均勻設(shè)計法優(yōu)化紅棗紅色素的提取及其穩(wěn)定性研究

羅璇，李嬋娟，田喆

(武漢設(shè)計工程學(xué)院 食品與生物科技學(xué)院，武漢 430205)

紅棗紅色素是一種天然生物色素，不僅安全無毒、色澤自然，可作為保健食品和化妝品等領(lǐng)域重要的添加劑，而且含有較高的營養(yǎng)價值和藥用價值。研究表明：紅棗紅色素對某些氧化劑和還原劑均有良好的穩(wěn)定作用，是一種理想的食品添加劑與藥用原料[1,2]。均勻?qū)嶒?yàn)設(shè)計是基于不需考慮“整齊可比”，而讓實(shí)驗(yàn)點(diǎn)在實(shí)驗(yàn)的范圍內(nèi)可充分考慮“均勻分散”的一種穩(wěn)健設(shè)計，所以，最大的特點(diǎn)是可節(jié)省大量的實(shí)驗(yàn)工作量，避免偶然性誤差，尤其是在實(shí)驗(yàn)因素的水平較多時，其優(yōu)勢更加明顯[3,4]。

采用均勻設(shè)計法對紅棗紅色素的提取優(yōu)化和用正交實(shí)驗(yàn)對紅棗紅色素的穩(wěn)定性做系統(tǒng)研究國內(nèi)尚未見報道，本文在前人實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上借鑒其他色素的粗提取優(yōu)化和穩(wěn)定性研究方法，設(shè)計完善的實(shí)驗(yàn)方案，對紅棗紅色素的提取優(yōu)化和穩(wěn)定性進(jìn)行了更深入的研究，為保存天然色素提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)原料與輔料

紅棗：市售，干紅棗，購于中百超市，產(chǎn)地浙江金華。

1.1.2 試劑

石油醚、乙醚酮：分析純，天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；L-抗壞血酸：化學(xué)純，武漢市華順生物技術(shù)有限公司；NaOH、HCl、乙酸乙酯、雙氧水：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 儀器

752B型紫外可見分光光度計 天津市普瑞斯儀器有限公司；TG-16WS臺式高速離心機(jī) 長沙湘智離心機(jī)儀器有限公司； HH-S2/HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市醫(yī)療儀器廠/國華電器有限公司；OH6-907385-Ⅲ電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司； SZ-93自動雙重純水蒸餾器 上海亞榮生化儀器廠； JA2003B電子天平 上海越平科學(xué)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 原料的預(yù)處理

選擇飽滿、完整的紅棗去核，在60 ℃電熱鼓風(fēng)干燥箱中烘干后粉碎，過60目篩，標(biāo)號，放在干燥器中儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 紅棗紅色素提取率的計算[5-7]

在最佳的提取條件組合下，多次提取一定量的紅棗紅色素，直到最后一次提取液呈無色(吸光度<0.01)，分別收集各次的色素提取液并測定其體積(Vi)和吸光度(Ai)計算出提取級數(shù)。

提取率(%)=(Ai×Vi/A1×V1+ …+An×Vn)×100%(i=1…n)。

式中：Ai為提取色素溶液的吸光值；Vi為提取色素溶液的體積(mL)。

1.2.3 紅棗紅色素提取單因素實(shí)驗(yàn)條件

將紅棗粉溶于一定濃度的NaOH溶液，于50 ℃水浴中密閉恒溫浸提2 h。速冷后，以4000 r/min離心20 min。吸取1 mL色素溶液，稀釋25倍，在波長為330 nm處測吸光度值。單因素實(shí)驗(yàn)因素水平條件見表1。

表1 溶劑提取單因素實(shí)驗(yàn)因素水平Table 1 Factors and levels of single-factor experiment

1.2.4 均勻設(shè)計實(shí)驗(yàn)方法

本均勻設(shè)計實(shí)驗(yàn)的目的是確定紅棗紅色素的最優(yōu)因素組合水平。確定NaOH為提取劑，考察提取劑的濃度(x1)、料液比(x2)、提取時間(x3) 、提取溫度(x4) 4個因素，每個因素取值范圍為t個水平(t為實(shí)驗(yàn)次數(shù))，4個因素的一次項(xiàng)及二次項(xiàng)各有4項(xiàng)，4項(xiàng)因素間的兩兩交互作用設(shè)有6項(xiàng)，共14項(xiàng)，實(shí)驗(yàn)數(shù)不能小于14，本實(shí)驗(yàn)選用U17(178)表。本實(shí)驗(yàn)為4因素，這4個因素安排在均勻表的1，5，7，8列，去掉U17(178)的最后一行，實(shí)驗(yàn)方案見表2和表3，最后各管取1 mL于25 mL的比色管中，測量吸光度。

表2 U17(178)均勻設(shè)計使用表Table 2 Uniform design table of U17(178)

表3 均勻表U17(178)Table 3 Uniform table of U17(178)

1.2.5 紅棗紅色素穩(wěn)定性單因素實(shí)驗(yàn)

光因素穩(wěn)定性：稱取1 g紅棗粉，在NaOH提取液為0.2 mol/L，料液比為1∶20 (g/mL)，溫度為50 ℃條件下提取1 h，離心后得到紅棗紅色素粗提液，然后取紅棗紅色素粗提液3份，每份6 mL，每份吸取1 mL分裝不同的試管中，然后加3 mL蒸餾水稀釋，分別置于室內(nèi)避光處、室內(nèi)散射光處、室外日光下，定時取樣測其吸光度。

熱因素穩(wěn)定性：取紅棗紅色素粗提液3份，每份6 mL，加入2 mL緩沖溶液，吸取1 mL，然后加3 mL蒸餾水稀釋，置于0，25，40，80，90，100 ℃保溫1，2，3，4，5 h，取樣冷卻后測其吸光度。

氧化劑因素穩(wěn)定性：選用雙氧水作為氧化劑。雙氧水原溶液(30%)稀釋成0.6%和1.2%的溶液，吸取2 mL加入6 mL紅棗紅色素溶液中，置于室溫下避光1，2，3天，稀釋3倍，在330 nm的波長下測定吸光度值。

防腐劑因素穩(wěn)定性：選用抗壞血酸作為防腐劑，配制成0.1%和1%的抗壞血酸后，吸取2 mL加入6 mL紅棗紅色素溶液中，置于室溫下避光1，2，3，4，5，6天，稀釋適當(dāng)?shù)谋稊?shù)，用同濃度的抗壞血酸鈉溶液做參比，在330 nm的波長下測定吸光度值。

1.2.6 紅棗紅色素穩(wěn)定性正交實(shí)驗(yàn)

穩(wěn)定性影響因素光、熱和抗壞血酸分別用A，B，C表示，采用3因素3水平正交實(shí)驗(yàn)。根據(jù)9個組合條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并依次記錄實(shí)驗(yàn)的吸光度，見表4。

表4 紅棗紅色素穩(wěn)定性正交表Table 4 Orthogonal table of stability of red pigment from red jujube

2 結(jié)果與分析

2.1 提取劑的選擇

表5 不同提取劑的提取效果Table 5 The extraction effect of different extraction agents

注：此次實(shí)驗(yàn)中氫氧化鈉、鹽酸的濃度均為0.2 mol/L。

圖1 不同提取劑的提取效果Fig.1 The extraction effect of different extraction agents

由表5可知，無水乙醇提取為淺黃色，說明紅棗紅色素微溶于酒精；乙醚、乙酸乙酯、石油醚幾乎無色，說明紅棗紅色素難溶于這3個有機(jī)溶劑，由圖1可知，紅棗紅色素不溶于石油醚，紅棗紅色素在蒸餾水中溶解度較大，而鹽酸對紅棗紅色素的溶解度比蒸餾水大，因此，可以得出鹽酸有助于紅棗紅色素的浸出。NaOH(0.2 mol/L)提取的顏色為紅褐色，與紅棗的顏色相近，結(jié)合圖1各種提取劑的提取效果圖，得出在本實(shí)驗(yàn)中所選的提取劑中氫氧化鈉提取效果最好，所以，本實(shí)驗(yàn)提取劑采用氫氧化鈉溶液作為棗粉的紅色素提取溶劑。

2.2 色素提取單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

紅棗紅色素的提取是一個復(fù)雜的過程，主要的影響因素有提取溶劑的種類和濃度、料液比、提取溫度和時間等。為了減少后續(xù)主參數(shù)試驗(yàn)和結(jié)果分析的工作量，本研究首先分別進(jìn)行了相關(guān)單因素實(shí)驗(yàn)， 獲得了紅棗紅色素提取液吸光度最高和提取效果最好的提取溶劑為0.2 mol/L的NaOH溶液，料液比為1∶20 (g/mL)，提取時間為5 h，提取溫度為80 ℃。

圖2 提取劑的濃度對紅棗紅色素提取的影響Fig.2 The effect of concentration of extractant on the extraction of red pigment from red jujube

圖3 料液比對紅棗紅色素提取的影響Fig.3 The effect of solid-liquid ratio on the extraction of red pigment from red jujube

圖4 提取時間對紅棗紅色素提取的影響Fig.4 The effect of extraction time on the extraction of red pigment from red jujube

圖5 提取溫度對紅棗紅色素提取的影響Fig.5 The effect of extraction temperature on the extraction of red pigment from red jujube

2.3 優(yōu)因素水平組合的確定

采用均勻設(shè)計實(shí)驗(yàn)得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表6。

表6 均勻設(shè)計法結(jié)果Table 6 Results of uniform design method

首先建立一次回歸方程，利用SAS軟件對表6中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行擬合，運(yùn)行結(jié)果得出R2達(dá)到0.9937，說明了x可以解釋y的程度達(dá)到了99.37%，解釋了絕大部分信息，說明模型正確。從總體的P值都遠(yuǎn)小于0.05，可知模型是顯著的。由各變量的P值可以得出在0.05的水平下x1，x2，x3，x4非常顯著，顯著結(jié)果見表7。從而得到以吸光度為因變量，以NaOH的濃度、料液比、提取溫度、提取時間4個因素為自變量的回歸方程：y=11.71465284+21.11564674x1-0.48066931x2-0.08376224x3+0.44222659x4。

根據(jù)回歸方程系數(shù)的絕對值，得到影響紅棗紅色素提取因素的效應(yīng)是x1>x2>x4>x3，由此可以說明NaOH的濃度對紅棗紅色素的提取影響最大，其次是料液比，提取溫度在50～90 ℃范圍內(nèi)影響最小。此外，對表7建立一次回歸方程，由于未通過檢驗(yàn)，再次補(bǔ)做贅述。

表7 均勻設(shè)計法一次回歸模型方差數(shù)據(jù)分析結(jié)果Table 7 Analysis results of variance data of a regression model of uniform design method

對表7的數(shù)據(jù)進(jìn)行極差分析，繪出實(shí)驗(yàn)因素與指標(biāo)值的關(guān)系曲線，見圖6。

圖6 因素水平與提取效果趨勢Fig.6 Factors,levels and extraction effect trends

由圖6可知，紅棗紅色素提取優(yōu)化因素組合為X15X24X32X44(其中，下標(biāo)中的首數(shù)字表示因素，第2個數(shù)字表示該因素中的水平編碼)，即NaOH的濃度為0.5 mol/L，料液比為1∶25 (g/mL)，溫度為60 ℃，提取時間為5 h。根據(jù)提取率計算公式得出：提取級數(shù)為3級，提取率為93.11%。

2.4 穩(wěn)定性單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 光照對紅棗紅色素穩(wěn)定性的影響

圖7 光照對紅棗紅色素的穩(wěn)定性的影響Fig.7 Effect of illumination on the stability of red jujube red pigment

由圖7可知，隨著光照時間的延長，紅棗色素的吸光值有所下降，但是下降不是很明顯，所以，紅棗色素對于光具有一定的穩(wěn)定性。

2.4.2 氧化劑對紅棗紅色素穩(wěn)定性的影響

圖8 氧化劑雙氧水對紅棗紅色素穩(wěn)定性的影響Fig.8 Effect of oxidant hydrogen peroxide on thestability of red jujube red pigment

由圖8可知，氧化劑對紅棗紅色素的影響非常大。肉眼觀察也非常明顯，在很短的時間就將紅棗紅色素氧化成無色。并且氧化劑的濃度增加，氧化速度明顯增加。因此，紅棗紅色素的抗氧化性比較差，保存的時候應(yīng)防止氧化。

2.4.3 溫度對紅棗紅色素穩(wěn)定性的影響

圖9 溫度對紅棗紅色素穩(wěn)定性的影響Fig.9 Effect of temperature on the stability of red jujube red pigment

由圖9可知，紅棗紅色素隨溫度的上升略有增加，顏色略有加深，但增加不大。溫度對紅棗紅色素的影響較小。

2.4.4 抗壞血酸對紅棗紅色素穩(wěn)定性的影響

圖10 抗壞血酸對紅棗紅色素穩(wěn)定性的影響Fig.10 Effect of ascorbic acid on the stability of red jujube red pigment

由圖10可知，抗壞血酸對紅棗紅色素提取液穩(wěn)定性有顯著的影響，但抗壞血酸的濃度對穩(wěn)定性的變化不大，在保存紅棗紅色素的過程中應(yīng)避免接觸抗氧化劑抗壞血酸。

2.5 紅棗紅色素穩(wěn)定性影響優(yōu)化的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)紅棗紅色素穩(wěn)定性單因素實(shí)驗(yàn)，得出雙氧水對紅棗紅色素具有氧化性，為了得到紅棗紅色素在室溫附近的最佳保存條件，對因素光、熱、防腐劑抗壞血酸的量這3個因素進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，見表8。

表8 紅棗紅色素穩(wěn)定性影響優(yōu)化的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 8 Effect of red jujube pigment stability on optimization of orthogonal experiments

注：A 表示光照，B 表示溫度，C表示抗壞血酸。

由表8可知，抗壞血酸的極值R最大，熱的極值R最??；各因素對紅棗紅色素穩(wěn)定性的影響大小為抗壞血酸>光>溫度，3個因素的優(yōu)水平組合是A1B1C1，即：光為陰暗避光處，熱為40 ℃，不需要添加抗氧化劑抗壞血酸。

3 結(jié)論

在紅棗紅色素提取的均勻設(shè)計實(shí)驗(yàn)中，對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)建立一次回歸方程，通過SAS軟件得出Y=11.71465284+21.11594674X1-0.4806693X2-0.0837622X3+0.44222659X4，R2=0.9937，各變量的P值亦通過檢驗(yàn)，說明模型正確，結(jié)果表明：影響紅棗紅色素提取效果的諸因素的主次順序?yàn)樘崛舛?提取料液比>提取時間>提取溫度，且提取劑濃度、提取的料液比、提取時間都是影響紅棗紅色素提取的顯著因素。紅棗紅色素提取的優(yōu)因素水平組合為NaOH的濃度為0.5 mol/L，料液比為1∶25 (g/mL)，溫度為60 ℃，提取時間為5 h。提取級數(shù)為3級，最高提取率為93.11%。紅棗紅色素提取條件模型的擬合度高。

紅棗紅色素的穩(wěn)定性研究表明：光、溫度、抗壞血酸量3個因素對紅棗紅色素穩(wěn)定性的影響大小為抗壞血酸>光>熱量。40 ℃陰暗避光處，無抗壞血酸的環(huán)境是紅棗紅色素最佳穩(wěn)定貯存條件。