小金海棠多酚對肝纖維化的改善及機(jī)制研究

韋月平， 王 鵬

（遼東學(xué)院 農(nóng)學(xué)院，遼寧 丹東 118003）

肝臟是機(jī)體生物轉(zhuǎn)化和物質(zhì)代謝最重要的器官，肝臟損傷是由體內(nèi)外各種刺激因子侵襲所誘發(fā)的炎癥反應(yīng)導(dǎo)致的[1]。各種慢性肝損傷都會引發(fā)肝細(xì)胞壞死、炎癥并繼發(fā)纖維化的病理特征，從而導(dǎo)致肝纖維化[2]。研究表明，氧化應(yīng)激是引起肝損傷發(fā)生的主要機(jī)制之一，在氧化應(yīng)激狀態(tài)下，抗氧化系統(tǒng)失衡，自由基過量生成，炎癥過度積累，最終造成肝臟損傷[3]。

小金海棠（Malus xiaojinensis）是中國自主篩選出的第一個(gè)抗缺鐵黃葉病蘋果基因型，已在國內(nèi)廣泛種植開發(fā)[4]，其果實(shí)內(nèi)含有豐富的營養(yǎng)成分，特別是多酚類物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)可達(dá)0.9%，主要包括蘆丁、根皮苷、綠原酸、槲皮素、表兒茶素、兒茶素、原兒茶酸、金絲桃苷以及少量對香豆酸和阿魏酸等[5]。研究顯示植物多酚類物質(zhì)具有超強(qiáng)的抗氧化活性和降血糖、降血脂、保護(hù)心腦血管、抗癌、抗菌等多種活性作用[6-7]。但是對于小金海棠多酚（MXP）的活性研究較少。作者擬采用皮下注射CCl4建立小鼠肝纖維化模型，探討小金海棠多酚對CCl4誘導(dǎo)小鼠肝纖維化的改善作用及機(jī)制，以期為小金海棠功能食品的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)動物：SPF級 6～8周齡雄性昆明小鼠（KM）：購于遼寧長生生物技術(shù)有限公司（SCXK 2015-0001）。

實(shí)驗(yàn)材料：小金海棠多酚 （Malus xiaojinensisPolyphenols，MXP），作者自提取于新鮮小金海棠果，純度＞90%。

實(shí)驗(yàn)試劑：CCl4（分析純，純度＞99.5%）：購于鼎國生物技術(shù)有限公司；谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、超氧化物歧化酶（SOD）及谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）檢測試劑盒：購自南京建成生物工程研究所；蘇木素伊紅染色試劑盒（HE試劑盒）：購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Infinite F200/M200型酶標(biāo)儀：TECAN公司產(chǎn)品；5430R型臺式冷凍離心機(jī)：德國Eppendorf公司產(chǎn)品；ND-2000超微量核酸蛋白測定儀：賽默飛世爾科技公司產(chǎn)品；ABI 7500定量PCR儀：美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司產(chǎn)品；組織切片機(jī)：德國Leica公司產(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動物分組及處理 小鼠經(jīng)1周適應(yīng)飼養(yǎng)后，隨機(jī)分成實(shí)驗(yàn)組與對照組。實(shí)驗(yàn)組用體積分?jǐn)?shù)20%的CCl4橄欖油皮下注射，同時(shí)實(shí)驗(yàn)組分為3組每天進(jìn)行相應(yīng)的灌胃處理，即模型組（生理鹽水）、低劑量組（10 mg/kg）和高劑量組（20 mg/kg）。 每周稱量小鼠體質(zhì)量，觀察其活動及精神狀態(tài)，處理6周后，眼球采血，處死后摘取肝臟。

1.3.2 血清ALT和AST活性測定 眼球取出的血液4℃靜置1 h后以3 500 r/min于4℃離心10 min，取上清即為血清。按照試劑盒操作方法測定血清ALT和AST活性。

1.3.3 肝臟指數(shù)的測定 取肝組織1 g，加入9 mL的生理鹽水，制成勻漿并測定其濃度。按照試劑盒操作方法測定ALT、AST及SOD、GSH-PX活性。

1.3.4 HE染色 取小鼠肝臟用體積分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋切片，切片常規(guī)用二甲苯脫蠟，經(jīng)各級乙醇至水洗，蘇木素染色5 min，自來水沖洗，鹽酸乙醇分化30 s，自來水浸泡15 min，置伊紅液2 min，常規(guī)脫水、透明、封片。用顯微鏡觀察并拍照。

1.3.5 肝組織炎癥細(xì)胞因子IL-1、IL-6和TNF-α測定 每實(shí)驗(yàn)組取3只小鼠的肝組織各20 mg，提取總RNA。RT-PCT檢測炎性細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄水平。炎性細(xì)胞因子引物設(shè)計(jì)如下：腫瘤壞死因子（TNF-α），上游 5′-CCCTCACACTCAGATCATCTTCT-3′，下游 5′-GCTACGACGTGGGCTACAG-3′；白細(xì)胞介素 （IL）-1， 上游 5′-GCAACTGTTCCTGAACTCAA CT-3′， 下游 5′-ATCTTTTGGGGTCCGTCAACT-3′；IL-6，上游 5′-TAGTCCTTCCTACCCCAATTTCC-3′，下游 5′-TTGGTCCTTAGCCACTCCTTC-3′。 β-actin作為內(nèi)參。

1.3.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理 結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差格式。不同組間結(jié)果比較用單因素方差分析，統(tǒng)計(jì)結(jié)果p＜0.05認(rèn)為差異顯著，所有結(jié)果統(tǒng)計(jì)用SPSS軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 小金海棠多酚（MXP）抵御小鼠肝纖維化過程中體質(zhì)量的變化

肝纖維化會導(dǎo)致體內(nèi)代謝障礙，通常會出現(xiàn)體質(zhì)量的減輕的癥狀 。如圖1所示，2周過后CCl4建模小鼠體質(zhì)量明顯低于正常組。小金海棠多酚（MXP）對小鼠肝纖維化伴隨的體質(zhì)量降低有著明顯的抵抗作用，20 mg/kg MXP組在第5周與第6周的效果非常顯著（P＜0.01、P＜0.001）。

圖1 小金海棠多酚對小鼠肝纖維化過程中體質(zhì)量變化的影響Fig.1 Effect of MXP on the body weight of mice in Hepatic Fibrosis

2.2 小金海棠多酚（MXP）對肝纖維化小鼠肝指數(shù)的影響

如圖2所示，纖維化小鼠的肝指數(shù)也顯著低于正常組（p＜0.05）。MXP對肝指數(shù)的降低有一定的抵抗效果，而且隨著其劑量的增加，效果會愈加明顯，其中20 mg/kg組的肝指數(shù)為0.041，已經(jīng)非常接近正常組的0.043。其結(jié)果顯示，MXP對于肝損傷導(dǎo)致的肝萎縮有一定的緩解作用。

圖2 小金海棠多酚對肝纖維化小鼠肝指數(shù)的影響Fig.2 Effect of MXP on the liver index of mice in Hepatic Fibrosis

2.3 小金海棠多酚（MXP）對肝纖維化小鼠血清中ALT與AST活性的影響

谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）升高是肝臟發(fā)生損傷的重要生化指標(biāo)[8-9]。如圖3所示，與正常組相比，模型組小鼠血清中ALT與AST活性均顯著升高（p＜0.001）。與模型組相比，灌胃MXP可顯著抑制血清中ALT與AST活性升高 （p＜0.001），且20 mg/kg劑量組的效果優(yōu)于10 mg/kg劑量組。

圖3 小金海棠多酚對肝纖維化小鼠血清中ALT與AST活性的影響Fig.3 Effect of MXP on serum lipid （ALT，AST）of mice in Hepatic Fibrosis

2.4 小金海棠多酚（MXP）對肝纖維化小鼠肝臟中ALT與AST水平的影響

MXP對肝臟中ALT與AST的活性的影響和血清中的情況相似，如圖4所示，正常組的ALT、AST明顯小于模型組（P＜0.005），分別達(dá)到 111.4 U/g和215.0 U/g。MXP可以顯著降低二者的活性 （P＜0.001），并且20 mg/kg的效果更加明顯，其中ALT降至 51.3 U/g，AST 降至 130.9 U/g。

圖4 小金海棠多酚（MXP）對肝纖維化小鼠肝臟中ALT與AST水平的影響Fig.4 Effect of MXP on ALT andAST in liver of mice in Hepatic Fibrosis

2.5 小金海棠多酚（MXP）對肝纖維化小鼠肝臟中SOD、GSH-PX活性的影響

抗氧化酶（包括SOD與GSH-PX）作為生物體重要的一類蛋白因子，抗氧化活性降低會引起許多慢性疾病及衰老的發(fā)生，其中就包括肝損傷[10]。如圖5所示，肝纖維化小鼠肝臟中的抗氧化酶活性明顯小于正常小鼠，特別是GSH-PX（P＜0.001）。而MXP能顯著抑制這種狀況，而且隨著劑量的升高效果愈加顯著，20 mg/kg時(shí) SOD的顯著性為 0.05，GSHPX的顯著性為0.001。

圖5 小金海棠多酚（MXP）對肝纖維化小鼠肝臟中SOD、GSH-PX活性的影響Fig.5 Effect of MXP on SOD and GSH-PX in liver of mice in Hepatic Fibrosis

2.6 小金海棠多酚（MXP）對肝纖維化小鼠肝臟病理形態(tài)的影響

正常對照組小鼠肝臟顏色紅潤，顯微鏡觀察到肝細(xì)胞排列規(guī)則，胞質(zhì)豐富，核大而圓，核仁清晰。肝纖維化模型的肝臟發(fā)生明顯病理改變，其表面無光澤，光鏡下觀察到其細(xì)胞出現(xiàn)嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，肝細(xì)胞出現(xiàn)中至重度病變，胞漿疏松、細(xì)胞核多皺縮。MXP能夠緩解肝損傷，特別是20 mg/kg組，其結(jié)構(gòu)完整，肝索呈放射狀排列，部分肝細(xì)胞僅見輕度的病理改變。

2.7 小金海棠多酚（MXP）對肝纖維化小鼠肝臟中炎癥因子表達(dá)的影響

肝纖維化的發(fā)生是多因素過程，與多個(gè)相關(guān)細(xì)胞因子有關(guān)。IL-1、IL-6及TNFα是機(jī)體內(nèi)常見的炎性細(xì)胞因子。如圖7所示，肝纖維化小鼠體內(nèi)的炎性細(xì)胞因子水平明顯高于正常小鼠，轉(zhuǎn)錄水平IL-1為 6.29、IL-6 為 8.10、TNF-α 為 2.00，其中 IL-6和 TNFα 最為顯著（P＜0.01），而 MXP能顯著降低炎癥的發(fā)生，20 mg/kg組的效果比較顯著，3類炎癥因子轉(zhuǎn)錄水平可降低至1.83、4.07、0.85。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MXP可能通過抑制炎癥的發(fā)生對對肝纖維化進(jìn)行抵御。

圖6 小金海棠多酚（MXP）對肝纖維化小鼠肝臟病理形態(tài)的影響Fig.6 Effect of MXP on Morphologic of Pathology inliver of mice in Hepatic Fibrosis

圖7 小金海棠多酚（MXP）對肝纖維化小鼠肝臟中相關(guān)炎癥因子表達(dá)的影響Fig.7 Effect of MXP on the expression of inflammatory cytokines in liver of mice

3 結(jié) 語

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，小金海棠多酚能顯著抵御皮下注射CCl4引發(fā)的肝纖維化，這種效果可能與其強(qiáng)抗氧化性有關(guān)[11]，并且它還能抑制炎癥的發(fā)生包括IL-1、IL-6 及 TNF-α。

肝臟是機(jī)體的主要代謝器官，容易被中間活性物質(zhì)氧化損傷。肝損傷主要是由于生物膜功能受到損害，體內(nèi)酶的活性失衡，在細(xì)胞因子（如IL-1，IL-6，TNF-α）的共同作用下引起的[12]。SOD 與 GSH-PX作為機(jī)體內(nèi)重要的抗氧化酶可以保護(hù)肝臟免受中間活性物質(zhì)引起的氧化損傷[13]。作者選取這2個(gè)關(guān)鍵抗氧化酶作為檢測目標(biāo)，發(fā)現(xiàn)小鼠在CCl4注射6周后，兩者活性明顯下降，而小金海棠多酚組的活性顯著高于CCl4模型組，這說明小金海棠多酚能改善氧應(yīng)激引起的氧化系統(tǒng)的失衡，對肝纖維化形成過程中的過氧化有一定的抑制作用，從而起到保肝護(hù)肝的作用。

肝損傷，特別是肝纖維化的形成是多種致病因子引起的肝臟炎癥或損傷后組織修復(fù)過程中的代償反應(yīng)，所以控制細(xì)胞炎癥的發(fā)生是預(yù)防治療肝纖維化的重要手段。研究結(jié)果顯示，CCl4誘導(dǎo)的急性肝損傷小鼠肝細(xì)胞內(nèi)的炎癥水平 （IL-1，IL-6及TNF-α）明顯高于正常小鼠，同時(shí)小金海棠多酚處理之后的小鼠肝內(nèi)的炎癥也明顯受到了抑制，特別是IL-6和TNF-α，這說明小金海棠多酚可能是通過抑制肝內(nèi)炎癥的發(fā)生來抵御肝損傷。

小金海棠多酚可能對肝纖維化有一定的抵御作用，其作用機(jī)制可能是通過抗氧化作用和降低機(jī)體炎癥的發(fā)生而對肝纖維化進(jìn)行抑制。