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    HOXA10基因敲低對非小細(xì)胞肺癌安羅替尼敏感性的影響

    2022-06-24 01:17:24李俞羲路遙田野
    關(guān)鍵詞:安羅替尼安羅敏感性

    李俞羲,路遙,田野

    (中國醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院 1.麻醉科;2.胸外科,沈陽 110032)

    肺癌是全球發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤[1],嚴(yán)重威脅人類健康。非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)是肺癌的最常見類型,約占確診肺癌的80%~85%[1]。目前,NSCLC的治療手段主要包括外科手術(shù)、放療、化療、靶向治療和免疫治療。盡管近年來NSCLC的治療方法不斷進(jìn)步,但是由于多數(shù)NSCLC患者確診時已屬臨床Ⅳ期,無法采用外科手術(shù)切除,而以鉑類為基礎(chǔ)的化療存在耐藥性[2]。目前NSCLC患者的5年生存率僅為10%~15%[1],因此尋找更有效的臨床治療方法對提高患者生存率十分重要。

    安羅替尼是小分子多靶點酪氨酸激酶抑制劑,能夠有效抑制血管內(nèi)皮生長因子受體、血小板源生長因子受體和成纖維生長因子受體等[3]。臨床研究[4-5]表明,安羅替尼作為三線藥物可以顯著延長NSCLC患者的總生存期和無進(jìn)展生存期。RNA高通量測序和分析發(fā)現(xiàn)同源異型盒基因A10(homeobox A10,HOXA10)與NSCLC對安羅替尼的耐藥性相關(guān)[6],然而具體的作用機制尚未闡明。研究抗腫瘤藥物的耐藥機制有利于改善治療效果,進(jìn)一步優(yōu)化治療方案。因此,本研究通過敲低HOXA10,探討HOXA10對NSCLC細(xì)胞安羅替尼敏感性的影響。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    人胚肺成纖維細(xì)胞MRC-5、人肺癌細(xì)胞A549和PC-9購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。安羅替尼購自美國MCE公司。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、HOXA10小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)、對照siRNA和Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Thermo Fisher公司。CCK-8試劑、Annexin V凋亡檢測試劑盒購自碧云天公司。HOXA10、GAPDH抗體購自美國Santa Cruz公司。Transwell小室購自美國康寧公司。

    1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

    人肺癌細(xì)胞A549和PC-9培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基內(nèi),培養(yǎng)液內(nèi)含有青霉素100 U/mL、鏈霉素100 μg/mL。細(xì)胞均置于含5% CO2的37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),0.25%胰酶-EDTA消化傳代,細(xì)胞處于對數(shù)生長期時用于實驗。當(dāng)細(xì)胞生長融合度為70%~80%時,按照Lipofectamine 2000試劑說明書轉(zhuǎn)染si-NC(對照組)或si-HOXA10。

    1.3 RNA提取和實時定量PCR

    采用TRIzol提取細(xì)胞總RNA,用QuantiTect Reverse Transcription 試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA,隨后使用SYBR Green PCR Master Mix進(jìn)行實時定量PCR。引物序列:HOXA10,正向5’-CTCGCCCATAGACCTGTGG-3’,反向5’-GTTCTGCGCGAAAGAGCAC-3’;GAPDH,正 向5’-TGTGGGCATCAATGGATTTGG-3’,反向5’-ACA CCATGTATTCCGGGTCAAT-3’。采用2-ΔΔCt法計算目的基因表達(dá)。

    1.4 蛋白提取和Western blotting

    采用RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白,BCA法測定蛋白濃度。取各樣本等量蛋白進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳,濕轉(zhuǎn)將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜。5%脫脂奶粉室溫封閉1 h后,分別孵育HOXA10(1 ∶500)或者GAPDH(1 ∶1 000)一抗4 ℃過夜。洗膜后,室溫孵育耦聯(lián)HRP的二抗1 h。采用ECL發(fā)光液檢測蛋白條帶,GAPDH為內(nèi)參。

    1.5 CCK-8法

    采用CCK-8法檢測細(xì)胞增殖活性,以評估安羅替尼細(xì)胞毒性。將轉(zhuǎn)染后的A549和PC-9細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中,以不同濃度(1、2、4、8、10、15、25、50、95 μg/mL)安羅替尼處理細(xì)胞。安羅替尼處理24 h后,每孔加入10 μL CCK-8試劑,37 ℃孵育1 h。酶標(biāo)儀檢測450 nm吸光度。每組設(shè)置至少3個復(fù)孔。

    1.6 克隆形成實驗

    A549和PC-9細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后,以0.25%胰酶-EDTA消化,用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基重懸并接種至6孔板,細(xì)胞密度為800/孔。繼續(xù)培養(yǎng)14 d,4%多聚甲醛固定后進(jìn)行0.1%結(jié)晶紫染色,拍照記錄克隆數(shù)。

    1.7 Transwell法檢測細(xì)胞遷移和侵襲能力

    細(xì)胞遷移實驗不需預(yù)包被Transwell小室,細(xì)胞侵襲實驗前需用Matrigel包被Transwell小室。將轉(zhuǎn)染后的A549和PC-9細(xì)胞懸液加入Transwell上室無血清培養(yǎng),Transwell下室加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液。Transwell上室和下室中均含4 μg/mL安羅替尼,細(xì)胞在含5% CO2的37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h,用棉簽擦去Transwell上室細(xì)胞。4%多聚甲醛固定后以0.1%結(jié)晶紫染色。隨機選取5個視野,計數(shù)每個視野中的遷移或侵襲細(xì)胞數(shù)。

    1.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

    采用Annexin V/碘化丙啶染色,經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞用8 μg/mL安羅替尼處理24 h。細(xì)胞以胰酶消化,用PBS洗滌3次后重懸于binding buffer,加入Annexin-V-FITC和碘化丙啶溶液避光染色30 min。用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率,Annexin V陽性為早期凋亡細(xì)胞,Annexin V和碘化丙啶雙陽性為晚期凋亡細(xì)胞。

    1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

    2 結(jié)果

    2.1 HOXA10在NSCLC中呈高表達(dá)

    與人胚肺成纖維細(xì)胞MRC-5相比,HOXA10在人肺癌細(xì)胞A549和PC-9中呈高表達(dá),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.030 3,P=0.001 2),表明HOXA10在NSCLC細(xì)胞中呈高表達(dá)。見圖1。

    圖1 HOXA10在NSCLC細(xì)胞中的表達(dá)水平Fig.1 Expression of HOXA10 in NSCLC cell lines

    2.2 敲低HOXA10降低安羅替尼在A549和PC-9細(xì)胞中的半數(shù)抑制濃度(half-maximal inhibitory concentration,IC50)

    為了進(jìn)一步研究HOXA10對安羅替尼藥物敏感性的影響,分別將si-NC和si-HOXA10轉(zhuǎn)染至A549和PC-9細(xì)胞。細(xì)胞轉(zhuǎn)染后48 h,采用Western blotting檢測HOXA10表達(dá)水平。與轉(zhuǎn)染si-NC的A549和PC-9細(xì)胞相比,轉(zhuǎn)染si-HOXA10的細(xì)胞中HOXA10表達(dá)水平顯著降低,見圖2A。

    將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞以不同濃度(1、2、4、8、10、15、25、50、95 μg/mL)安羅替尼處理24 h,采用CCK-8法檢測細(xì)胞增殖活性,結(jié)果顯示,敲低HOXA10的A549和PC-9細(xì)胞的生存率顯著低于對照組(P<0.05),說明安羅替尼對敲低HOXA10的細(xì)胞增殖有抑制作用。見圖2B。此外,敲低HOXA10會降低安羅替尼 在A549和PC-9細(xì)胞中的IC50,si-NC-A549細(xì) 胞和si-HOXA10-A549細(xì)胞中安羅替尼的IC50分別為(35.29±3.24)和(18.33±2.07)μg/mL,si-NC-PC-9細(xì)胞和si-HOXA10-PC-9細(xì)胞中安羅替尼的IC50分別為(24.32±4.06)和(10.31± 2.83)μg/mL,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。

    圖2 敲低HOXA10降低安羅替尼在A549和PC-9細(xì)胞中的IC50Fig.2 Half-maximal inhibitory concentration(IC50)of anlotinib after HOXA10 knockdown in A549 and PC-9 cells

    2.3 敲低HOXA10后安羅替尼對細(xì)胞增殖的抑制作用增強

    克隆形成實驗結(jié)果表明,A549和PC-9細(xì)胞中,未經(jīng)處理的轉(zhuǎn)染si-NC的細(xì)胞(si-NC組)、未經(jīng)處理的轉(zhuǎn)染si-HOXA10的細(xì)胞(si-HOXA10組)、經(jīng)4 μg/mL安羅替尼處理的細(xì)胞(Anlotinib組)比較,細(xì)胞增殖抑制率的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05),經(jīng)4 μg/mL安羅替尼處理的轉(zhuǎn)染si-HOXA10的細(xì)胞(si-HOXA10+anlotinib組)與上述3組細(xì)胞比較,細(xì)胞增殖抑制率明顯增高(均P<0.05),說明敲低HOXA10后安羅替尼對細(xì)胞增殖的抑制作用增強。見圖3。

    圖3 敲低HOXA10后安羅替尼對細(xì)胞增殖抑制作用增強Fig.3 Inhibition of cell proliferation by anlotinib is enhanced after HOXA10 knockdown

    2.4 敲低HOXA10后安羅替尼對細(xì)胞遷移和侵襲的抑制作用增強

    Transwell細(xì)胞遷移和侵襲實驗表明,A549和PC-9細(xì)胞中,未經(jīng)處理的轉(zhuǎn)染si-NC的細(xì)胞(si-NC組)、未經(jīng)處理的轉(zhuǎn)染si-HOXA10的細(xì)胞(si-HOXA10組)、經(jīng)4 μg/mL安羅替尼處理的細(xì)胞(Anlotinib組)比較,細(xì)胞遷移和侵襲相對數(shù)量的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05),經(jīng)4 μg/mL安羅替尼處理的轉(zhuǎn)染si-HOXA10的細(xì)胞(si-HOXA10+anlotinib組)與上述3組細(xì)胞比較,細(xì)胞遷移和侵襲相對數(shù)量明顯降低(均P<0.05),說明敲低HOXA10后安羅替尼對細(xì)胞遷移和侵襲的抑制作用增強。見圖4。

    圖4 敲低HOXA10后安羅替尼對細(xì)胞遷移和侵襲抑制作用增強Fig.4 Anlotinib-induced inhibition of cell migration and invasion is enhanced after HOXA10 knockdown

    2.5 敲低HOXA10促進(jìn)安羅替尼誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡

    流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果(圖5)顯示,8 μg/mL安羅替尼誘導(dǎo)轉(zhuǎn)染si-NC的A549或PC-9細(xì)胞凋亡。未經(jīng)處理的si-NC-A549細(xì)胞凋亡率為(14.14±3.9)%;經(jīng)安羅替尼處理的si-NC-A549細(xì)胞凋亡率為(15.11±4.2)%;未經(jīng)處理的si-HOXA10-A549細(xì)胞凋亡率為(18.63±3.8)%;經(jīng)安羅替尼處理的si-HOXA10-A549細(xì)胞凋亡率為(36.9±4.5)%;未經(jīng)處理的si-NC-PC-9細(xì)胞凋亡率為(16.31±4.2)%;經(jīng)安羅替尼處理的si-NC-PC-9細(xì)胞凋亡率為(16.59±3.7)%;未經(jīng)處理的si-HOXA10-PC-9細(xì)胞凋亡率為(20.78±3.8)%;經(jīng)安羅替尼處理的si-HOXA10-PC-9細(xì)胞凋亡率為(32.31±3.9)%。與對照組相比,相同濃度安羅替尼顯著上調(diào)敲低HOXA10的A549或PC-9細(xì)胞的凋亡率,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.001)。結(jié)果表明,敲低HOXA10促進(jìn)安羅替尼誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

    圖5 敲低HOXA10促進(jìn)安羅替尼誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡Fig.5 Anlotinib-induced apoptosis is enhanced after HOXA10 knockdown

    3 討論

    腫瘤耐藥性在晚期NSCLC患者的治療中幾乎無法避免。盡管第一代酪氨酸激酶抑制劑吉菲替尼、厄洛替尼和??颂婺岬缺蛔C明能夠有效治療NSCLC,但研究[7]發(fā)現(xiàn),在中位治療時間10個月后患者會出現(xiàn)耐藥問題。近年來研究發(fā)現(xiàn),腫瘤耐藥是多種基因共同作用的結(jié)果,鑒定相關(guān)耐藥分子并闡明其作用機制,對增加腫瘤細(xì)胞藥物敏感性、提高臨床療效十分重要。

    HOXA10屬于同源異型盒基因家族,該家族成員多為轉(zhuǎn)錄因子,以高度保守的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域調(diào)控下游目的基因表達(dá)[8]。HOX基因家族許多成員在腫瘤中異常表達(dá),參與調(diào)控腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。HOXA10在多種惡性腫瘤中發(fā)揮促癌基因功能[9-10]。研究[11]發(fā)現(xiàn),HOXA10在NSCLC中高表達(dá),然而其作用機制尚不清楚。本研究通過實時定量PCR檢測NSCLC細(xì)胞中HOXA10表達(dá)水平,結(jié)果表明HOXA10在NSCLC細(xì)胞中呈高表達(dá),與最新臨床樣本分析[12]結(jié)果一致。

    臨床研究[4-5]證實,安羅替尼作為三線抗腫瘤藥物可有效提高晚期NSCLC患者的總生存期。機制研究[13]發(fā)現(xiàn),安羅替尼通過抑制趨化因子CCL2而抑制血管生成,血清CCL2水平是潛在的NSCLC預(yù)后指標(biāo)?;赗NA測序技術(shù)的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析[6]發(fā)現(xiàn),肺癌細(xì)胞中CXC趨化因子配體2(C-X-C motif ligand 2,CXCL2)與安羅替尼耐藥性相關(guān)。在安羅替尼敏感的NCI-H1975細(xì)胞中,安羅替尼可以顯著下調(diào)CXCL2水平;而在耐藥細(xì)胞中,安羅替尼對CXCL2表達(dá)水平無明顯影響。后續(xù)功能實驗[6]驗證了CXCL2對安羅替尼耐藥性的影響。值得注意的是,轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析[6]也發(fā)現(xiàn)HOXA10在安羅替尼敏感細(xì)胞中可被安羅替尼顯著下調(diào),而在耐藥細(xì)胞中無明顯變化,提示HOXA10與NSCLC安羅替尼敏感性相關(guān)。

    與NCI-H1975細(xì)胞相比,A549和PC-9細(xì)胞對安羅替尼的敏感性相對較差。因此,本研究選擇了這2個細(xì)胞系用于研究安羅替尼耐藥性。本研究通過敲低HOXA10,首次探討了其與安羅替尼藥物敏感性的關(guān)系。由于本研究使用了濃度較低的安洛尼替處理細(xì)胞,在對照組未觀察到安羅替尼對細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的明顯抑制作用。而CCK-8和克隆形成實驗證實,敲低HOXA10顯著增加安羅替尼的細(xì)胞毒性,增強其抑制細(xì)胞增殖的作用。Transwell實驗發(fā)現(xiàn),在HOXA10低表達(dá)細(xì)胞中,安羅替尼抑制細(xì)胞遷移和侵襲的能力明顯增強。此外,流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明,敲低HOXA10促進(jìn)安羅替尼誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。由此可見,敲低HOXA10可提高A549和PC-9細(xì)胞對安羅替尼的敏感性。由于腫瘤細(xì)胞耐藥機制比較復(fù)雜,后續(xù)還需要通過動物體內(nèi)實驗進(jìn)一步驗證。

    綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)HOXA10在NSCLC中對增強安羅替尼敏感性起關(guān)鍵作用,為提高安羅替尼治療效果提供了新的思路。

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