氯美噻唑?qū)σ掖颊T導(dǎo)大鼠肝損傷的抑制作用研究

王劍彬，吳彩月，王麗斯，吳愷明

（1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬樂從醫(yī)院 消化科，廣東 佛山 528315；2.廣東省佛山市順德區(qū)樂從社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心，廣東 佛山 528315；3.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬樂從醫(yī)院 檢驗(yàn)科，廣東佛山 528315；4.中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院 胃腸外科中心，廣東 廣州 510080）

氯美噻唑（Clormethiazole, CMZ）為噻唑類衍生物，具有鎮(zhèn)靜、催眠、抗驚厥作用[1]。肝損傷的主要病理形式包括酒精性肝炎、肝纖維化、肝硬化等，病因是長期大量飲酒誘導(dǎo)肝細(xì)胞色素P450 2E1（cytochrome P450 2E1, CYP2E1）的表達(dá)，增加自由基對肝臟的損傷[2-3]。研究表明，CMZ在翻譯后抑制CYP2E1基因的轉(zhuǎn)錄，從而影響CYP2E1的活性[4-6]。本文通過復(fù)制慢性酒精性肝損傷大鼠模型，以期闡明CMZ在酒精所致肝細(xì)胞損傷中發(fā)揮的重要作用，為臨床防治酒精性肝損傷提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 無特定病原體級雄性SD大鼠32只，體重（220±20）g，購自北京維通利華生物技術(shù)有限公司，合格證號SCXK-京-2016-0012。

1.1.2 藥物試劑 CMZ純度99.8%（上海梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司），氯唑沙宗（Chlorzoxazone, CHZ）純度99%（上海梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司），43%乙醇（河南省化工試劑有限公司），Vector ABC試劑盒和丙二醛（Malondialdehyde, MDA）試劑盒購自南京建成生物工程有限公司，CYP2E1、CYP4A、CYP3A抗體購自美國Santa Cruz公司。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 CX23型光學(xué)顯微鏡（日本奧林巴斯公司），AU680型全自動(dòng)生化分析儀（美國貝克曼庫爾特公司），UV1901雙光束紫外分光光度計(jì)（上海精學(xué)科學(xué)儀器有限公司），SONICS超聲波細(xì)胞破碎儀（美國BRANSON公司），安捷倫1260高效液相色譜儀（美國Agilent公司），ULTRACUTR型超薄切片機(jī)（德國萊卡公司），JA2003型電子分析天平（上海天平儀器廠）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠慢性酒精性肝損傷模型的復(fù)制 按2個(gè)影響因素的析因設(shè)計(jì)分組：A干預(yù)因素：①不干預(yù)，②干預(yù)（給予CMZ）；B模型復(fù)制因素：①無損模型（給予葡萄糖），②損害模型（給予乙醇）（見表1）。32只雄性SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按體重均衡隨機(jī)分為4組，每組8只。

表1 2個(gè)因素的析因設(shè)計(jì)

A2B1：葡萄糖＋CMZ組，用生理鹽水將CMZ配制成所需濃度，大鼠灌胃CMZ 80 mg/（kg·d），2 h后灌胃 43% 葡萄糖 [0.1 ml/（kg·d）]，60 d。

A1B1：葡萄糖對照組（陰性對照組），大鼠灌胃葡萄糖＋CMZ組等體積生理鹽水，2 h后灌胃43%葡萄糖液 [0.1 ml/（kg·d）]，60 d。

A2B2：乙醇＋CMZ組，用生理鹽水將CMZ配制成所需濃度，大鼠灌胃CMZ 80 mg/（kg·d），2 h后灌胃 43% 乙醇 [0.1 ml/（kg·d）]，60 d。

A1B2：乙醇模型組（陽性對照組），大鼠灌胃乙醇＋CMZ組等體積生理鹽水，2 h后灌胃43%乙醇[0.1 ml/（kg·d）]，60 d。

第60天，大鼠禁食但不禁水，12 h后在眼眶處采血，收集大鼠血漿，稱體重。各組大鼠腹腔注射CHZ 150μmol/kg，分別于給藥后1、2和3 h在眼眶處采集大鼠血樣，隨即斷頭處死。血液4 500 r/min離心10 min，儲(chǔ)存于-20℃冰箱。取肝臟全葉并稱重，其中一葉采用10%多聚甲醛固定，剩余部分凍存于-80℃冰箱。每組8只大鼠，實(shí)際每組模型復(fù)制成功6或7只，故最終實(shí)驗(yàn)按每組6只大鼠計(jì)算。

1.2.2 大鼠肝指數(shù)的計(jì)算及血漿乙醇濃度和血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine transaminase, ALT）活性的檢測 計(jì)算各組大鼠的肝臟指數(shù)（肝重/體重）；采用全自動(dòng)生化分析儀通過酶動(dòng)力學(xué)方法測定ALT的活性；采用放射性能量衰變實(shí)驗(yàn)測定血漿乙醇濃度[7]。

1.2.3 大鼠肝組織病理學(xué)觀察和分級 取用10%多聚甲醛固定的肝臟組織，常規(guī)石蠟包埋，4μm組織切片，蘇木精-伊紅染色法（hematoxylin-eosin staining,HE）染色，光學(xué)顯微鏡下觀察各組大鼠肝臟形態(tài)學(xué)變化；肝臟形態(tài)學(xué)病理分級參照MATHEWS等[8]的方法。

1.2.4 肝組織CYP2E1免疫組織化學(xué)法染色 CYP2E1免疫組織化學(xué)染色采用SP法[9]，DAB顯色。一抗CYP2E1（1∶600稀釋），使用Vector ABC試劑盒和生物素標(biāo)記的二抗顯現(xiàn)CYP2E1的陽性區(qū)域。

1.2.5 肝組織勻漿MDA含量的測定 在752型分光光度計(jì)上用分光光度法測定MDA含量，其濃度以pmol/mg勻漿蛋白表示。通過檢測脂肪組織的MDA反映脂質(zhì)過氧化程度，使用硫代巴比妥酸檢測MDA[10]。

1.2.6 大鼠肝臟蛋白酶體活性的測定 制備肝勻漿，檢測糜蛋白酶活性（LLVY-AMC水解程度）、類胰蛋白酶活性（LSTR-AMC水解程度）和谷氨酰肽水解酶活性（LLE-NA水解程度）[11]。在pH 7.5的0.1 mol Tris-HCl中加入20～200μg相同蛋白和40μmol縮氨酸，30℃恒溫?fù)u床反應(yīng)1 h。LLVY-AMC和LSTRAMC的激發(fā)和發(fā)射檢測波長分別為390和440 nm，β-甲萘胺的激發(fā)和發(fā)射檢測波長分別為335和410 nm。

1.2.7 Western blot檢測 將各組凍存的大鼠肝臟按照曹艷等[12]的方法制備成肝微粒體。使用大鼠多克隆抗體，采用Western blot檢測大鼠CYP2E1、CYP3A、CYP4A蛋白相對表達(dá)量[13]。采用4%濃縮膠和8.7%分離膠行聚丙烯酰胺凝膠電泳。將肝微粒體溶解在聚丙烯酰胺凝膠緩沖液中（3% SDS，0.2 mol Tris-Hcl，pH 6.8，26%丙三醇，2 mol β-巰基乙醇）100℃加熱2 min。按25μl/孔上樣，微粒體蛋白電泳分離后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，脫脂奶粉封閉1 h。一抗（1∶5 000稀釋）室溫孵育1 h；HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗（1∶2 000稀釋）室溫孵育1 h。充分洗膜后加入ECL化學(xué)發(fā)光液，采用Image Quant LAS 4000型蛋白成像系統(tǒng)（德國GE Healthcare公司)進(jìn)行曝光處理。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以密度為單位來計(jì)算（UA/mg）。

1.2.8 大鼠體內(nèi)CYP2E1活性的檢測 通過高效液相色譜檢測血漿樣品中6-羥基氯唑沙宗和CHZ的含量（μg/ml），采用6-羥基氯唑沙宗/氯唑沙宗比值評估各組大鼠體內(nèi)CHZ的代謝程度[14]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用單因素方差分析或析因設(shè)計(jì)的方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CMZ對酒精性肝損傷大鼠體重、肝臟指數(shù)及肝功指標(biāo)的影響

實(shí)驗(yàn)期間（60 d），乙醇模型組和葡萄糖對照組大鼠以相同的速率成長（P＞0.05）。乙醇模型組平均增長體重3 g/d，葡萄糖對照組為2.2 g/d，乙醇＋CMZ組為1.5 g/d，葡萄糖＋CMZ組為2.1 g/d。乙醇與葡萄糖干預(yù)效果比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），乙醇模型組的肝重和相對肝重（相對肝重=肝重/體重×100%）高于葡萄糖對照組，但葡萄糖＋CMZ組的肝重和相對肝重較乙醇＋CMZ組降低。見表2。

表2 CMZ對酒精性肝損傷大鼠體重、肝臟指數(shù)的影響（n =6，±s）

表2 CMZ對酒精性肝損傷大鼠體重、肝臟指數(shù)的影響（n =6，±s）

組別 體重/g 肝重/g 相對肝重/%葡萄糖對照組 347±24 11.9±1.8 3.4±0.4乙醇模型組 372±38 18.8±2.9 5.0±0.3葡萄糖+CMZ組 340±31 13.3±1.4 3.9±0.3乙醇+CMZ組 301±61 16.6±5.0 5.4±0.9 FA值 5.465 0.093 4.087 PA值 0.030 0.764 0.057 FB值 0.172 16.017 50.086 PB值 0.683 0.001 0.000 FA×B值 3.762 1.905 0.051 PA×B值 0.067 0.183 0.824

2.2 CMZ對酒精性肝損傷大鼠肝功指標(biāo)和血漿乙醇含量的影響

乙醇模型組血漿中乙醇濃度與乙醇＋CMZ組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。乙醇模型組與葡萄糖對照組的ALT水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。但乙醇模型組與乙醇＋CMZ組的ALT水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；葡萄糖對照組與葡萄糖＋CMZ組的ALT水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明CMZ的影響效果顯著。見表3。

表3 CMZ對酒精性肝損傷大鼠肝功指標(biāo)和血漿乙醇含量的影響 （n =6，±s）

表3 CMZ對酒精性肝損傷大鼠肝功指標(biāo)和血漿乙醇含量的影響 （n =6，±s）

組別 乙醇/（mg/dl） ALT/（IU/L）葡萄糖對照組 - 90±40乙醇模型組 197±49 102±53葡萄糖+CMZ組 - 33±13乙醇+CMZ組 239±172 66±38 tA/FA值 0.575 8.674 PA值 0.586 0.008 FB值 2.037 PB值 0.169 FA×B值 0.436 PA×B 值 0.517

2.3 CMZ對酒精性肝損傷大鼠肝臟組織病理學(xué)變化的影響

乙醇模型組大鼠的病理分級高于乙醇＋CMZ組，乙醇模型組大鼠的肝臟病理分級參數(shù)（脂肪變性、壞死、炎癥、纖維化）較乙醇＋CMZ組差（P＜0.05）。乙醇模型組大鼠的肝臟纖維化病灶較明顯，這種纖維化主要存在于肝小葉中心或者細(xì)胞外周。乙醇模型組大鼠的肝臟與乙醇＋CMZ組相比，有明顯的脂肪性病變、壞死及炎癥。見表4。

葡萄糖對照組可見肝小葉輪廓清晰，小葉中央靜脈向四周呈放射狀排列，肝細(xì)胞排列尚整齊，細(xì)胞分界清，核圓，位于細(xì)胞中央，胞質(zhì)豐富，呈嗜堿性（見圖1A）。乙醇模型組可見肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，肝板排列紊亂，呈點(diǎn)、片狀壞死，肝細(xì)胞腫脹明顯，胞質(zhì)中可見大小不等、數(shù)量不一的圓形脂肪空泡，散在肝細(xì)胞嗜酸性變，小葉中央靜脈周圍和匯管區(qū)有炎癥細(xì)胞浸潤，有的肝細(xì)胞質(zhì)中有紅色顆粒狀Mallory小體（見圖1B）。乙醇＋CMZ組大鼠肝細(xì)胞濁腫明顯減輕，有散在炎癥細(xì)胞浸潤，肝細(xì)胞內(nèi)偶有小脂滴（見圖1C）。葡萄糖＋CMZ組也偶見脂肪空泡，肝細(xì)胞腫脹明顯，胞體腫大成球形，小葉中央靜脈周圍和匯管區(qū)有炎癥細(xì)胞浸潤（見圖1D）。

表4 4組大鼠肝臟病理分級 （n =6，分，±s）

表4 4組大鼠肝臟病理分級 （n =6，分，±s）

組別 脂肪性病變 壞死 炎癥 纖維化 總分葡萄糖對照組 0.17±0.11 0.83±0.45 0.83±0.45 0.10±0.01 1.83±1.15乙醇模型組 3.01±1.07 1.14±0.59 1.63±0.52 0.75±1.04 6.45±2.34葡萄糖+CMZ組 0.25±0.12 0.1±0.01 0.62±0.34 0.10±0.01 0.85±0.48乙醇 +CMZ 組 1.82±1.05 0.14±0.06 0.64±0.31 0.10±0.01 2.54±1.28 FA值 3.227 32.282 12.706 2.317 16.615 PA值 0.088 0.000 0.002 0.144 0.001 FB值 51.299 1.291 5.862 2.320 27.606 PB值 0.000 0.269 0.025 0.143 0.000 FA×B值 4.230 0.759 5.346 2.316 5.937 PA×B 值 0.053 0.394 0.032 0.144 0.024

圖1 CMZ對酒精性肝損傷大鼠肝組織病理變化的影響 （HE×10）

2.4 CMZ對酒精性肝損傷大鼠肝組織CYP酶和MDA含量的影響

乙醇模型組CYP2E1蛋白表達(dá)量高于葡萄糖對照組和葡萄糖＋CMZ組（P＜0.05），表明乙醇誘導(dǎo)大鼠體內(nèi)CYP2E1蛋白的表達(dá)（見圖2）。但乙醇模型組與乙醇＋CMZ組的CYP4A和CYP3A相對表達(dá)量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；乙醇模型組與葡萄糖對照組、乙醇＋CMZ組、葡萄糖＋CMZ組的MDA含量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），乙醇模型組的MDA含量高于其他各組。見表5。

圖2 4組大鼠CYP2E1蛋白的表達(dá)

表5 CMZ對酒精性肝損傷大鼠肝組織CYP酶和丙二醛含量的影響 （n =6，±s）

表5 CMZ對酒精性肝損傷大鼠肝組織CYP酶和丙二醛含量的影響 （n =6，±s）

組別 CYP2E1/（UA/mg） CYP4A/（UA/mg） CYP3A/（UA/mg） MDA/（pmol/mg）葡萄糖對照組 37±15 65±27 153±101 34.9±7.1乙醇模型組 233±17 126±57 239±165 58.7±21.8葡萄糖+CMZ組 22±13 111±57 121±65 31.1±9.3乙醇 +CMZ 組 215±79 158±91 349±158 37.5±9.1 FA值 0.971 2.293 0.546 5.273 PA值 0.336 0.146 0.469 0.033 FB值 131.155 4.476 8.929 7.831 PB值 0.000 0.047 0.007 0.011 FA×B值 0.012 0.079 1.800 2.561 PA×B 值 0.915 0.782 0.195 0.125

2.5 CMZ對酒精性肝損傷大鼠肝組織CYP2E1蛋白表達(dá)的影響

鼠肝小葉部位免疫組織化學(xué)法染色顯示，乙醇模型組染色區(qū)域與乙醇＋CMZ組基本一致（見圖3A）。葡萄糖對照組染色面積較小，僅見于中心部位的肝臟細(xì)胞。葡萄糖＋CMZ組與乙醇＋CMZ組相比，肝小葉CYP2E1陽性區(qū)域明顯縮小（見圖3B）。

圖3 兩組大鼠肝組織中CYP2E1的表達(dá)

2.6 CMZ對酒精性肝損傷大鼠肝組織蛋白酶體活性的影響。

2.6.1 糜蛋白酶活性 4組大鼠糜蛋白酶活性比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=17.436，P=0.000）。兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，乙醇模型組的糜蛋白酶活性低于葡萄糖對照組和葡萄糖＋CMZ組（P＜0.05）；乙醇＋CMZ組的糜蛋白酶活性與乙醇模型組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表6和圖4。

2.6.2 類胰蛋白酶活性 4組大鼠類胰蛋白酶活性水平比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=11.457，P=0.000）。兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，乙醇模型組的類胰蛋白酶活性較葡萄糖對照組降低（P＜0.05）。見表6和圖5。

2.6.3 谷氨酰肽水解酶活性 4組大鼠谷氨酰肽水解酶活性水平比較，經(jīng)單因素方差分析，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.995，P=0.416）。見表6和圖6。

表6 4組大鼠肝組織蛋白酶體和CYP2E1活性比較 （n =6，±s）

表6 4組大鼠肝組織蛋白酶體和CYP2E1活性比較 （n =6，±s）

6-羥基氯唑沙宗/氯唑沙宗比值葡萄糖對照組 38.5±10.1 45.6±15.8 6.7±4.5 0.11±0.02乙醇模型組 14.6±3.4 12.5±4.9 14.3±12.6 0.18±0.03葡萄糖+CMZ組 43.2±3.0 23.0±5.2 7.5±6.4 0.05±0.02乙醇+CMA組 24.7±3.0 21.8±6.1 9.8±8.5 0.03±0.03 F值 17.436 11.457 0.995 15.736 P值 0.000 0.000 0.416 0.000組別 糜蛋白酶活性/（nmol/mg）類胰蛋白酶活性/（nmol/mg）谷氨酰酞水解酶活性/（nmol/mg）

圖4 4組大鼠糜蛋白酶活性比較

圖5 4組大鼠類胰蛋白酶活性比較

2.7 CMZ對酒精性肝損傷大鼠體內(nèi)CYP2E1活性的影響。

4組大鼠CYP2E1活性水平（6-羥基氯唑沙宗/氯唑沙宗比值）比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=15.736，P=0.000）。 兩 兩 比 較 經(jīng) LSD-t檢驗(yàn)，乙醇模型組CYP2E1活性高于葡萄糖對照組（P＜0.05）；葡萄糖＋ CMZ組、乙醇＋ CMZ組CYP2E1活性低于葡萄糖對照組（P＜0.05）；葡萄糖＋CMZ組、乙醇＋CMZ組CYP2E1活性低于乙醇模型組（P＜0.05），表明CMZ不僅抑制體內(nèi)乙醇誘導(dǎo)的CYP2E1，而且抑制自身固有的CYP2E1活性。見表6和圖7。

圖6 4組大鼠谷氨酰肽水解酶活性比較

圖7 4組大鼠6-羥基氯唑沙宗/氯唑沙宗比值比較

3 討論

本研究證明，CMZ能夠明顯改善乙醇誘導(dǎo)的肝臟損傷。雖然CMZ未影響乙醇對CYP2E1的誘導(dǎo)作用，但是最后的實(shí)驗(yàn)中，通過CHZ的羥基化體外代謝發(fā)現(xiàn)，CMZ同時(shí)抑制乙醇誘導(dǎo)的和自身固有的CYP2E1活性。因此，CMZ對改善乙醇誘導(dǎo)的肝損傷的機(jī)制可能與體內(nèi)酶活性的抑制作用有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，大鼠體內(nèi)CMZ能夠減少CYP2E1的合成，與其他研究結(jié)果一致[15]。有研究表明，CYP2E1的抗體滴度與肝臟的病理程度、CYP2E1蛋白表達(dá)水平有相關(guān)性[16]。另外一個(gè)不能排除的可能性是在實(shí)驗(yàn)?zāi)y得的CYP2E1蛋白水平不能反映整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間CHZ對CYP2E1均有抑制作用。

盡管乙醇誘導(dǎo)CYP2E1的表達(dá)，但是CMZ降低大鼠體內(nèi)CYP2E1活性的原因可能是通過結(jié)合CYP2E1分子內(nèi)其他位點(diǎn)而不是酶催化反應(yīng)的位點(diǎn)，從而非競爭性抑制CYP2E1，酶被誘導(dǎo)的機(jī)制是自身穩(wěn)定化的原因[17]。乙醇的結(jié)合會(huì)抑制蛋白磷酸-泛素化通路。CMZ同時(shí)抑制CYP2E1基因轉(zhuǎn)錄，但本實(shí)驗(yàn)未對該機(jī)制進(jìn)行深入研究。乙醇模型組與乙醇＋CMZ組的CYP2E1蛋白表達(dá)水平無差異，表明CMZ抑制CYP2E1基因轉(zhuǎn)錄的機(jī)制可能并不是那么重要。乙醇模型組與乙醇＋CMZ組大鼠肝臟病理分級的差異可能是因?yàn)镃MZ在體內(nèi)對CYP2E1抑制，其同時(shí)解釋了乙醇＋CMZ組大鼠CYP2E1活性下降的原因。乙醇誘導(dǎo)的放射性加合物（CYP2E1-羥乙基放射性加合物）依賴于CYP2E1的形成。在乙醇模型組大鼠肝臟中CMZ抑制CYP2E1，而阻止MDA含量的升高。

本實(shí)驗(yàn)在研究大鼠代謝乙醇的同時(shí)也研究了體內(nèi)CHZ代謝的情況，表明CMZ通過非競爭性抑制降低體內(nèi)CYP2E1的活性，在乙醇＋CMZ組中也檢測到CMZ抑制大鼠體內(nèi)CYP2E1的活性。然而在人體酒精戒斷期間，乙醇作為非競爭性的抑制劑已被消除掉，CMZ對CYP2E1的活性抑制作用更突出[18]。

CMZ對乙醇誘導(dǎo)的微粒體蛋白酶的活性有抑制作用，但具體機(jī)制尚未明確。CMZ抑制體內(nèi)CYP2E1酶的活性，減輕乙醇誘導(dǎo)的肝臟病理損傷。那么CMZ對乙醇誘導(dǎo)的微粒體蛋白活性的抑制作用是否與CMZ減緩肝損傷有聯(lián)系，還需要進(jìn)一步研究探討。肝臟脂肪性病變和肝細(xì)胞蛋白的積累，使乙醇誘導(dǎo)的大鼠肝重增加，在乙醇＋CMZ組大鼠中CMZ的攝入使肝重降低。然而在乙醇模型組中，CMZ不僅降低肝細(xì)胞的脂肪性病變程度，而且降低蛋白酶活性。乙醇＋CMZ組大鼠的肝重與乙醇模型組無差異，其原因可能是肝臟蛋白的增加和脂肪細(xì)胞丟失的不平衡[19]。本實(shí)驗(yàn)中，大鼠的凈體重?zé)o明顯增加或者減輕。肝細(xì)胞質(zhì)中蛋白的積累可能是由于微粒體蛋白活性丟失，造成細(xì)胞腫脹而誘發(fā)肝損傷，最終導(dǎo)致肝正常血流發(fā)生變化。

綜上所述，CMZ能夠減輕乙醇誘導(dǎo)的肝臟病理性病變。更重要的是CMZ能完全阻止乙醇誘導(dǎo)的肝硬化。CMZ改善乙醇誘導(dǎo)的肝臟病理分級的機(jī)制可能是抑制CYP2E1的活性。將CMZ加入乙醇模型組后，乙醇誘導(dǎo)的MDA水平無顯著增加，因此說明CMZ有效阻止肝組織的過氧化反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CMZ通過抑制CYP2E1的活性，而有效保護(hù)肝臟免受自由基的損傷。CMZ降低乙醇對蛋白酶活性的不良影響，表明CYP2E1產(chǎn)生的自由基可損傷蛋白酶。CMZ同時(shí)能抑制CYP2E1的合成。由于肝損傷患者CYP2E1活性較高，因此CMZ作為治療肝損傷的藥物具有很好的應(yīng)用前景。