腎茶總黃酮的含量測(cè)定

陸應(yīng)彩 卯明霞 彭霞 姜明輝 王志杰

【摘 要】 目的： 制定腎茶中總黃酮的含量測(cè)定方法。方法：采用紫外分光光度法進(jìn)行了線性關(guān)系、準(zhǔn)確度、精密度、不同產(chǎn)地、不同部位以及試驗(yàn)條件的考察來建立腎茶中總黃酮的含量測(cè)定的方法，測(cè)定了9個(gè)不同產(chǎn)地22批腎茶中總黃酮的含量。結(jié)果：22批樣品總黃酮的含量分別為16.07%、17.58%、15.42%、14.04%、17.43%、15.75%、11.93%、19.71%、17.65%、16.20%、17.98%、24.39%、12.28%、15.70%、18.31%、17.19%、16.79%、10.38%、26.21%、30.66%、23.44%、14.00%； 5批不同部位總黃酮的含量按莖分別為：11.11%、11.74%、9.51%、12.59%、13.41%；按葉分別為26.57%、25.84%、20.07%、32.67%、35.07%，結(jié)果顯示不同產(chǎn)地及不同部位樣品中總黃酮的含量有差異。重復(fù)性實(shí)驗(yàn)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.060%，回收率為95.13%～100.01%，標(biāo)準(zhǔn)品蘆丁在2～48μg的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，r2 = 0.9998，符合要求。 結(jié)論：該方法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確，可作為檢驗(yàn)?zāi)I茶中總黃酮的含量的一種手段，適用于腎茶的日常分析和質(zhì)量控制。

【關(guān)鍵詞】 紫外分光光度法；腎茶；總黃酮；含量測(cè)定

【中圖分類號(hào)】R917 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號(hào)】1007-8517（2018）11-0037-05

Abstract：Objective To establish the method for content determination of total flavonoids in clerodendranthus spicatus. Method Method for the determination of the content of UV spectrophotometry was used for linearity， repeatability， precision and recovery rate， different areas， different parts and test conditions to establish the total flavonoids in Clerodendranthus， The content of total flavonoids from 9 different areas in 22 batches in Clerodendranthus.Results The content of total flavonoids in 22 batches of samples was 16.07%， 17.58%， 15.42%， 14.04%， 17.43%， 15.75%， 11.93%， 19.71%， 17.65%， 16.20%， 17.98%， 24.39%， 12.28%， 15.70% ， 18.31%， 17.19%， 16.79%， 10.38%， 26.21%， 30.66%， 23.44%， 14.00%； The contents of total flavonoids in 5 batches were： 11.11%， 11.74%， 9.51%， 12.59% and 13.41%， respectively. The leaves were 26.57%， 25.84%， 20.07%， 32.67% and 35.07%， respectively.showed that there are differences in content of total flavonoids in samples from different habitats and different parts of the. The relative standard deviation of repeatability experiment is 0.060%， and the recovery rate is 95.13% ～ 100.01%. The rutin standard is linear in the range of 2～48 μg， r2= 0.9998， which meets the requirements. Conclusion The method is simple， rapid and accurate， can be used as a means to test the content of total flavonoids in Clerodendranthus， suitable for routine analysis and quality control of c.spicatus.

Keywords：UV Spectrophotometry； Clerodendranthus Spicatus；Total Flavonoids； Content Determination

腎茶Clerodendranthus spicatus（Thunb.）C.Y.Wu又名貓須草，傣名“雅糯秒”，全草入藥，為傣醫(yī)常用藥，有清火解毒，利尿排石，涼血止血之功[1]。傣藥是四大民族醫(yī)藥之一，腎茶是傣醫(yī)臨床常用、療效確切、具有解毒特色的常用品種，已開發(fā)出一些傣藥產(chǎn)品如腎茶袋泡劑，取得了良好的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。腎茶含有橙黃酮、3′- 羥基-5，6，7，4′-四甲氧基黃酮、α-香樹素、、熊果酸、6-甲氧基芫花素、5-羥基- 7 ，3′，4′-三甲氧基黃酮、鼠尾草素、5- 羥基-6 ，7，3 ，4′-四甲氧基黃酮、澤蘭黃素、3′- 羥基- 5 ，7，8，4′- 四甲氧基黃酮、異橙黃酮、黃芪苷、異槲皮素、原兒茶醛、原兒茶酸、3，4 -二羥基苯酰甲醇 、迷迭香酸、迷迭香酸乙酯、秦皮乙素等化合物[2-5]，其中含有的甲氧基黃酮主要是橙黃酮、半齒澤蘭素、半齒澤蘭素-5-甲醚（結(jié)構(gòu)式見圖）。文獻(xiàn)報(bào)道[6-15]甲氧基黃酮類具有明顯的抗氧化、抗腫瘤、抗炎、免疫調(diào)節(jié)及保護(hù)心血管作用，被譽(yù)為“天然抗氧化劑”。腎茶的標(biāo)準(zhǔn)收載于《湖南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》（2009年版）、《廣西壯族自治區(qū)壯藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》（第二卷）（DYB45-GXZYCO111-2011），《云南省中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)》2005年版第一冊(cè)。目前，未見對(duì)腎茶飲片總黃酮含量測(cè)定的報(bào)道[16]，按《中國藥典》2015年版四部通則[17]建立腎茶總黃酮含量測(cè)定方法，為腎茶質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高及后期產(chǎn)品研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 UV-2550紫外可見光分光光度儀（島津）；101-EBS電熱鼓風(fēng)干燥箱（北京市永光明醫(yī)療儀器廠）； DZKW-D-6 DIAN水浴鍋（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司）； BL310天平（德國賽多利斯集團(tuán)）；AE200電子天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）。

1.2 材料 蘆丁對(duì)照品（批號(hào)：100080-201610，中國食品藥品檢定研究院）。無水乙醇（分析純）、氫氧化鈉（優(yōu)級(jí)純）、亞硝酸鈉（分析純）、硝酸鋁（分析純）均為天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司生產(chǎn)，水為蒸餾水。不同產(chǎn)地的22批藥材分別采自云南景洪市、云南勐?？h、云南勐臘縣、云南普洱市、海南、云南瑞麗、云南元江、福建廈門、廣西南寧。由西雙版納州食品藥品檢驗(yàn)所彭霞主任藥師鑒定為唇形科植物腎茶 Clerodendranthus spicatus （Thunberg） C. Y. Wu ex H. W. Li 的干燥地上部分。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取蘆丁對(duì)照品25 mg，置50 mL量瓶中，加乙醇適量，超聲處理使溶解，放冷，加乙醇至刻度，搖勻。精密量取20 mL，置50 mL量瓶中，加水至刻度，搖勻，即得（每1 mL中含蘆丁0.2 mg ）。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密量取對(duì)照品溶l、2、3、4、5、6 mL，分別置25 mL量瓶中，各加水至6 mL，加5%亞硝酸鈉溶液1 mL，搖勻，放置6 min，加10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，放置6分鐘，加氫氧化鈉試液10 mL，再加水至刻度，搖勻，放置15 min，以相應(yīng)試劑為空白，按照紫外-可見分光光度法（通則0401），在500 nm的波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.3 測(cè)定法 取本品粉末約0.12 g，置具塞三角瓶中，精密稱定，加入50%乙醇溶液100 mL，精密稱定，置85℃水浴上回流1 h，放冷，精密稱定，用50%乙醇溶液補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液10 mL，置25 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，精密量取5 mL，置25 mL量瓶中，照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項(xiàng)下的方法，自“加水至6 mL”起依法測(cè)定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中蘆丁的重量。按干燥品計(jì)算，含總黃酮以蘆?。–27H30O16） 計(jì)的量。

2.4 吸收光譜的測(cè)定、光譜一致性檢測(cè) 精密吸取蘆丁對(duì)照品溶液、供試品溶液各4 mL，分別置25 mL量瓶中，照分光光度法，在200～750 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)測(cè)定吸收光譜，結(jié)果蘆丁對(duì)照品與供試品光譜吸收?qǐng)D譜基本一致，在500 nm波長(zhǎng)處有最大吸收。參照腎茶膠囊中總黃酮的含量測(cè)定[18]及《中國藥典》（2015年版一部）[19]收載 “山楂葉”中總黃酮的含量測(cè)定方法中蘆丁的測(cè)定波長(zhǎng)為500 nm，因此選取檢測(cè)波長(zhǎng)為500 nm。

2.5 線性關(guān)系考察 精密吸取蘆丁對(duì)照品溶液0.25、0.50、0.75、1、2、3、4、5、6 mL（相當(dāng)于蘆丁1.98090、3.96180、5.94270、7.92360、15.84719、23.77079、31.69439、39.61798、47.54158 μg/mL），按上述測(cè)定法測(cè)定吸收度，以吸收度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo) ，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得回歸方程：Y= 0.01229X-0.00251，r2=0.9998，試驗(yàn)結(jié)果表明蘆丁在2～48μg/mL范圍內(nèi)的線性關(guān)系良好。

2.6 精密度試驗(yàn) 取同一批號(hào)樣品6份（產(chǎn)地：西雙版納勐臘縣勐滿農(nóng)場(chǎng)，批號(hào)：1612312），按供試品測(cè)定方法測(cè)定，總黃酮平均含量為17.3%，RSD為0.78%。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 精密量取2.1項(xiàng)下對(duì)照品溶液（31.69439μg/mL），按“2.3”項(xiàng)下方法操作，依次測(cè)定7次，以吸收度值計(jì)算RSD為0.060%，結(jié)果符合要求。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 根據(jù)《中國藥典》2015版四部（通則9101），藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則中準(zhǔn)確度相關(guān)規(guī)定，設(shè)計(jì)同一濃度，9份供試品溶液照2.3方法進(jìn)行測(cè)定，用9個(gè)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)。該分析方法的回收率為95.13%～100.01%，且RSD為1.58%，結(jié)果符合要求。表明該法準(zhǔn)確可靠，可用于腎茶總黃酮含量測(cè)定。

2.9 樣品測(cè)定 取不同產(chǎn)地22批腎茶，按照上述方法制備供試品溶液，分別測(cè)定22批樣品，按2.2確定的工作曲線，以干燥品計(jì)算總黃酮含量，結(jié)果見表1。由表2可得，F(xiàn)=5030.293>F0.01（21，22）=2.74，即說明不同產(chǎn)地腎茶中總黃酮的含量差異極顯著。

2.10 樣品不同部位測(cè)定 按照上述方法，分別測(cè)定了5批樣品的莖和葉總黃酮的含量，按干燥品計(jì)算，結(jié)果見表3。由表4可得，F(xiàn)=28390.505> F0.01（9，10）=4.95，即說明不同地區(qū)腎茶不同部位總黃酮的含量差異極顯著。

3 討論

3.1 試驗(yàn)條件的考察 試驗(yàn)采用分光光度法以蘆丁為對(duì)照品，以相應(yīng)的試劑為空白，分別考察溶劑：甲醇、70%甲醇、50%甲醇、乙醇、70%乙醇、50%乙醇；提取方式：回流提?。ㄌ崛r(shí)間分別為60 min、120 min、180 min；回流溫度分別為75 ℃、85 ℃、95 ℃）；超聲處理（超聲時(shí)間分別為30 min、45 min、60 min）、振搖提?。ㄕ駬u時(shí)間為120 min溫度為65 ℃）、取樣量（0.12 g、0.25 g、0.50 g）制備的供試品溶液，在500 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算總黃酮的含量。結(jié)果表明，取樣量為0.12 g，50%乙醇為溶劑85 ℃回流提取，腎茶中總黃酮的溶出量最大，回流時(shí)間60 min、120 min、180 min腎茶中總黃酮的溶出量變化不大，選擇取樣量為0.12 g，以50%乙醇為溶劑，提取溫度為85 ℃回流60 min制備供試品溶液。

3.2 單因素方差分析 目的是通過分析各樣本之間的差異，來檢驗(yàn)各樣本總體效應(yīng)之間的差異，從而確定該因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果是否有顯著性影響。由表2可得，F(xiàn)=5030.293>F0.01（21，22）=2.74，即說明不同產(chǎn)地腎茶中總黃酮的含量差異極顯著。由表4可得，F(xiàn)=28390.505>F 0.01（9，10）=4.95，即說明不同地區(qū)腎茶不同部位總黃酮的含量差異極顯著。

腎茶含有的甲氧基黃酮類，藥理研究表明[6-15]具有明顯的抗氧化、抗腫瘤、抗炎、免疫調(diào)節(jié)及保護(hù)心血管作用，腎茶為西雙版納傣族自治州的傣族常用藥物，平時(shí)代茶飲，用于治療腎炎、腎結(jié)石等疾病，深入研究其質(zhì)量控制方法顯得尤為重要。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示不同產(chǎn)地腎茶總黃酮含量差異極顯著，不同部位（莖、葉）總黃酮含量差異極顯著。本研究建立了分光光度法法測(cè)定腎茶中總黃酮的含量，此方法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確，經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，可作為檢驗(yàn)?zāi)I茶中總黃酮的含量的一種手段，為腎茶藥材的進(jìn)一步研究提供方法依據(jù)。

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