響應(yīng)面法優(yōu)化彈簧糊精的酶解制備工藝

閔丹丹， 徐學(xué)明， 焦愛權(quán)， 潘小衛(wèi)， 金征宇

（食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)，江蘇 無錫 214122）

彈簧糊精是由葡萄糖單元由α-（1→4）糖苷鍵連接而成的線性，多分散性的多糖，因其柔性螺旋結(jié)構(gòu)像彈簧一樣具有可逆的拉伸和松弛特性而得名[1]。彈簧糊精的特殊結(jié)構(gòu)，使其在淀粉抗老化，包埋活性物質(zhì)以及手性分離方面展現(xiàn)了廣闊的應(yīng)用前景[1～5]。

彈簧糊精的制備方法主要有酶法合成和酶法分解。酶法合成反應(yīng)成本高，反應(yīng)工藝復(fù)雜，難以進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)。2012年，徐等[6]采用α-淀粉酶酶解直鏈淀粉制備彈簧糊精，在制備過程中，需要對(duì)支鏈淀粉和直鏈淀粉進(jìn)行分離，這使得加工過程變得繁瑣。并且由于α-淀粉酶作用位點(diǎn)隨機(jī)，產(chǎn)物聚合度分布廣，且產(chǎn)率較低。

Tokuya等[7]使用凝膠排阻層析法分析普魯蘭酶對(duì)支鏈淀粉的剪切方式，發(fā)現(xiàn)普魯蘭酶首先是從外側(cè)水解支鏈淀粉，而普魯蘭酶水解物中只有聚合態(tài)支鏈淀粉和線性葡聚糖，即彈簧糊精。并且，普魯蘭酶專一水解α-（1→6）糖苷鍵。采用普魯蘭酶制備彈簧糊精的反應(yīng)過程容易控制，產(chǎn)物聚合度較為集中。由于蠟質(zhì)玉米淀粉幾乎全部為支鏈淀粉，直鏈淀粉很少，選其為原料，可以省去繁瑣的分離步驟。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蠟質(zhì)玉米淀粉：杭州普羅星淀粉有限公司產(chǎn)品；普魯蘭酶（1 000 U/mL）：諾維信（中國）生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；配有多角度激光光散射儀檢測器和示差檢測器的凝膠色譜系統(tǒng)（HPSEC-MALLS-RI檢測系統(tǒng)）：美國Wyatt公司產(chǎn)品；DHG-9123A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海柏欣儀器設(shè)備廠產(chǎn)品；Dionex ICS-5000高效陰離子交換色譜系統(tǒng) （HPAECPAD）：美國戴安公司產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 彈簧糊精的制備 準(zhǔn)確稱取5 g蠟質(zhì)玉米淀粉，加入90 mL去離子水，在沸水浴中攪拌15 min，使其預(yù)糊化，再于121℃條件下高壓處理15 min，使其徹底糊化，冷卻至室溫后，加入5 mL一定pH值的醋酸鈉緩沖溶液，再加入一定體積的普魯蘭酶，然后放入一定溫度的水浴鍋中震蕩一段時(shí)間；將完成上述酶解反應(yīng)的溶液煮沸，冷卻后在離心機(jī)中以5 000 r/min的速度離心10 min，除去變性酶，取上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后60℃度烘干，即得彈簧糊精粗品。

1.2.2 彈簧糊精相對(duì)分子質(zhì)量信息的測定 使用HPSEC-MALLS-RI檢測系統(tǒng)對(duì)彈簧糊精樣品的平均相對(duì)分子質(zhì)量和相對(duì)分子質(zhì)量分布進(jìn)行測定[8]。流動(dòng)相為0.3 mol/L NaNO3溶液 （含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.02%的NaN3），經(jīng)0.45 μm的濾膜過濾后，超聲 30 min；流動(dòng)相流量0.5 mL/min，流動(dòng)相折光指數(shù)為1.331，進(jìn)樣量 200 μL，柱溫 50 ℃，折光指數(shù)增量（dn/dc）為0.147。采用Astra軟件對(duì)激光散射信號(hào)和示差折光檢測器信號(hào)進(jìn)行采集、分析和計(jì)算。

取25～30 mg彈簧糊精粗品，溶解于3 mL流動(dòng)相溶液中，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后進(jìn)樣。

1.2.3 彈簧糊精聚合度分布的測定 使用配有ED-40型脈沖電流檢測器的高效陰離子交換色譜（HPAEC-PAD）對(duì)彈簧糊精的鏈長分布進(jìn)行檢測[9-10]。色譜柱型號(hào)為戴安CarboPAC PA200。流動(dòng)相：100 mmol/L NaOH（A），100 mmol/L NaOH+600 mmol/L NaAC（B）。采用線性梯度洗脫：0 min時(shí)為體積分?jǐn)?shù)20%的洗脫液B，在60 min時(shí)為體積分?jǐn)?shù)100%的洗脫液B。流量為1 mL/min，進(jìn)樣量25 μL。將彈簧糊精溶于去離子水后加熱溶解，配成3 mg/mL的溶液，過0.25 μm的濾膜后進(jìn)樣。

1.2.4 彈簧糊精純度的計(jì)算 圖1為使用HPSECMALLS-RI檢測系統(tǒng)所測出的普魯蘭酶酶解蠟質(zhì)玉米淀粉不同時(shí)間所得到的酶解產(chǎn)物的相對(duì)分子質(zhì)量分布。peak1和peak2是普魯蘭酶酶解蠟質(zhì)玉米淀粉所得線性葡聚糖（即彈簧糊精）的相對(duì)分子質(zhì)量分布（1 200～18 000），此結(jié)果與 Cai等[11]使用異淀粉酶酶解蠟質(zhì)玉米淀粉所得線性葡聚糖的相對(duì)分子質(zhì)量分布相近，peak3代表未被徹底酶解的聚合態(tài)支鏈淀粉。

式中：S1為peak1的面積；S2為peak2的面積；S3為peak3的面積。

圖1 普魯蘭酶酶解蠟質(zhì)玉米淀粉不同時(shí)間所得產(chǎn)物的相對(duì)分子質(zhì)量分布Fig.1 Mw distribution of products from waxy corn starch debranched by pullulanase at different times

1.2.5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)，以彈簧糊精純度（Y）為響應(yīng)值，對(duì)溫度、pH、時(shí)間、酶用量進(jìn)行優(yōu)化，因素水平表見表1。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 采用Design-Expert v8.0.6.1軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理、分析，采用Origin 8.5軟件進(jìn)行繪圖。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平表Table 1 Coded values of the variables for the Box-Behnken design

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 溫度對(duì)彈簧糊精純度的影響 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)，設(shè)定pH為5.1，酶添加量400 U/g，酶解時(shí)間5 h，研究溫度分別為 45、50、55、60、65 ℃時(shí)， 溫度對(duì)彈簧糊精純度的影響，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，當(dāng)溫度在45～55℃之間時(shí)，彈簧糊精的純度隨著溫度的升高而增加。這主要是在溫度低于55℃時(shí)，普魯蘭酶的活性隨著溫度的升高而逐漸增強(qiáng)，反應(yīng)速度逐漸加快。當(dāng)溫度繼續(xù)升高時(shí)，普魯蘭酶部分失活，彈簧糊精的純度會(huì)有所下降。溫度在50～60℃之間時(shí)，彈簧糊精的純度均較高；溫度為55℃時(shí)，彈簧糊精的純度最高。所以50～60℃為普魯蘭酶作用的適宜溫度范圍，選則55℃作為最適反應(yīng)溫度。

圖2 溫度對(duì)彈簧糊精純度的影響Fig.2 Effect of temperature on purity of spring dextrin

2.1.2 pH對(duì)彈簧糊精純度的影響 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)，設(shè)定溫度為55℃，酶添加量400 U/g，酶解時(shí)間5 h，研究 pH 分別為 4.3、4.7、5.1、5.5、5.9 時(shí)，pH 對(duì)彈簧糊精純度的影響，結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知，當(dāng)pH小于4.7時(shí)，彈簧糊精的純度會(huì)隨著pH的提高而顯著增加；當(dāng)pH高于5.1時(shí)，彈簧糊精的純度呈下降趨勢。這說明普魯蘭酶的活性會(huì)受到pH的顯著影響；普魯蘭酶在pH4.7～5.1時(shí)，能快速水解α-（1→6）糖苷鍵，產(chǎn)生較多的彈簧糊精。在pH 5.1時(shí)，彈簧糊精的純度最高，故選擇pH 5.1為最適反應(yīng)pH。

圖3 pH對(duì)彈簧糊精純度的影響Fig.3 Effect of pH on the purity of spring dextrin

2.1.3 酶用量對(duì)彈簧糊精純度的影響 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)，設(shè)定溫度為55℃，pH 5.1，酶解時(shí)間5 h，研究酶用量分別為 50、200、300、400、500、600 U/g 時(shí)，酶用量對(duì)彈簧糊精純度的影響，結(jié)果如圖4所示。

由圖4可知，當(dāng)酶用量小于300 U/g時(shí)，隨著酶添加量的增加，彈簧糊精的純度逐漸增加，兩者呈線性關(guān)系。這說明底物未被酶所飽和，反應(yīng)速度主要取決于酶添加量。當(dāng)酶用量大于400 U/g時(shí)，彈簧糊精的純度隨酶用量的增加而增長緩慢，從經(jīng)濟(jì)角度和彈簧糊精純度綜合考慮，作者選擇的最佳酶用量為400 U/g。

圖4 酶用量對(duì)彈簧糊精純度的影響Fig.4 Effect of enzyme concentration on the purity of spring dextrin

2.1.4 時(shí)間對(duì)彈簧糊精純度的影響 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)，設(shè)定溫度為55℃，pH 5.1，酶用量 400 U/g，研究酶解時(shí)間分別為 1、2、3、4、5、6 h 時(shí)，酶解時(shí)間對(duì)彈簧糊精純度的影響，結(jié)果如圖5所示。

由圖5可知，時(shí)間在5 h前，彈簧糊精的純度隨著時(shí)間的延長呈增加趨勢；當(dāng)時(shí)間繼續(xù)延長，彈簧糊精的純度增長緩慢，基本趨于穩(wěn)定。這是因?yàn)橹ф湹矸劬哂胁煌L度的支鏈，普魯蘭酶能較快地水解以α-（1→6）糖苷鍵連接的短鏈葡聚糖；隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，普魯蘭酶只能以極慢的速度水解還未被水解的長鏈葡聚糖[12]。因此，作者選擇5 h為最佳酶解時(shí)間。

圖5 時(shí)間對(duì)彈簧糊精純度的影響Fig.5 Effect of time on the purity of spring dextrin

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)

2.2.1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表2所示。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

續(xù)表2

2.2.2 響應(yīng)面模型的選擇 由表3知，一階線性模型和二因素交互關(guān)系模型的失擬項(xiàng)P值均小于0.01，為極顯著，表示這兩個(gè)模型出現(xiàn)失誤的概率比較大，不適宜進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合；二階模型和三階模型的失擬項(xiàng)P值都大于0.05，但是三階模型的序變模型P值大于0.05，為不顯著，說明采用三階模型容易出現(xiàn)混雜的模型[13]。二階模型的R2=0.908 8，表示該模型能夠解釋90.88%的總變異，僅有9.12%的變異無法用該模型解釋[14]。綜上所述，采用二次模型進(jìn)行彈簧糊精制備預(yù)測是切實(shí)可行的。

表3 模型擬合概要Table 3 Model fit summary

2.2.3 二次模型建立與顯著性檢驗(yàn) 對(duì)表2結(jié)果進(jìn)行回歸分析，擬合的溫度（X1）、時(shí)間（X2）、酶用量（X3）、pH（X4）對(duì)彈簧糊精純度（Y）影響的二次回歸方程為：

響應(yīng)值二次模型的方差分析及顯著性如表4所示。由表4可以看出，模型P＜0.000 1，模型達(dá)到極顯著。失擬項(xiàng)P=0.050 5＞0.05不顯著，因此該二次模型擬合度良好。

其中一次項(xiàng)X1、X3、X4均顯著，X2不顯著； 二次項(xiàng)X1、X3、X4顯著，其他不顯著，交互項(xiàng)X1X4和X2X3顯著，所以得出影響彈簧糊精純度的因素依次：pH值＞酶用量＞溫度＞時(shí)間。

通過分析計(jì)算得到酶法制備彈簧糊精的最優(yōu)條件為：酶解pH 4.96，酶解溫度53.32℃，酶解時(shí)間6 h，酶用量420 U/g淀粉，彈簧糊精純度預(yù)測值為99.4%，經(jīng)驗(yàn)證試驗(yàn)，在該實(shí)驗(yàn)條件下得到的彈簧糊精純度為99.2%。與預(yù)測值基本一致，說明該方程與實(shí)際情況相符合，擬合程度較好。

表4 響應(yīng)值二次模型的方差分析Table 4 Analysis of variances for the developed quadratic regression model

2.3 彈簧糊精鏈長分布情況

圖6是采用HPSEC-MALLS-RI檢測系統(tǒng)所測出的彈簧糊精分子量信息，可知彈簧糊精的相對(duì)分子質(zhì)量分布為1 200～18 000，其中相對(duì)分子質(zhì)量小于 9 720（DP＜60）的彈簧糊精占 95.5%。 HPAEC 可用來測定聚合度在6～60之間的葡聚糖[15]，所以可采用HPAEC測定絕大部分彈簧糊精的聚合度分布，結(jié)果如圖7所示。根據(jù)聚合度差異，將彈簧糊精分為 4 組[16]，即DP 6～12，13～24，25～36，37～60，它們所占的比例分別為24.40%，45.08%，19.60%，10.92%。

圖6 彈簧糊精的相對(duì)分子質(zhì)量分布Fig.6 Molecular weight distribution of spring dextrin

圖7 彈簧糊精的聚合度分布Fig.7 Degree of polymerization distribution of spring dextrin

3 結(jié)語

作者通過響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)對(duì)酶解工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，以期對(duì)蠟質(zhì)玉米淀粉脫支完全，實(shí)現(xiàn)彈簧糊精的較高得率。