng)過6個月加速試驗考察，制劑中的三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1含量沒有明顯變化，分別為0.1075%～0.1119%、0.5567%～0.5661%和0.5012%～0.5148%，符合質(zhì)量標準要求。

2.7.2 長期穩(wěn)定性考察 取模擬醫(yī)院制劑包裝樣品，室溫貯藏24個月。分別于0、3、6、9、12、18、24月取樣進行檢測。測定結(jié)果表明，本品所測三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1含量。試驗結(jié)果表明，經(jīng)室溫留樣長期試驗24個月，制劑中的三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1含量沒有明顯變化，分別為0.1055%～0.1108%、0.5517%～0.5613%和 0.4981%～0.5118%，符合質(zhì)量標準要求。

3 討論

乳沒活絡(luò)散由十味藥材組成，直接采用甲醇提取正丁醇萃取方法制備得到的供試品溶液雜質(zhì)多，干擾嚴重，被測成分分離度達不到要求，同時，對色譜柱污染嚴重，因此需要進一步凈化樣品。根據(jù)皂苷類化合物理化性質(zhì)，先采用乙醚去除制劑中的脂溶性成分，再用甲醇提取制劑三七中皂苷類化合物，將甲醇提取液蒸至近干后，殘渣用氨試液溶解，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，用水飽和的正丁醇萃取皂苷類成分，除去酚酸類酸性成分，所得的供試品溶液進樣分析時被測成分分離良好，雜質(zhì)不干擾測定。

目前測定三七中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1含量的方法多采用高效液相色譜法梯度洗脫[1-8]，選用紫外檢測器[1-5]、蒸發(fā)光檢測器[6-8]進行測定。也有用超高效液相色譜法[9]測定其含量，但該法對儀器要求比較高，設(shè)備較昂貴，不易普及。本研究參考文獻報道[1-5]，在《中國藥典》[10]方法的基礎(chǔ)上針對本方進行了不同色譜柱、不同流速等條件的改良測定，建立了從供試品制備到樣品檢測的三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1含量測定方法。結(jié)果證明該法具有樣品處理簡單、專屬性強、靈敏度高，重復(fù)性好等特點，可以作為乳沒活絡(luò)散的質(zhì)量控制方法。在乳沒活絡(luò)散穩(wěn)定性試驗中，除三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1含量測定外，還分對外觀性狀、鑒別、各項檢查及微生物等指標進行了考察，結(jié)果均符合質(zhì)量標準要求，說明本品在24 個月內(nèi)質(zhì)量穩(wěn)定，直接接觸藥品的包裝對藥品質(zhì)量無影響，故乳沒活絡(luò)散的有效期暫定為24 個月。

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（收稿日期：2018-06-19 編輯：程鵬飛）