天然藥物化學(xué)課程的NMR解析

尹田鵬 蔡樂 陳陽(yáng)

【摘 要】 以烏頭屬植物玉龍烏龍中分離得到的一個(gè)新的苯甲酰胺衍生物stapfianine B的核磁共振波譜（NMR）數(shù)據(jù)解析為例，講授本科藥學(xué)專業(yè)天然藥物化學(xué)的結(jié)構(gòu)研究章節(jié)。Stapfianine B結(jié)構(gòu)中包含苯環(huán)、酰胺、酯鍵和酚羥基等常見基團(tuán)，非常適合作為結(jié)構(gòu)研究的授課內(nèi)容。

【關(guān)鍵詞】 天然藥物化學(xué)；核磁共振波譜；stapfianine B；結(jié)構(gòu)解析

【中圖分類號(hào)】R-05 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A 【文章編號(hào)】1007-8517（2018）03-0120-07

Abstract：This paper describes the teaching of pharmaceutical undergraduates curriculum “medicinal chemistry of natural products” according to the nuclear magnetic resonance （NMR） analysis of stapfianine B， a new benzamide derivative isolated from Aconitum stapfianum. Stapfianine B possesses benzene， amide， ester and phenolic hydroxyl groups， and its NMR data are very suitable for NMR teaching.

Keywords：Medicinal Chemistry of Natural Products； NMR； Stapfianine B； Structural Identification and Characterization

1 引言

天然藥物化學(xué)是高等醫(yī)藥院校藥學(xué)及相關(guān)專業(yè)必修課程，主要講授天然藥物化學(xué)成分的理化性質(zhì)、提取分離及結(jié)構(gòu)鑒定，其中結(jié)構(gòu)鑒定是課程的重要內(nèi)容。目前，波譜學(xué)是天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)鑒定的主要方法，尤其核磁共振波譜法（NMR）提供的結(jié)構(gòu)信息豐富，譜圖可解析性高，已成為天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)鑒定的主要方法。天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)類型繁多，波譜特征復(fù)雜，而波譜解析抽象難懂，結(jié)構(gòu)鑒定一直是天然藥物化學(xué)的課程難點(diǎn)，是教師不斷探索的教學(xué)改革熱點(diǎn)[1-2]。許多醫(yī)學(xué)院校未設(shè)置專門的波譜解析課程，學(xué)生沒有系統(tǒng)學(xué)習(xí)波譜解析，難以理解與掌握天然產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)鑒定內(nèi)容。為讓學(xué)生更好地學(xué)習(xí)這門課程，作者在課程中加強(qiáng)了結(jié)構(gòu)鑒定的講授，尤其是以科研中遇到的真實(shí)化合物的NMR綜合解析為例，通過(guò)真實(shí)譜圖的清晰展示與講解，讓學(xué)生更直觀具體地理解與掌握相關(guān)知識(shí)，提高課程的實(shí)踐性[3]。文章介紹以玉龍烏頭（Aconitum stapfianum Hand.-Mazz.）中分離的新苯甲酰胺衍生物stapfianine B為例講解天然藥物化學(xué)的結(jié)構(gòu)研究章節(jié)[4]。Stapfianine B的結(jié)構(gòu)包含苯環(huán)、酰胺、酯鍵和酚羥基等常見基團(tuán)，波譜信號(hào)明顯且不復(fù)雜，非常適合作為授課內(nèi)容。

2 授課內(nèi)容與方式

2.1 1H-NMR

1H-NMR靈敏度高易測(cè)定，已應(yīng)用于化學(xué)中70余年，積累數(shù)據(jù)豐富，在結(jié)構(gòu)解析中非常重要。首先向?qū)W生簡(jiǎn)要介紹1H-NMR圖譜，講解氫譜提供的結(jié)構(gòu)信息（圖1）。氫譜橫坐標(biāo)為峰組位置，用化學(xué)位移（δ）表示標(biāo)注于峰組上方，右邊是高磁場(chǎng)（化學(xué)位移小），左邊是低磁場(chǎng)（化學(xué)位移大）?？v坐標(biāo)表示吸收峰強(qiáng)度，可積分得到譜線積分面積（氫的數(shù)目）標(biāo)注于峰組下方。1H-NMR譜中還可見峰組耦合裂分，提供耦合常數(shù)（J in Hz）及裂分信息。

2.1.1 峰面積 1H-NMR譜中氫的峰面積與相同化學(xué)環(huán)境的氫數(shù)目成正比。一般用甲基信號(hào)為標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算各組峰質(zhì)子數(shù)，如stapfianine B可用甲氧基信號(hào)（δH 3.95 s， 3H）為計(jì)算各峰組質(zhì)子數(shù)[5]。

2.1.2 化學(xué)位移 化學(xué)位移表征官能團(tuán)出峰位置，其數(shù)值大小取決于氫原子核外電子云密度，電子云密度越大化學(xué)位移值越小，譜峰越位于氫譜右方，反之亦然。任何使化學(xué)位移數(shù)值減小的作用稱為屏蔽效應(yīng)，使化學(xué)位移數(shù)值增大作用稱為去屏蔽效應(yīng)。學(xué)生應(yīng)掌握影響化學(xué)位移的主要因素：誘導(dǎo)效應(yīng)、共軛效應(yīng)、各向異性效應(yīng)、van der Waals效應(yīng)和氫鍵效應(yīng)。

①誘導(dǎo)效應(yīng)指電負(fù)性取代基使氫核外電子云密度降低，去屏蔽效應(yīng)增大，化學(xué)位移增大（吸收峰左移）。如甲基（RCH3）約δH 0.8，由于誘導(dǎo)效應(yīng)甲氧基低場(chǎng)位移至δH 3.2～4.0，stapfianine B中OCH3-7（δH 3.95 s）。此外應(yīng)向?qū)W生講解電負(fù)性取代帶來(lái)其他影響，如常見官能團(tuán)電負(fù)性均大于氫的，故一般而言δCH > δCH2>δCH3[6]。

②共軛效應(yīng)指苯環(huán)氫被含飽和雜原子基團(tuán)取代（如OCH3、OH），雜原子未成鍵電子對(duì)和苯環(huán)離域電子形成p-π共軛，苯環(huán)電子云密度增大，化學(xué)位移高場(chǎng)位移；被含不飽和雜原子基團(tuán)取代（如CHO、COR、NH=NR），形成大的π-π共軛，苯環(huán)電子云密度下降，化學(xué)位移低場(chǎng)位移。

Stapfianine B氫譜可見一個(gè)1，2，4-三取代苯環(huán)和一個(gè)1，2-二取代苯環(huán)信號(hào)，七個(gè)氫均位于芳環(huán)化學(xué)位移范圍內(nèi)（δH 6.5～8.0）。苯的化學(xué)位移為δH 7.27，受取代基影響取代苯環(huán)的氫產(chǎn)生低場(chǎng)或高場(chǎng)位移。Stapfianine B的B環(huán)中羰基-1′與苯環(huán)存在π-π共軛，導(dǎo)致苯環(huán)電子云密度降低，H-6′受影響最大，H-4′處在羰基對(duì)位，受到的去屏蔽作用次之，而H-5′和H-3′反而受到了一定屏蔽作用[7]?；诖耍瘜W(xué)位移應(yīng)該是H-6′ > H-4′ > H-5′/H-3′（圖2A）。另一方面，OH-2′氧孤對(duì)電子與苯環(huán)形成p-π共軛，導(dǎo)致電子云密度上升，對(duì)鄰位氫屏蔽作用最大，對(duì)位氫屏蔽其次，間位氫影響最小。因此化學(xué)位移應(yīng)該是H-6′/H-4′ > H-3′ > H-5′（圖2C）。綜合羰基和羥基影響，B環(huán)結(jié)果是H-6′ > H-4′ > H-5′ > H-3′。A環(huán)分析稍復(fù)雜些，因還受到NH影響，其屏蔽作用與OH相比稍弱。如圖1所示從羰基-1影響看，化學(xué)位移是H-6 > H-4 > H-3；從OH-5影響上看，化學(xué)位移為H-3 > H-4 > H-6；NH影響上看，化學(xué)位移是H-4 > H-6 > H-3。綜合羰基、羥基和氨基影響，結(jié)果為H-3 > H-6 > H-4。以上分析與圖譜吻合，這種講解可加深學(xué)生對(duì)共軛效應(yīng)的理解和記憶，教學(xué)效果良好。

③各向異性效應(yīng)指分子中基團(tuán)電子云非球形對(duì)稱時(shí)，將對(duì)鄰近質(zhì)子附加一個(gè)各向異性磁場(chǎng)，使某些質(zhì)子處于該基團(tuán)屏蔽區(qū)，產(chǎn)生高場(chǎng)位移，某些質(zhì)子處于去屏蔽區(qū)，產(chǎn)生低場(chǎng)位移。這里主要向?qū)W生介紹芳環(huán)、雙鍵、羰基、叁鍵的屏蔽區(qū)和去屏蔽區(qū)位置。

④van der Waals效應(yīng)指兩個(gè)質(zhì)子空間上靠近時(shí)，具有負(fù)電荷的電子云相互排斥，電子云密度減少，化學(xué)位移向低場(chǎng)位移，可舉典型例子講解。

⑤氫鍵效應(yīng)指形成分子內(nèi)氫鍵后，由于靜電場(chǎng)作用電子云密度降低而去屏蔽，化學(xué)位移增大。天然產(chǎn)物中δH 10～18羥基峰即為氫鍵效應(yīng)導(dǎo)致。如stapfianine B中OH-2′（δH 12.34 s）與酰胺鍵羰基形成氫鍵[8-9]。類似，NH也與甲酰基羰基形成氫鍵而產(chǎn)生低場(chǎng)效應(yīng)（δH 11.94 s）。

2.1.3 偶合裂分及耦合常數(shù) 耦合裂分是分子中鄰近磁性核之間自旋-自旋耦合作用引起，作用大小以偶合常數(shù)表示。解析氫譜耦合裂分現(xiàn)象對(duì)于確定分子中各類氫的相對(duì)位置和立體關(guān)系很有幫助?？梢罁?jù)n+1規(guī)律判斷：當(dāng)某組質(zhì)子有n個(gè)相鄰的質(zhì)子時(shí)，這組質(zhì)子將裂分為n+1重峰。耦合常數(shù)是氫譜重要數(shù)據(jù)，影響偶合常數(shù)因素主要有偶合核間的距離、角度及電子云密度[10]。Stapfianine B中氧甲基、酚羥基及酰胺氨基鄰位沒有氫取代，故為單峰（s）。A環(huán)中H-3與H-4發(fā)生J3偶合，故峰形為標(biāo)準(zhǔn)二重峰（d），苯環(huán)J3偶合常數(shù)一般約8.0 Hz（實(shí)際8.8 Hz）。H-6與H-4發(fā)生J4偶合，峰形也為d峰，J4偶合常數(shù)比較小，一般0～3 Hz（實(shí)際2.4 Hz）。H-4則除了與H-3發(fā)生J3偶合，還與H-6發(fā)生J4偶合，故峰形為雙二重峰（dd），偶合常數(shù)為8.8 Hz和2.4 Hz。B環(huán)是不同基團(tuán)的鄰位取代苯環(huán)，譜圖非常復(fù)雜。但因核磁儀器頻率不高，苯環(huán)氫化學(xué)位移差異小，可作一級(jí)譜近似分析。H-3′和H-6′鄰位只有1個(gè)氫，故裂分為d峰，H-4′和H-5′鄰位2個(gè)氫，故裂分為三重峰（t）。

2.2 13C-NMR和DEPT 13C-NMR靈敏度低于氫譜但分辨率更高（常用δH 0～15，δC 0～300），且碳原子是構(gòu)成有機(jī)物骨架的元素，13C-NMR可提供分子骨架信息，故在有機(jī)物結(jié)構(gòu)鑒定中作用極大。這里主要向?qū)W生介紹常用13C-NMR測(cè)定技術(shù)質(zhì)子寬帶去耦法和DEPT法進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析（圖3）。與氫譜類似碳譜橫坐標(biāo)是化學(xué)位移（δ），縱坐標(biāo)為吸收峰強(qiáng)度。采用去耦技術(shù)的碳譜只有譜線而不進(jìn)行積分。13C-NMR譜中每一個(gè)碳都出現(xiàn)一個(gè)信號(hào)，而DEPT 135°譜季碳消失，亞甲基向下，次甲基和甲基向上，DEPT 90°譜只有向上的次甲基。據(jù)此可判斷每個(gè)碳的級(jí)數(shù)，區(qū)分結(jié)構(gòu)中的季碳、次甲基、亞甲基和甲基。

Stapfianine B中15個(gè)碳均在13C NMR譜出現(xiàn)信號(hào)。13C-NMR譜中酯基和酰胺基的羰基化學(xué)位移在最低場(chǎng)，分別在δC 168.9 s和δC 168.8 s。氧甲基（δC 52.9 q）碳受到誘導(dǎo)效應(yīng)而產(chǎn)生明顯低場(chǎng)位移，一般RCH3約δC 15～30，OCH3則δC 45～60。苯的碳化學(xué)位移為δC 128，與氫類似受取代基影響化學(xué)位移在δC 120～160波動(dòng)。同樣對(duì)于選定的碳原子，其變化量是幾個(gè)取代基效應(yīng)之和。B環(huán)中C-2′因?yàn)殡娯?fù)性取代基的誘導(dǎo)效應(yīng)影響（OH-2），出現(xiàn)在δC 162.2。羥基取代使苯環(huán)其它碳原子高場(chǎng)位移，影響大小鄰位（C-1′/C-3′）>對(duì)位（C-5′）>間位（C-6′/C-4′），故化學(xué)位移為C-2 > C-4/C-6 > C-5 > C-1/C-3。羰基取代對(duì)苯環(huán)取代碳和其它碳影響都較小，僅使苯環(huán)碳略往低場(chǎng)移動(dòng)。結(jié)合羥基和羰基影響，B環(huán)化學(xué)位移為C-2 > C-4 > C-6 > C-5 > C-3 > C-1。A環(huán)和B環(huán)類似，但增加了氨基影響，其效應(yīng)與-OH一致。

2.3 二維核磁共振譜 2D NMR是有機(jī)物結(jié)構(gòu)鑒定的有力工具，尤其是對(duì)未知物的結(jié)構(gòu)的推導(dǎo)，比1D NMR能夠提供更多的信息，更為客觀、可靠。常用的2D NMR技術(shù)主要有1H-1H COSY、HMQC、HMBC和ROESY等，結(jié)合stapfianine B的圖譜向?qū)W生依次進(jìn)行介紹。

2.3.1 1H-1H COSY譜 1H-1H COSY是最常用的2D NMR譜，反映的同一個(gè)耦合體系中質(zhì)子的相關(guān)（3J），即相鄰兩個(gè)碳上的氫或同一個(gè)碳化學(xué)不等價(jià)的兩個(gè)氫的相關(guān)。在譜圖中可以看到stapfianine B的A環(huán)H-3/H-4的相關(guān)，B環(huán)H-3/H-4，H-4/H-5，H-5/H-6的相關(guān)（圖4）。這些相關(guān)驗(yàn)證了1D NMR對(duì)Stapfianine B結(jié)構(gòu)的推斷。

2.3.2 HSQC譜 HSQC譜反映的是1H和與其直接相連13C的相關(guān)。通過(guò)HSQC可建立碳譜和氫譜的關(guān)聯(lián)，實(shí)現(xiàn)氫原子往碳原子上的歸屬，對(duì)于推導(dǎo)未知物的結(jié)構(gòu)或已知結(jié)構(gòu)化合物的碳譜和氫譜的指認(rèn)十分重要。在譜圖中可以看到A環(huán)H-3/C-3，H-4/C-4、H-6/C-6的相關(guān)（圖5）；B環(huán)H-3/C-3，H-4/C-4，H-5/C-5，H-6/C-6的相關(guān)，通過(guò)這些相關(guān)可對(duì)stapfianine B的碳?xì)渥V數(shù)據(jù)進(jìn)行歸屬。氫譜中剩余無(wú)相關(guān)的峰組，則認(rèn)為是活潑氫（OH，NH）。

2.3.3 HMBC譜 HMBC譜反映的是1H和遠(yuǎn)程耦合的13C的相關(guān)，即關(guān)聯(lián)跨越2～4根化學(xué)鍵的1H和13C。HMBC譜比較復(fù)雜，解析困難，但對(duì)于推斷結(jié)構(gòu)極為重要。因?yàn)?H-1H COSY譜和HMQC譜在未知物的結(jié)構(gòu)推斷中，往往終止于季碳和雜原子，只能得到結(jié)構(gòu)片段，這些片段的連接只能依靠HMBC譜來(lái)完成。Stapfianine B的關(guān)鍵HMBC相關(guān)如圖6所示，H-3/C-2，屬于相隔2根化學(xué)鍵的相關(guān)，H-3/C-1，H-3/C-5是相隔3根化學(xué)鍵的相關(guān)，在HMBC譜中作用最大。H-6′與酰胺鍵羰基的相關(guān)正是Stapfianine B中兩個(gè)片段通過(guò)酰胺鍵連接的關(guān)鍵證據(jù)。H-6與甲?；驶嚓P(guān)是甲?；?1取代位置的關(guān)鍵證據(jù)。從這個(gè)圖譜可以讓學(xué)生清楚了解HMBC譜圖在結(jié)構(gòu)解析中的強(qiáng)大功能。

2.3.4 ROESY譜 ROESY譜反映的是兩個(gè)氫的空間距離，主要用于解決立體化學(xué)的問(wèn)題。譜中H-3/H-4，H-3′/H-4′，H-4′/H-5′，H-5′/H-6′的相關(guān)屬于鄰位氫相關(guān)，在結(jié)構(gòu)鑒定中意義不大（圖7）。H-6′/氨基的相關(guān)對(duì)于驗(yàn)證和確定B苯環(huán)的取代基位置有一定參考意義。

3 教學(xué)效果

天然藥物化學(xué)的結(jié)構(gòu)解析內(nèi)容抽象難懂，學(xué)生難以理解和掌握。教材著重于基礎(chǔ)理論而應(yīng)用性不強(qiáng)，學(xué)生往往掌握了課本知識(shí)遇到具體天然產(chǎn)物的NMR解析仍無(wú)從下手。通過(guò)科研中的原始天然產(chǎn)物真實(shí)譜圖的清晰展示和詳細(xì)講解，系統(tǒng)地向?qū)W生介紹核磁共振主要譜圖的功能。學(xué)生可以直觀、具體地接觸到核磁譜圖，從而更好地理解與掌握NMR的相關(guān)知識(shí)及其應(yīng)用。講解過(guò)程，學(xué)生可充分參與進(jìn)來(lái)，通過(guò)辨識(shí)譜峰（包括溶劑峰、雜質(zhì)峰），獲得化學(xué)位移和積分?jǐn)?shù)據(jù)，計(jì)算偶合常數(shù)，尋找二維相關(guān)等，使知識(shí)不再停留在理論，學(xué)生可獲得綜合運(yùn)用波譜進(jìn)行化合物結(jié)構(gòu)解析的能力，掌握天然化合物結(jié)構(gòu)解析的方法和步驟。這種教學(xué)方式有助于學(xué)生接受與理解教學(xué)內(nèi)容，讓學(xué)生深刻理解該課程的意義，并通過(guò)對(duì)課程的學(xué)習(xí)養(yǎng)成良好的科研素養(yǎng)，也提高了課程的實(shí)踐性，提高學(xué)生學(xué)習(xí)新知識(shí)的主動(dòng)性和積極性，為培養(yǎng)創(chuàng)新型、實(shí)踐型高素質(zhì)人才打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2017-12-12 編輯：鄧佳麗）