HPLC法同時(shí)測(cè)定養(yǎng)心氏片中9個(gè)指標(biāo)性成分

陳俊 徐圣弢 呂磊 呂昉 周燕妮

【摘 要】 目的：采用高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定養(yǎng)心氏片中葛根素、大豆苷、丹參素、蘆丁、延胡索乙素、淫羊藿苷、芹菜素、人參皂苷Rd、阿魏酸9個(gè)成分的含量。方法：采用Agilent Plus-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm， 5μm），檢測(cè)波長(zhǎng)：阿魏酸采用310 nm，其余8種成分采用254 nm，流動(dòng)相為乙腈（A）和0.1%甲酸水（B），A相隨時(shí)間的變化：5%～40%（0～35 min），40%（35～45 min）；流速1 mL/min；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量5 μL。結(jié)果：9個(gè)指標(biāo)性成分葛根素、大豆苷、丹參素、蘆丁、延胡索乙素、淫羊藿苷、芹菜素、人參皂苷Rd、阿魏酸，在35 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)完全分離，線性良好（r>0.9990）。方法學(xué)驗(yàn)證表明，日內(nèi)日間精密度RSD<5%，加樣回收率范圍為98.91%～102.74%。結(jié)論：該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、實(shí)用性強(qiáng)，可用于養(yǎng)心氏片的質(zhì)量控制。

【關(guān)鍵詞】 養(yǎng)心氏片；高效液相色譜法；含量測(cè)定

【中圖分類號(hào)】R284.1 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號(hào)】1007-8517（2018）06-0028-04

Abstract：Objective To determine the contents of nine marker components， including puerarin， daidzin， tanshinol， rutin， tetrahydropalmatine， icariin， apigenin， ginsenoside-Rd， ferulic acid in Yangxinsihi Tablet by high performance liquid chromatography（HPLC）. Methods The HPLC condition was as follows： column： Agilent Plus-C18 （250 mm×4.6 mm， 5 μm）； The detective wavelength was set at 310nm for ferulic acid， and 254 nm for the other eight components. Mobile phase： A was ACN， B was 0.1% formic acid aqueous solution， the gradient of A phase： 5%～40%（0～35min）， 40%（35～45min）； flow rate： 1mL/min； temperature of column： 25℃； injection volume：5μL.Results Nine marker components， including puerarin， daidzin， tanshinol， rutin， tetrahydropalmatine， icariin， apigenin， ginsenoside-Rd， ferulic acid， were separated at baseline within 35 min with good linear （r>0.9990）. The result of intra-day and inter-day precisions were at normal range （RSD<5%）. Range of the recovery was between 98.91% and 102.74%.Conclusion The method is rapid， simple，accurate which can be used to control the quality of Yangxingshi Tablet.

Keywords：Yangxinsihi Tablet； HPLC； Determination

養(yǎng)心氏片是由十三味中藥組成的復(fù)方制劑，處方包含黃芪、淫羊藿、黃連、炙甘草、黨參、山楂、醋延胡索、丹參、地黃、靈芝、葛根、當(dāng)歸和人參。具有扶正固本、益氣活血、行脈止痛的功效，常用于氣虛血瘀型冠心病、心絞痛、心肌梗塞及合并高血脂、高血糖等癥[1-2]。養(yǎng)心氏片所含的活性成分如黃酮類成分葛根素、大豆苷、蘆丁、芹菜素均有明顯的擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈，保護(hù)心肌缺氧性損傷的作用[3]；生物堿類成分延胡索乙素有鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛的作用[4]；酚酸類成分丹參素有活血化瘀的功效[5]。

目前養(yǎng)心氏片的研究多為臨床應(yīng)用方面的報(bào)道，與含量測(cè)定相關(guān)的研究多為其中單個(gè)成分的測(cè)定，如黃芪甲苷和葛根素的測(cè)定[6-9]，2015版《中國藥典》含量測(cè)定項(xiàng)下僅有黃芪甲苷的HPLC測(cè)定。單個(gè)成分的測(cè)定作為養(yǎng)心氏片的質(zhì)量控制不夠全面。而由于組分復(fù)雜，同時(shí)測(cè)定其中的黃酮類、生物堿和酚酸類難度較大，目前亦未見相關(guān)報(bào)道。本研究采用高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定了養(yǎng)心氏片中9個(gè)指標(biāo)性成分，方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，為養(yǎng)心氏片的質(zhì)量控制及后期的作用機(jī)制研究提供基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Agilent 1100高效液相色譜儀（含G1379A真空脫氣機(jī)、G1311A四元泵、G1367A自動(dòng)進(jìn)樣器、G1316A柱溫箱、G1315B DAD檢測(cè)器，美國安捷倫公司）；KUDOS- SK2200H超聲發(fā)生器（上?？茖?dǎo)超聲儀器公司）；METTLER AE240型十萬分之一電子天平（德國梅特勒公司）。

1.2 材料 葛根素（批號(hào)：110752-201615）、大豆苷（批號(hào)：111738-201603）、丹參素（批號(hào)：110855-201614）、蘆?。ㄅ?hào)：100080-201610）、延胡索乙素（批號(hào)：110726-201618）、淫羊藿苷（批號(hào)：110737-201516）、芹菜素（批號(hào)：111901-201603）、人參皂苷Rd（批號(hào)：111818-201603）、阿魏酸（批號(hào)：110773-201614）購自中國食品藥品檢定研究院（純度>98%）；養(yǎng)心氏片（批號(hào)：150406，上海醫(yī)藥集團(tuán)青島國風(fēng)藥業(yè)股份有限公司）；色譜級(jí)甲醇購自Burdick&Jackson;公司，色譜級(jí)乙腈購自Merck公司，色譜級(jí)甲酸購自Fluka公司，水為純化水，其余試劑為分析純。

2 方法和結(jié)果

2.1 溶液的配制

2.1.1 對(duì)照品溶液 如表1所示，精密稱取如下樣品于2 mL 量瓶中，加入2 mL甲醇定容，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液，存于4 ℃冰箱，待用。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制 精密吸取上述對(duì)照品儲(chǔ)備溶液各500 μL到10 mL 量瓶中，用甲醇定容，混勻，按照1∶2∶4∶8∶16∶32比例逐級(jí)稀釋，制得標(biāo)曲溶液。

2.1.3 樣品溶液的制備 取2片養(yǎng)心氏片樣品，剝除包衣放進(jìn)研缽碾碎，精密稱取1g置25mL量瓶中，加甲醇定容，超聲30 min，補(bǔ)足失重，過0.22 μm微孔濾膜，制得樣品溶液。

2.2 色譜條件 色譜柱：Agilent Plus-C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流速：1.0 mL/min；流動(dòng)相：A乙腈- B水（含0.1%甲酸），A相隨時(shí)間的變化：5%～40%（0～35 min），40%（35～45 min）；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm、310 nm；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：5 μL；分析時(shí)間：35 min；柱后平衡時(shí)間：10 min。混合對(duì)照品、養(yǎng)心氏片樣品的HPLC色譜圖如圖1所示。

2.3 線性關(guān)系考察 養(yǎng)心氏片中各化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍及相關(guān)系數(shù)見表2。

2.4 精密度試驗(yàn) 取2.1.1項(xiàng)下制備的系列混合對(duì)照品溶液，在1 d內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣6次以及連續(xù)3d每天進(jìn)樣3次，根據(jù)所得峰面積分別考察日內(nèi)和日間精密度。結(jié)果9個(gè)指標(biāo)性成分的日內(nèi)、日間精密度RSD均小于5%，表明該方法的精密度良好。

2.5 定量限和檢測(cè)線考察 將9個(gè)對(duì)照品溶液依次進(jìn)行稀釋，以信噪比10∶1時(shí)，確定其最低定量限；以信噪比3：1時(shí)，確定其最低檢測(cè)限。9個(gè)指標(biāo)性成分的最低定量限分別為5.00、5.50、8.50、8.00、6.25、8.00、5.50、6.00、5.00μg/mL；最低檢測(cè)限分別為2.50、2.75、4.25、4.00、3.13、4.00、2.25、3.00、2.50μg/mL。

2.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取制備的養(yǎng)心氏片樣品溶液，分別在0、2、4、6、8、12、24 h測(cè)定9個(gè)成分的峰面積，考察其穩(wěn)定性。結(jié)果9個(gè)成分峰面積的RSD分別為2.25%、1.23%、3.84%、4.26%、1.02%、2.52%、1.37%、1.28%、4.63%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批次養(yǎng)心氏片1g，共6份，按2.1.3項(xiàng)下方法，分別制成樣品溶液進(jìn)樣分析。結(jié)果，養(yǎng)心氏片中9個(gè)成分含量的RSD均小于5%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取同一批次養(yǎng)心氏片0.5 g，共6份，分別加入對(duì)照品一定量 （樣品中各成分含量的100%），按2.1.3項(xiàng)下方法制備，進(jìn)樣分析，計(jì)算回收率。9個(gè)成分的加樣回收率和RSD（n=6）分別為101.42%（RSD=1.48%）、102.74%（RSD=3.87%）、98.91%（RSD=1.67%）、199.35%（RSD=2.58%）、99.27%（RSD=3.27%）、98.59%（RSD=2.73%）、100.32%（RSD=3.42%）、102.53%（RSD=1.17%）、100.41%（RSD=3.63%），回收率結(jié)果良好。

2.9 樣品測(cè)定 養(yǎng)心氏片中各化合物的含量通過線性方程計(jì)算。見表3。

3 討論

在色譜柱的選擇上，考慮到待測(cè)成分較多，極性差別大，為了提高分離度，選用了250 mm長(zhǎng)柱進(jìn)行分析。由于同時(shí)測(cè)定組分較多，未能保證所有峰分離度均>1.5，其中葛根素和蘆丁分離度>1.2，考慮到兩者含量較高，為指標(biāo)性成分，納入了測(cè)定項(xiàng)，后期考慮用MS法準(zhǔn)確定量。

在流動(dòng)相的選擇上，因各成分的參考流動(dòng)相比例不同，采用了乙腈-水體系，梯度洗脫，從結(jié)果看，各成分可同時(shí)檢測(cè)，分離度良好。在水相中加入甲酸可以防止葛根素、丹參素等成分出現(xiàn)拖尾峰，還可以抑制樣品解離[10]。在檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇上，由于各成分的最大吸收波長(zhǎng)各不相同，為了統(tǒng)一測(cè)定條件，并考慮到阿魏酸的特征吸收，同時(shí)選擇了254 nm和310 nm兩個(gè)波長(zhǎng)，其中310 nm測(cè)定阿魏酸，254 nm測(cè)定其余8個(gè)成分。

由樣品測(cè)定結(jié)果可見，養(yǎng)心氏片中多個(gè)活性成分含量穩(wěn)定，其中治療氣虛血瘀的藥如丹參、人參和葛根中所含的丹參素、人參皂苷Rd、葛根素的含量較高，符合本制劑的組方特點(diǎn)。本研究可同時(shí)測(cè)定養(yǎng)心氏片9個(gè)指標(biāo)性成分的含量，方法簡(jiǎn)單，穩(wěn)定可靠，可用于養(yǎng)心氏片的質(zhì)量控制。

參考文獻(xiàn)

[1]嚴(yán)冬， 錢玉良，唐蜀華. 養(yǎng)心氏片治療氣虛血瘀型冠心病心律失常療效觀察[J]. 南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)， 2006， 22（5）： 323-325.

[2]崔燕， 張輝，莊婕. 養(yǎng)心氏片治療心絞痛及冠心病臨床試驗(yàn)資料研究[J]. 食品與藥品， 2013， 15（4）： 293-295.

[3]高翠英， 仇同革. 養(yǎng)心氏片對(duì)冠心病治療效果的觀察[J]. 實(shí)用心腦肺血管病雜志， 2010， 18（12）： 1801-1802.

[4]張?chǎng)? 養(yǎng)心氏片長(zhǎng)期治療慢性穩(wěn)定型心絞痛（氣虛血瘀證）的臨床研究[D].濟(jì)南：山東中醫(yī)藥大學(xué)， 2014.

[5]張為. 養(yǎng)心氏片治療冠心病慢性心力衰竭氣虛血瘀證的臨床研究[D].北京：北京中醫(yī)藥大學(xué)， 2007.

[6]張臨通. 養(yǎng)心氏膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].北京：中醫(yī)研究， 2008， 21（9）： 20-24.

[7]楊雪萍，袁紅英，孫昕，等. HPLC法測(cè)定養(yǎng)心氏片中葛根素的含量[J]. 實(shí)用醫(yī)藥雜志， 2010， 27（9）： 810-811.

[8]張春輝， 吳愛英，楊曉云. 薄層掃描法測(cè)定養(yǎng)心氏片中黃芪甲苷的含量[J]. 中國醫(yī)院藥學(xué)雜志， 2002， 22（2）： 91-92.

[9]孫忠敏. HPLC-ELSD法測(cè)定養(yǎng)心氏片中黃芪甲苷的含量[J]. 海峽藥學(xué)， 2005， 17（4）： 75-76.

[10]王靜， 徐艷紅. 偽品養(yǎng)心氏片鑒別[J]. 時(shí)珍國醫(yī)國藥， 2000， 11（5）： 418-419.