HPLC法同時(shí)測(cè)定不同產(chǎn)地五味子中5種木脂素類成分的含量

吳浩善 張冬月 虞小靜 李思雨 張慧

【摘 要】 目的：利用高效液相色譜法測(cè)定不同產(chǎn)地五味子中5種木脂素類成分的含量，并比較其差異。方法：采用菲羅門XB-C18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-水（B），梯度洗脫（0～10min，A為50%；10～15min，A為50%～75%；15～25min，A為75%；25～30min，A為75%～50%）；檢測(cè)波長：217nm；流速：1.0mL/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣體積：10μL。結(jié)果：5種木脂素類成分與相鄰組分分離度均大于1.5，方法學(xué)考察結(jié)果均符合有關(guān)規(guī)定。結(jié)論：不同產(chǎn)地五味子中木脂素類成分含量存在較大程度的差異，建立的HPLC方法能夠同時(shí)測(cè)定五味子藥材中的5種成分的含量，可用于五味子藥材及其制劑中木脂素類成分的含量測(cè)定和質(zhì)量控制。

【關(guān)鍵詞】 五味子；不同產(chǎn)地；木脂素；含量測(cè)定；高效液相色譜

【中圖分類號(hào)】R284 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A 【文章編號(hào)】1007-8517（2018）05-0009-05

Abstract： Objective To determine the contents of five lignans in Schisandra chinensis （Turcz.） Baill，and compare the differences among different habitats. Methods Phenomenex XB-C18 column （ 4.6mm × 250mm，5μm） was used. Acetonitrile（ A） -water（ B） was used as gradient mobile phase（0～10min，50% A；10～15min，50%～75% A；15～25min，75% A；25～30min，75%～50% A） . The flow rate was 1.0 mL·min-1. The detection wavelength was 217nm and the column temperature was 30℃. Results Chromatographic separation is greater than 1.5， the results of the methodology are consistent with the relevant regulations. Conclusion The HPLC method developed for simultaneous determination of 5 lignans is simple and valid. It can be used for quality evaluation and quality control of Schisandra chinensis （ Turcz. ） Baill， which can be used in the determination and quality control of the content of lignans in the medicine and its preparation.

Keywords：Schisandra chinensis （Turcz.） Baill.；Different Habitats；Lignans；Content Determination；High Performance Liquid Chromatography

五味子為木蘭科植物五味子Schisandra chinensis（Turcz.）Baill的干燥成熟果實(shí)，主產(chǎn)于遼寧省，吉林、黑龍江產(chǎn)量也相對(duì)較大，臨床用于治療久咳虛喘、心悸失眠、盜汗、津傷口渴等癥[1]。木脂素類化合物是五味子中含量較高且具有顯著生物活性的成分[2]，藥理作用顯著，其單體和總木脂素已經(jīng)廣泛應(yīng)用于在對(duì)抗炎癥[3]、肝損傷修復(fù)[4]、腫瘤的預(yù)防和治療[5]等方面。本研究建立HPLC同步測(cè)定5種木脂素類化合物含量的分析方法，對(duì)五味子藥材的質(zhì)量進(jìn)行了分析與評(píng)價(jià)，以期為五味子藥材及復(fù)方制劑的質(zhì)量評(píng)價(jià)和監(jiān)管提供一定的參考依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Agilent 1100型高效液相色譜儀（Agilent科技有限公司）；AR2140型電子分析天平（上海奧豪斯公司）；METTLER AB135-S十萬分之一電子天平（瑞士）；FW-80 型粉碎機(jī)；KQ-250D型數(shù)控超聲波清洗器。

1.2 材料 五味子藥材共29批，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)張慧教授鑒定，均為正品，藥材具體信息見表1。甲醇為分析純；乙腈為色譜純；水為娃哈哈純凈水。五味子醇甲（批號(hào)：Y17M8H31887）、五味子醇乙（批號(hào)：P28S6F3984）、五味子甲素（批號(hào)：Z23J7B16583）、五味子乙素（批號(hào)：P25M7F11829）、五味子丙素（批號(hào)：P28J8F36961）等均購自上海源葉生物科技有限公司，純度均≥98%。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：菲羅門XB-C18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-水（B），梯度洗脫條件為0～10min，A為50%；10～15min，A為50%～75%；15～25min，A為75%；25～30min，A為75%～50%。流速：1.0mL/min；檢測(cè)波長：217nm；進(jìn)樣體積：10μL；柱溫：30℃，色譜圖如圖1～2所示。

2. 2 混合對(duì)照品溶液制備 分別精密稱取各對(duì)照品適量，甲醇超聲溶解，得對(duì)照品濃溶液。精密吸取一定量的各對(duì)照品濃溶液，加甲醇稀釋成含五味子醇甲（0.2048mg/mL）、五味子醇乙（0.0493mg/mL）、五味子甲素（0.0984mg/mL）、五味子乙素（0.0463mg/mL）、五味子丙素（0.01056mg/mL）的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液，備用。

2.3 供試品溶液制備 五味子藥材粉碎，過50目篩，取粉末約0.5g，精密稱定，置50mL具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25mL，稱定重量，超聲處理30min，拭干錐形瓶表面放涼，稱重，甲醇補(bǔ)足減失的重量，靜置，取上清液，以0.45μm微孔濾膜過濾，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系考察 分別精密移取混合對(duì)照品儲(chǔ)備液0.1、0.25、0.5、0.75、1mL，置1mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，精密吸取各混合對(duì)照品稀釋液及各單個(gè)對(duì)照品溶液（樣品中5種木脂素類化合物含量差異懸殊，僅以稀釋后的混合對(duì)照品溶液無法滿足整個(gè)線性范圍，因此各成分的最高濃度采用單標(biāo)試驗(yàn)）各10μL，注入液相色譜儀，檢測(cè)，以對(duì)照品的進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)，峰面積值為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。具體見表2。

2.4.2 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取混合對(duì)照品儲(chǔ)備液10μL，依色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)峰面積，計(jì)算得5種木脂素類成分的RSD分別為0.95%、0.64%、0.79%、1.6%和1.2%，符合規(guī)定，儀器精密度良好。

2.4.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批次五味子藥材粉末6份（遼寧1批），各約0.5g，精密稱定，按供試品溶液制備方法制備供試品溶液，依色譜條件進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)5種木脂素類化合物的峰面積，計(jì)算其在樣品中含量的RSD，分別為1.43%、0.52%、1.24%、1.85%、2.1%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取五味子藥材粉末（遼寧1批）約0.5g，精密稱定，按供試品溶液制備方法制備供試品溶液，依色譜條件進(jìn)行測(cè)定。分別于0、2、4、6、8、12h各進(jìn)樣10μL，得峰面積，并計(jì)算各成分峰面積的RSD，分別為0.27 %、1.35 %、0.8%、1.64%、2.2%，說明供試品溶液在12h 內(nèi)穩(wěn)定，滿足含量測(cè)定要求。

2.4.5 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取已知含量的同一批五味子藥材粉末（遼寧1批）約0.25g，精密稱定，共6份，分別加入對(duì)照品適量，依法制備供試品溶液，依色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算5種成分的平均回收率及RSD，結(jié)果顯示，5種木脂素類成分的平均加樣回收率均在99%～100%之間，RSD均小于2%，符合相關(guān)規(guī)定，表明方法的準(zhǔn)確度良好。具體見表3。

2.5 樣品含量測(cè)定 取各批次的五味子藥材（過50目篩）約0.5g，精密稱定，各2份，依法制備供試品溶液，依色譜條件進(jìn)行測(cè)定，得各化合物的峰面積，根據(jù)外標(biāo)法中的線性回歸方程方法計(jì)算樣品中5種木脂素類成分含量。結(jié)果見表4。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)多個(gè)色譜條件進(jìn)行考察，包括甲醇-水、乙腈-水、甲醇-乙腈-水，3種梯度洗脫的流動(dòng)相條件，最終確定乙腈-水的梯度洗脫為本實(shí)驗(yàn)選擇的色譜條件，主要優(yōu)點(diǎn)是在該色譜條件下樣品中各被測(cè)成分的色譜峰與相鄰成分均實(shí)現(xiàn)基線分離，色譜峰對(duì)稱性良好，且分析時(shí)間快，僅需30min就可以完成整個(gè)含量測(cè)定過程。同時(shí)也考察了不同柱溫（25℃、30℃、35℃）、不同檢測(cè)波長（217nm、254nm）對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，結(jié)果表明柱溫對(duì)待測(cè)成分的色譜峰的分離度有影響，當(dāng)柱溫為30℃時(shí)，分離度最佳；以254nm作為檢測(cè)波長時(shí)，各色譜峰峰形變差，且因各批次藥材中五味子丙素含量均較低，紫外吸收弱，色譜峰響應(yīng)效果不理想，故選擇色譜峰響應(yīng)效果、峰形均良好的217nm作為檢測(cè)波長。

在前期材料的準(zhǔn)備過程中，藥材均產(chǎn)自五味子的主要產(chǎn)區(qū)：遼寧、吉林、黑龍江，29批藥材大部分均收集自東北地區(qū)具有代表性的沈陽、哈爾濱的藥材市場(chǎng)，以及在全國具有知名度的亳州、安國藥材市場(chǎng)，既確保了藥材產(chǎn)地的道地性和科學(xué)性，又收集了足夠多的樣品，確保了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的真實(shí)、可靠、有代表性。同時(shí)對(duì)五味子藥材的產(chǎn)地加工、倉儲(chǔ)以及非產(chǎn)地加工、倉儲(chǔ)對(duì)藥材質(zhì)量的影響進(jìn)行了初步探索，并提供了一定的數(shù)據(jù)支持。

從表2中可以看出絕大部分樣品中五味子醇甲的含量均≥4mg/g，符合藥典要求，但是在遼寧、吉林、黑龍江各批次當(dāng)中各有1批、1批、2批藥材的五味子醇甲含量未達(dá)到藥典要求，對(duì)這4批藥材研究發(fā)現(xiàn)，藥材生產(chǎn)日期均明顯早于其它批次，藥材市場(chǎng)及飲片加工企業(yè)在五味子藥材儲(chǔ)藏過程中，出于成本的考慮，倉儲(chǔ)條件可能無法達(dá)到國家規(guī)定，隨著倉儲(chǔ)時(shí)間的延長，五味子藥材受溫度、濕度及蟲蛀的影響，藥材質(zhì)量會(huì)變差[6]，木脂素類成分含量會(huì)逐漸降低，因此應(yīng)當(dāng)避免使用放置時(shí)間過久的陳品，這也是醫(yī)院、藥房以及制藥企業(yè)采購五味子時(shí)需要特別關(guān)注的問題。

五味子是遼寧省的道地藥材，又稱“遼五味”，含量測(cè)定結(jié)果也在一定程度上說明了這一點(diǎn)，29批樣品中，總木脂素含量最高為13.98mg/g，產(chǎn)自遼寧，且遼寧各批次木脂素含量整體均較高，優(yōu)于吉林、黑龍江產(chǎn)區(qū)的五味子。此外從表4中可以看出，五味子醇甲雖然在5種木脂素類化合物中含量最高，但是另外幾種木脂素類成分的含量也較高，比如五味子醇乙、五味子乙素，其中五味子乙素具有顯著的生物活性，在臨床上應(yīng)用廣泛[7-8]。這說明單純以五味子醇甲的含量來評(píng)價(jià)五味子藥材及制劑的質(zhì)量有所欠缺，應(yīng)該嘗試以多種指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)，本實(shí)驗(yàn)為評(píng)價(jià)五味子中的木脂素類成分提供了一種快速、可靠、科學(xué)的檢測(cè)方法。

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（收稿日期：2018-07-05 編輯：程鵬飛）