多器官功能障礙綜合征患者外周血單個(gè)核細(xì)胞內(nèi)PPARγ和COX-2的關(guān)系*

徐 飛， 喬萬海

1.西安交通大學(xué)附屬3201醫(yī)院急診科(漢中 723000),2.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院急診科(西安710004 )

主題詞 多器官功能衰竭/病理生理學(xué) 過氧化物酶體增殖物激活受體γ/分析 環(huán)氧合酶2/分析 單核細(xì)胞

多器官功能障礙綜合征(Multiple organ dysfunction syndrome,MODS)發(fā)病率及病死率很高，還沒有令人滿意的治療措施。很多研究表明炎性因子在MODS的發(fā)生發(fā)展中起決定性作用。持續(xù)高水平存在的炎性因子提示發(fā)生MODS的可能性大大增加。涉及MODS的炎性因子種類很多，相互之間作用復(fù)雜，呈現(xiàn)出“網(wǎng)絡(luò)性”的特點(diǎn)。因此，治療MODS的熱點(diǎn)就集中在如何調(diào)節(jié)炎癥因子，阻斷炎癥的發(fā)展。當(dāng)前，過氧化物酶體增殖物激活受體(Peroxisome proliferater-activated receptor，PPARs)在MODS發(fā)病機(jī)制中起的作用日益受到關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)PPAR作用的范圍很廣，在脂類代謝、糖代謝，細(xì)胞的增殖、分化、凋亡，創(chuàng)傷愈合及炎癥中均發(fā)揮非常重要的作用。PPARs[1]包括PPARα、PPARβ和PPARγ3種亞型。在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)PPARγ及其配體在細(xì)胞的分子水平上具有調(diào)控炎癥反應(yīng)及免疫應(yīng)答的作用，PPARγ通過調(diào)節(jié)COX-2的活化來實(shí)現(xiàn)對各類免疫因子進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)作用。環(huán)氧合酶(Cyclooxygenase，COX)是前列腺素(PGS)合成過程中一個(gè)關(guān)鍵的限速酶，它能夠?qū)⒒ㄉ南┧岽x為各種前列腺素產(chǎn)物，參與機(jī)體重要生理活動(dòng)。環(huán)氧合酶(COX)主要有COX - 1(Cyclooxygenase-1，COX-1)和COX - 2(Cyclooxygenase-2，COX-2)兩種異構(gòu)體。COX-1在各種組織中微量表達(dá)，使細(xì)胞結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，參與機(jī)體正常生理活動(dòng)。COX -2屬于誘導(dǎo)型酶，正常組織中不表達(dá)或微量表達(dá)，但在機(jī)體遭遇“嚴(yán)重創(chuàng)傷、感染、休克”等刺激因素時(shí)，COX-2的表達(dá)快速增加[2]，誘導(dǎo)多種PGs的合成，導(dǎo)致機(jī)體的炎癥反應(yīng)被放大及連續(xù)發(fā)展，同時(shí)COX-2被激活后可以抑制TNF-α等細(xì)胞因子的釋放，具有抗炎作用。花生四烯酸通過COX-2生成的代謝產(chǎn)物15-去氧-△-(12，14)前列腺素J2(15d-PGJ2)，是PPARγ最重要的內(nèi)源性天然配體，與PPARγ結(jié)合，通過抑制COX-2的活性，從而抑制各種炎癥因子的表達(dá)，其合成受COX-2的調(diào)控；另外，15d-PGJ2能夠與核內(nèi)的PPARγ受體相結(jié)合，通過PPARγ-COX-2負(fù)反饋通路下調(diào)COX-2的活性。

資料與方法

1 一般資料 選擇2015年1月至2017年1月在本院ICU的MODS患者60例為實(shí)驗(yàn)組。按患者急性生理學(xué)與慢性健康狀況評分系統(tǒng)Ⅱ(APACHEⅡ)評分分為MODS1組(APACHEⅡ評分0～10分)，MODS 2組(APACHEⅡ評分11～20分)，MODS 3組(APACHEⅡ評分>20分)三組，每組20例。以同期20例年齡、性別、體質(zhì)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差別的本院健康體檢人群作為健康對照組。60例MODS患者均符合2001年國際膿毒癥會議關(guān)于MODS的診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①不符合MODS診斷標(biāo)準(zhǔn)；②年齡<18歲，孕婦或哺乳期婦女；③服用抗腫瘤藥物、接受放、化療，使用免疫抑制劑等治療患者，白血病、淋巴瘤、艾滋病、白細(xì)胞減少癥患者。60例MODS患者，男36例，女24例，平均年齡(56.7±13.2歲)；20例健康對照組體檢人群中，男10例，女10例,平均年齡(51.8±12.48歲)。本研究符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，獲得醫(yī)院倫理委員會審核批準(zhǔn)。

2 主要試劑和儀器 ①人外周血淋巴細(xì)胞分離液 (北京市生物制品科技有限公司)；②mRNA檢測：RNA總RNA抽提試劑盒、二步法RT-PCR試劑盒、AMVcDNA第一鏈合成試劑盒、即用PCR擴(kuò)增試劑盒均購自先鋒技術(shù)有限責(zé)任公司Taq DNA聚合酶、PCR Markers( Promega,美國)；TDL-40B型離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)，攝影顯微鏡(OLYMPUS-BH-2)(日本Olymapus公司)，臺式冷凍高速離心機(jī)(Haerus，西德)，紫外分光光度計(jì)(Gene Quant pro英國 )超低溫冰箱 (Sanyo日本)DNA熱循環(huán)儀(Perkin Elmer，美國)，凝膠成像系統(tǒng) (Bio-RAD Laboratories-Segrate意大利)

3 檢測指標(biāo)及方法

3.1 標(biāo)本采集：所有患者于確診后1d、3d、6d分別抽取外周靜脈血2ml，用于檢測PPARγ和COX-2mRNA表達(dá)水平。健康對照組20例于體檢當(dāng)日抽取2ml靜脈血檢測。

3.2 外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)分離：采用Ficoll密度梯度法分離出外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，將分離出的單個(gè)核細(xì)胞加入1ml裂解液-70℃凍存，待一次測定。

3.3 總RNA提?。翰捎肦NA抽提試劑盒提取總RNA，按說明書步驟操作。用紫外分光光度計(jì)測定總RNA的吸光度值(A260/A280)，結(jié)果均在1.8～2.0，說明所提取的RNA純度高。

3.4 PPARγ、COX-2表達(dá)測定：PPARγ上游引物(5’-3’)：TCCACCTTATTATTCTG；下游引物(5’-3’)：ATTTGTCTGTTGTCTTTCC。內(nèi)參β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)上游引物(5’-3’)： -ATCGTGCGTGACATTAAGGAG-A下游引物(5’-3’)：-AGGAAGGAAGGCTGGAAGAGTG-。COX-2上游引物(5’-3’)：5’-TGGTCTGGTGCCTGGTCTGg-3’；下游引物(5’-3’)： -CTGCCTGCTCTGGTCAATGG-3；(引物序列由北京奧科生物科技公司合成)。在PCR儀上進(jìn)行RT-PCR?？傮w積77.4μl：2×Taq PCR MasterMix 25μl，ddH2O 50μl，PPARγ或β-actin上下游引物各1.0μl，cDNA模板0.4μl。PCR反應(yīng)條件：94°C 4min預(yù)變性，94°C 30sec，55°C 30sec，72°C 30sec，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)。吸取RT-PCR反應(yīng)產(chǎn)物5μl，與1μl DNA上樣緩沖液充分混合均勻。1.8%瓊脂糖凝膠上80v恒壓電泳45min，0.5μg/ml溴化乙啶溶液中染色10 min。電泳完畢后，紫外燈下觀察結(jié)果，并進(jìn)行照像。

3.5 圖像采集分析：應(yīng)用BIO-PROFIF圖像分析系統(tǒng)行灰度掃描，將各組β-actin條帶的掃描值做為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算PPARγmRNA/β-actin、NF-kBp65mRNA/βactin吸光度比值，記錄PPARγmRNA、 COX-2p65mRNA的相對表達(dá)量。

結(jié) 果

1 PBMCs中PPARγ mRNA表達(dá)量的變化 見表1。PBMCs中PPARγ mRNA表達(dá)量較少，與正常組比較，MODS1組PPARγ mRNA表達(dá)隨時(shí)間推移越來越高，至第6天達(dá)峰值(P<0.05；P<0.01)，以此類推。MODS2組、MODS3組PPARγ mRNA的表達(dá)隨時(shí)間越來越低，至第6天降至最低(P<0.05；P<0.01)。同時(shí)間點(diǎn)PPARγ mRNA的表達(dá)在MODS3組與MODS2組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；MODS2組、MODS3組與MODS1組比較有差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 PBMCsPPARγ mRNA在不同組表達(dá)

注：與正常對照組比較，*P<0.05 ，△P<0.01； 與MODS1組比較，#P<0.05

2 PBMCs中COX-2 mRNA表達(dá)量的變化 見表2。正常組外周血單個(gè)核細(xì)胞中COX-2mRNA表達(dá)量較少，與正常組比較，MODS1組COX-2 mRNA表達(dá)隨時(shí)間推移越來越低，至第6天降至最低(P<0.05；P<0.01)，以此類推，MODS2組、MODS3組COX-2mRNA的表達(dá)隨時(shí)間推移越來越高，至第6天達(dá)峰值(P<0.05；P<0.01)。同時(shí)間點(diǎn)COX-2 mRNA的表達(dá)在MODS3組與MODS2組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；MODS2組、MODS3組與MODS1組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05) 。

表2 PBMCsCOX-2mRNA在不同組表達(dá)

注：與正常對照組比較，△P<0.01 ； 與MODS1組比較，#P<0.05

3 PPARγ與COX-2相關(guān)性分析 PBMCs中PPARγ與COX-2的表達(dá)在MODS1組，MODS2組，MODS3組呈負(fù)相關(guān)性(MODS1組r=-0.761，P<0.01 ；MODS2組：r=-0.782，P<0.01；MODS3組r=-0.791，P<0.01)。在正常對照組無明顯相關(guān)性(r=0.183，P>0.05)。

討論

多器官功能障礙綜合征(MODS)是患者機(jī)體受到嚴(yán)重感染及創(chuàng)傷等損害后序貫出現(xiàn)的2個(gè)或2個(gè)以上器官或系統(tǒng)功能障礙的臨床綜合癥[3]。MODS發(fā)病兇險(xiǎn)，機(jī)制復(fù)雜，致死率高。目前研究認(rèn)為，炎性介質(zhì)的大量釋放形成放大的、失控的炎癥“瀑布樣”的連鎖反應(yīng)，使器官功能損害，最終發(fā)生MODS。

越來越多的研究表明，PPARγ在調(diào)控炎癥反應(yīng)的過程中扮演非常重要的角色。有關(guān)PPARγ抗炎作用的研究發(fā)現(xiàn)PPARγ通過抑制NF-κB的活化來實(shí)現(xiàn)對各類免疫因子抑制。研究發(fā)現(xiàn)，PPARγ配體可以阻止單核-巨噬細(xì)胞發(fā)生炎癥反應(yīng)，生成抗炎與(或)脫敏的表型。PPARγ已經(jīng)成為調(diào)控單核細(xì)胞基因表達(dá)的新靶點(diǎn)[4]。許多研究[5]證明，PPARγ發(fā)生活化后能夠和NFAT及COX-2產(chǎn)生物理作用，以阻斷其下游轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)活化。

本研究顯示：MODS1組PPARγ表達(dá)水平高于正常對照組(P<0.05)，隨著治療時(shí)間增加，PPARγ的表達(dá)水平隨病情好轉(zhuǎn)進(jìn)一步升高。而MODS2組、MODS3組PPARγ的表達(dá)水平低于正常對照組(P<0.05)，PPARγ的表達(dá)水平隨病情加重而降低，表明PPARγ的表達(dá)與MODS的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。MODS發(fā)生早期PPARγ表達(dá)升高，此過程對機(jī)體有益，炎癥被抑制，器官功能好轉(zhuǎn)。隨著病情加重，PPARγ表達(dá)進(jìn)行性下降，炎癥因子失控性釋放，臟器功能損傷進(jìn)一步加重。證實(shí)了PPARγ在MODS中具有阻斷炎癥反應(yīng)，保護(hù)臟器功能的作用。

研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)氧化酶(Cyclooxygenase)是一類重要的限速酶，使花生四稀酸(AA)被分解為前列腺素類物質(zhì)，是炎癥反應(yīng)的中心環(huán)節(jié)。其中一種產(chǎn)物15d-PGJ2，是PPARγ非常重要的天然配體，能夠與PPARγ結(jié)合抑制炎癥反應(yīng)，其合成受COX-2的調(diào)控[4]。COX-2的高表達(dá)能夠增加15d-PGJ2合成，經(jīng)過激活PPARγ，抑制NF-κB而表現(xiàn)出抗炎的作用，另一方面， 15d-PGJ2與PPARγ的受體相接合，通過PPARγ-NF-κB負(fù)反饋通路，使COX-2活性下調(diào)[4]。因此COX-2具有雙重功能。

研究表明，COX-2與PPAR-γ呈負(fù)相關(guān)。COX-2是NF-κB 的下游調(diào)控物質(zhì)。PPAR-γ能抑制NF-κB，進(jìn)而抑制TNF-α、COX-2的表達(dá)。更多的研究表明，在MODS中，PPAR-γ能夠抑制COX-2的表達(dá)及前列腺素2(PGE2)的生成。Bren-Mattison[5]研究表明，PPAR-γ通過激活過氧化物酶體增殖子反應(yīng)元件(PTEN)和抑制蛋白酶B(Akt)兩種途徑，抑制NF-κB的表達(dá)，并下調(diào)COX-2的表達(dá)，二而一之該途徑的胰島素抵抗，肝內(nèi)脂肪沉積。Inoue等[6]報(bào)道，COX-2催化產(chǎn)生的PGD2的代謝產(chǎn)物15d-PGJ2是體內(nèi)最強(qiáng)大的內(nèi)源性PPAR-γ配體。當(dāng)COX-2表達(dá)降低時(shí)，15d-PGJ2的產(chǎn)生下降，使PPARγ的作用減弱。COX-2 是15d-PGJ2合成過程中的重要限速酶，而15d-PGJ2又是PPAR -γ 的天然配體，這提示 PPAR-γ 可能作為 COX-2的下游基因參予疾病的過程[7]。PPAR-γ 激活抑制炎癥反應(yīng)的機(jī)制主要是通過抑制 NF-κB 活化，從而抑制多種細(xì)胞因子和炎癥因子(如 IL-1，IL-8，TNFα等)表達(dá)[8]。它還可通過反饋機(jī)制調(diào)控 COX-2 的表達(dá)[9]。在本次研究中，正常對照組中COX-2含量及其mRNA表達(dá)均明顯低于MODS患者，而且存活患者明顯低于死亡患者，說明細(xì)胞內(nèi)COX-2含量與病情輕重有緊密聯(lián)系。COX-2基因上含有NF-κB的結(jié)合位點(diǎn)，LPS，TNF-α，自由基等外界因素可激活NF-κB，NF-κB與COX-2基因位點(diǎn)結(jié)合后導(dǎo)致COX-2的表達(dá)增加。NF-κB是介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄的樞紐，參與了機(jī)體防御功能、炎性反應(yīng)等有關(guān)的早期應(yīng)答調(diào)控。因此，對NF-κB及其靶基因COX-2活化過程的研究，成為許多疾病重要的治療手段[10]，

本研究顯示：MODS1組COX-2的表達(dá)水平高于正常對照組(P<0.05)，隨著治療時(shí)間增加，COX-2的表達(dá)水平隨病情好轉(zhuǎn)而降低。提示COX-2通過其下游產(chǎn)物15d-PGJ2參與了MODS的發(fā)生，發(fā)展。15d-PGJ2是PPARγ最強(qiáng)的天然配體， PPARγ表達(dá)升高，從而阻斷炎癥的瀑布效應(yīng)，抑制炎癥因子的釋放，反饋抑制COX-2的活性，器官功能受損減輕，表明COX-2有減輕MODS患者多器官功能不全的作用。而MODS2組、MODS3組COX-2的表達(dá)水平明顯高于正常對照組(P<0.01)。隨著病情進(jìn)展，COX-2表達(dá)進(jìn)行性升高，炎癥因子失控性釋放，臟器功能損傷進(jìn)一步加重。

PPARγ的抗炎特性已經(jīng)被人們廣泛的接受，提示PPARγ在防治MODS上具有重要的作用。本研究基于課題組以往的實(shí)驗(yàn)研究[11]，再次探討了PPARγ、COX-2在MODS患者不同階段的相互作用機(jī)制，但由于臨床研究過程中各種治療藥物的干預(yù)以及無法使用激動(dòng)劑，拮抗劑等諸多條件限制，PPARγ、COX-2等炎癥因子在人體內(nèi)的關(guān)系及作用仍很復(fù)雜，研究仍較局限。還有很多未知領(lǐng)域值得我們進(jìn)一步臨床研究來證實(shí)其作用，以更好的應(yīng)用于臨床。