響應(yīng)面優(yōu)化銅藻(Sargassum horneri)中 褐藻多酚的提取及其結(jié)構(gòu)鑒定

王育信,田曉清,李驕洋,屠璐丹,譚淑云,吳文惠,3,包 斌,3,*

(1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院,上海 201306; 2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所,上海 200090; 3.上海海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心,上海 201306)

銅藻(Sargassumhorneri)俗稱 “丁香屋”,屬褐藻綱墨角藻目馬尾藻科馬尾藻屬,是一種經(jīng)濟(jì)型大型褐藻[1]。銅藻主要分布于遼寧、浙江、福建和廣東等沿海地區(qū),在醫(yī)藥、食品、飼料中有較高的應(yīng)用價(jià)值[2]。據(jù)《中華本草》和《廣東中藥志》記載,銅藻可用于治療水腫、咳嗽、甲狀腺腫大等疾病。除多糖、蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)和脂類等營(yíng)養(yǎng)成分外,銅藻中還含有萜類化合物、褐藻多酚等活性物質(zhì)[3]。其中褐藻多酚(Phlorotannins)是一類間苯三酚(Phloroglucinol)的聚合物,主要存在于褐藻中,是細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)成分。迄今為止已被鑒定的褐藻多酚有近百種。褐藻多酚具有多種活性,如抗氧化性、抗菌性、抗病毒性、抗炎癥、抗腫瘤性、抗凝血性、抗糖尿病綜合癥和保護(hù)肝臟等活性[4-10]。因此從褐藻中提取得到褐藻多酚作為一種天然活性成分,具有成為新型藥物和健康產(chǎn)品的巨大潛力[11]。有學(xué)者采用70%的乙醇溶液直接抽提后,分析銅藻多酚提取物中總酚含量[12];盧虹玉等[13]在室溫條件下采用80%的甲醇溶液直接提取全緣馬尾藻干粉,分別分析了水相萃取物和乙酸乙酯相萃取物中總酚含量;Sugiura等[9]在5 ℃下采用甲醇直接提取48 h,分別分析了昆布多酚粗提物和昆布乙酸乙酯萃取物中的總酚含量,而從銅藻中提取并分析褐藻多酚還未見(jiàn)報(bào)道。

本文采用超聲輔助提取法,以褐藻多酚得率為指標(biāo),結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)分析法分析乙醇體積分?jǐn)?shù)、液固比、超聲提取時(shí)間三個(gè)因素,并通過(guò)響應(yīng)面分析得出褐藻多酚最佳提取條件,并采取液相色譜儀聯(lián)用四級(jí)桿串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(LC-TOF-MS)對(duì)分離萃取后的樣品中褐藻多酚進(jìn)行了初步分析鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

銅藻(Sargassumhorneri) 由上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院提供;薄層層析硅膠 粒度200～300目,青島海洋化工廠分廠;間苯三酚、2,4-二甲氧基苯甲醛 光譜純,均購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司;無(wú)水碳酸鈉、Folin-Ciocalteu試劑、無(wú)水乙醇、乙酸乙酯、冰醋酸、鹽酸 分析純,均購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司;水 蒸餾水。

SH-1000 Lab酶標(biāo)儀 CORONA;ATX224型電子天平 日本島津公司;1290LC-6224型LC-TOF-MS 安捷倫科技有限公司;CR-21G型冷凍高速離心機(jī) 株式會(huì)社日立制作所;DZF-6030型真空干燥箱 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司;DHG-9070A型鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;SB4200DT型超聲清洗機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品前處理 將新鮮銅藻用清水洗滌,去除雜質(zhì)沙泥,紗布濾干后55 ℃烘干,研磨過(guò)120目篩,細(xì)粉置陰涼干燥處備用。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 對(duì)影響褐藻多酚超聲提取的乙醇體積分?jǐn)?shù)、液固比以及超聲提取時(shí)間進(jìn)行單因素試驗(yàn),超聲功率為400 W。精確稱取銅藻干粉1 g,在液固比為30∶1 mL/g,超聲提取時(shí)間75 min的條件下,探討不同乙醇體積分?jǐn)?shù)(0%、20%、40%、60%、80%、95%)對(duì)銅藻中褐藻多酚得率的影響;在乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%,超聲提取時(shí)間75 min,探討液固比(10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1 mL/g)對(duì)銅藻褐藻多酚得率的影響;在乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%,液固比為40∶1 mL/g,探討超聲提取時(shí)間(15、30、45、60、75 min)對(duì)銅藻褐藻多酚得率的影響;收集殘?jiān)⒎磸?fù)提取3次,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后定容至50 mL。

1.2.3 褐藻多酚的響應(yīng)面試驗(yàn) 根據(jù)單因素分析結(jié)果,響應(yīng)面試驗(yàn)采用銅藻干粉1 g;選用乙醇體積分?jǐn)?shù)、液固比以及超聲提取時(shí)間作為試驗(yàn)因素,以褐藻多酚得率作為響應(yīng)面值,設(shè)計(jì)三因素三水平17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)5個(gè)中心點(diǎn)的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn),響應(yīng)面因素間水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面分析因素及水平Table 1 Analytical factors and levels for response surface methodology

1.2.4 褐藻多酚得率的測(cè)定(DMBA法) 參照文獻(xiàn)[14-16]方法略有改動(dòng)。配制濃度為0、0.005、0.01、0.05、0.1、0.15 mg/mL的間苯三酚標(biāo)準(zhǔn)溶液。吸取50 μL樣品與標(biāo)準(zhǔn)溶液于96孔板中,加入125 μL的6%鹽酸冰醋酸溶液,5 min后樣品及標(biāo)準(zhǔn)曲線加入125 μL的2% 2,4-二甲氧基苯甲醛冰醋酸溶液,樣品空白加入125 μL的冰醋酸。放置1 h,在520 nm處測(cè)吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(y=18.805x+0.0031,R2=0.9999)得到褐藻多酚得率(mg/mL)并計(jì)算得率。

褐藻多酚得率的計(jì)算公式如下:

式中:M1:褐藻多酚的含量(mg);m0:銅藻干粉的質(zhì)量(g)。

1.2.5 總酚的測(cè)定 參照Folin-Ciocalteu法[17],配制為0、6.25、12.5、25、50、100 μg/mL 的間苯三酚標(biāo)準(zhǔn)溶液。吸取20 μL樣品于標(biāo)準(zhǔn)溶液于96孔板中,樣品及標(biāo)準(zhǔn)溶液加入100 μL的Folin-Ciocalteu試劑,混勻8 min后加入7.5%的碳酸鈉溶液。樣品空白加入180 μL的蒸餾水。蒸餾水200 μL為校準(zhǔn)。避光放置2 h后,在730 nm 處測(cè)吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(y=0.0059x+0.0057,R2=0.9995)得到總酚得率(g/mL)并計(jì)算得率。

總酚得率的計(jì)算公式如下:

式中:M2:總酚的含量(g);m1:銅藻干粉的質(zhì)量(g)。

1.2.6 褐藻多酚與總酚的相關(guān)性分析 運(yùn)用SPSS軟件以褐藻多酚得率為橫坐標(biāo),總酚得率為縱坐標(biāo),分析褐藻多酚得率與總酚得率的關(guān)系。

1.2.7 銅藻多酚提取物的分離純化 參考Sugiura等[9]的方法略有改動(dòng)。在最優(yōu)提取條件下,用乙醇溶液提取銅藻干粉,經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到銅藻乙醇提取液,用乙酸乙酯以體積比1∶1的比例萃取銅藻乙醇提取液七次,得到銅藻乙酸乙酯萃取液,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干物,得到乙酸乙酯餾分,過(guò)硅膠柱(3.0 cm×250 cm)分離。流動(dòng)相:二氯甲烷∶甲醇200∶1～6∶4,得到25個(gè)餾分,用DMBA法測(cè)定褐藻多酚得率,合并含有褐藻多酚的餾分。真空干燥后溶于甲醇,配制4 mg/mL的溶液,過(guò)C18預(yù)處理柱,待LC-TOF-MS鑒定。

1.2.8 LC-TOF-MS條件

1.2.8.1 色譜條件 參照Ferreres等[18]方法略有改動(dòng)。色譜柱:YMC-Pack ODS-AQ C18(75×4.6 mm,3 μm);柱溫20 ℃。流動(dòng)相:以0.1%甲酸甲醇為A相,0. 1%甲酸乙腈為B相;程序洗脫:0 min,0% B;5 min,0% B;15 min,30% B;17.5 min,80% B;20 min,80% B;22.5 min,0% B;保持3.5 min;26 min。流速:0.3 mL/min,進(jìn)樣量5 μL,進(jìn)樣溫度4 ℃;DAD波長(zhǎng)掃描范圍200～400 nm;紫外檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm。

1.2.8.2 質(zhì)譜條件 干燥氣氮?dú)饬魉?.0 L/min;干燥氣溫度350 ℃;霧化氣壓力40 psig;裂解電壓175 V;毛細(xì)管電壓4000 V;質(zhì)譜掃描范圍:m/z 100～1800。

質(zhì)量校正:參比溶液通過(guò)參比Nebulizer與樣本同時(shí)導(dǎo)入離子源進(jìn)行實(shí)時(shí)參比,正離子模式下選擇離子322.048132、622.028960和922.009798。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

本實(shí)驗(yàn)所有樣品均為三次平行。本文作圖采用OriginPro 8.0軟件,響應(yīng)面分析采用Design-Expert 8.0.6 Trail軟件;利用SPSS statistic 19進(jìn)行顯著性分析以及相關(guān)性分析,利用Qualitative Analysis B.04.00對(duì)LC-TOF-MS 的結(jié)果進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 褐藻多酚得率的單因素試驗(yàn)

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)褐藻多酚得率的影響 由圖1可知,銅藻中褐藻多酚得率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)增大呈先升高而后降低的趨勢(shì)。在0%～60%之間,褐藻多酚提取得率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)增大而增大,而乙醇體積分?jǐn)?shù)大于60%時(shí),褐藻多酚得率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)變大而降低。即在提取試劑乙醇的體積分?jǐn)?shù)在60%能達(dá)到峰值。這是由于乙醇中的水能夠促進(jìn)銅藻中的許多黏性物質(zhì)和外來(lái)水分互溶形成膠團(tuán)從而影響褐藻多酚得率,而體積分?jǐn)?shù)過(guò)大的乙醇揮發(fā)性較大,使提取液極性降低也會(huì)影響褐藻多酚得率[19]。因此,乙醇體積分?jǐn)?shù)選擇60%較為適宜。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)褐藻多酚得率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on extraction yield of phlorotannins注:圖中不同小寫(xiě)字母表示顯著性差異(p<0.05),圖2～4同。

2.1.2 液固比對(duì)提取褐藻多酚的影響 從圖2可知,隨著液固比的增加,褐藻多酚得率顯著提高,達(dá)到40∶1 mL/g后,逐漸趨于平穩(wěn)。再增加液固比,提取率未增加,而且由于乙醇用量增加,成本增加,且不利回收。因此選擇液固比為40∶1 mL/g。

圖2 液固比對(duì)褐藻多酚得率的影響Fig.2 Effect of liquid-solid ratio on extraction yield of phlorotannins

2.1.3 超聲提取時(shí)間對(duì)提取褐藻多酚的影響 由圖3可見(jiàn),當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)和液固比一定時(shí),超聲提取時(shí)間在45 min時(shí)褐藻多酚得率最高,而后緩慢下降。這可能是因?yàn)樘崛r(shí)間過(guò)長(zhǎng),褐藻多酚會(huì)被氧化或降解[19]。所以超聲時(shí)間過(guò)長(zhǎng)不利于褐藻多酚的提取,45 min較為適宜。

圖3 超聲時(shí)間對(duì)褐藻多酚得率的影響Fig.3 Effect of extraction time on extraction yield of phlorotannins

2.2 褐藻多酚得率的響應(yīng)面分析

2.2.1 響應(yīng)面分析 根據(jù)單因素褐藻多酚得率的結(jié)果,以提高褐藻多酚得率為目的,考察乙醇體積分?jǐn)?shù)、液固比和超聲提取時(shí)間對(duì)銅藻中褐藻多酚得率的影響,分析結(jié)果見(jiàn)表2。

2.2.2 回歸模型的建立與方差分析 利用Design-Expert軟件對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行二次回歸擬合,得到褐藻多酚得率對(duì)乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比和超聲提取時(shí)間的回歸模型:

表2 Box-behnken超聲波輔助提取褐藻多酚試驗(yàn)Table 2 Box-behnken design, ultrasonic-assisted extraction of phlorotannins experiment

Y=-43.17629+1.07518×A+1.68151×B+0.13134×C-4.66425×10-3×A×B+1.02663×10-3×A×C+5.93667×10-4×B×C-8.59142×10-3×A2-0.017472×B2-1.82157×10-3×C2

如表3方差分析所示,超聲波輔助提取褐藻多酚得率試驗(yàn)?zāi)Ｐ头浅ｏ@著(p<0.0001),表示回歸模型指標(biāo)高度顯著;R2=0.9768,失擬誤差不顯著(p>0.05),說(shuō)明該模型擬合程度良好。信噪比為17.628,遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于臨界值4,說(shuō)明該模型與實(shí)際值擬合度良好。

表3 超聲波輔助提取的方差分析Table 3 Analysis of variance for regression model regarding ultrasound-assisted extraction

回歸方程的各項(xiàng)顯著性表明:一次項(xiàng)A(p<0.0001)、C(p<0.01),交互項(xiàng)AB(p<0.05)對(duì)銅藻褐藻多酚得率影響顯著;二次項(xiàng)A2(p<0.0001)、B2(p<0.01)、C2(p<0.01)對(duì)銅藻中褐藻多酚得率影響極顯著。方差分析表中的F值及p值可知,影響褐藻多酚得率的主次順序依次為乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲提取時(shí)間、液固比,乙醇體積分?jǐn)?shù)和超聲提取時(shí)間對(duì)響應(yīng)值影響比較大。

2.2.3 超聲輔助提取響應(yīng)面的分析及優(yōu)化 圖4～6反映了所考察的三個(gè)因素(乙醇體積分?jǐn)?shù)、液固比和超聲提取時(shí)間)任意因素取零水平時(shí),其他兩因素交互作用對(duì)褐藻多酚得率的影響程度。圖4曲面陡峭,說(shuō)明乙醇體積分?jǐn)?shù)和液固比交互作用顯著,乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)得率的影響較大,最初隨液固比的增加,褐藻多酚得率迅速增大,之后隨液固比的增加反而有開(kāi)始下降;圖5可知,乙醇體積分?jǐn)?shù)和超聲提取時(shí)間交互作用不顯著,褐藻多酚得率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大和超聲提取時(shí)間的延長(zhǎng)均出現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì);圖6可知,液固比和超聲提取時(shí)間交互作用不顯著,褐藻多酚得率隨著液固比的增大和超聲提取時(shí)間的延長(zhǎng)均出現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)。

圖4 乙醇體積分?jǐn)?shù)與液固比對(duì)褐藻多酚 得率影響的等高線圖(a)和響應(yīng)面圖(b)Fig.4 Response contour plots(a)and the surface diagram(b)of ethanol concentration and liquid-solid ratio impacting on extraction yield of phlorotannins

圖6 液固比與提取時(shí)間對(duì)褐藻多酚得率影響的 響應(yīng)面圖(a)和等高線圖(b)Fig.6 Response contour plots(a)and the surface diagram(b)of solid-liquid ratio and extraction time impacting on extraction yield of phlorotannins

通過(guò)響應(yīng)面分析,得到超聲波輔助提取銅藻中的褐藻多酚的最佳工藝條件是:乙醇體積分?jǐn)?shù)為 54.72%，液固比為41.80∶1 mL/g，提取時(shí)間為58.3 min。在此工藝條件下,褐藻多酚得率的理論預(yù)測(cè)值為25.21 mg/100 g。為了便于試驗(yàn)操作,最優(yōu)條件簡(jiǎn)化為:乙醇體積分?jǐn)?shù)55%、液固比42∶1 mL/g、提取時(shí)間58 min。在最優(yōu)條件下,通過(guò)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證,得到褐藻多酚的得率為(25.16±0.34) mg/100 g。與預(yù)測(cè)值相比,比較誤差在0.20%。表明實(shí)驗(yàn)所得回歸方程的最大預(yù)測(cè)值與驗(yàn)證值非常接近,說(shuō)明回歸方程能較真實(shí)地反映各篩選因素的影響,建立的模型與實(shí)際情況比較吻合。

2.3 褐藻多酚得率與總酚得率的相關(guān)性分析

采用SPSS 19.0對(duì)單因素中45個(gè)樣品所得總酚得率和褐藻多酚得率進(jìn)行雙變量相關(guān)性分析(如圖7),其相關(guān)系數(shù)為0.803,p<0.0001,非常顯著。即在銅藻多酚提取物中,隨著總酚的增加,褐藻多酚也相應(yīng)增加,可以確定DMBA法測(cè)得的褐藻多酚與Folin-Ciocalteu法測(cè)得的總酚之間呈正相關(guān)。Folin-Ciocalteu法的原理為酚類物質(zhì)在堿性條件下與磷鉬酸鹽發(fā)生氧化還原反應(yīng)生成藍(lán)色混合物,樣品中所有羥基苯基團(tuán)均發(fā)生此反應(yīng),不具有特異性,因此該方法用于總酚的測(cè)定。DMBA法的原理是酚類物質(zhì)與醛發(fā)生顯色反應(yīng),是1,3-羥基苯基團(tuán)和1,3,5-羥基苯基團(tuán)發(fā)生的特異性反應(yīng),因此可用于褐藻多酚的測(cè)定。由于褐藻多酚是總酚的一部分,因此兩者呈正相關(guān)關(guān)系,在絕大多數(shù)情況下總酚得率可以反映褐藻多酚的得率。但是對(duì)于以鄰位羥基酚為主的樣品,若采用Folin-Ciocalteu法所得結(jié)果代表樣品中的褐藻多酚得率,會(huì)導(dǎo)致結(jié)果偏高,而采用DMBA法才能更準(zhǔn)確分析樣品中褐藻多酚的得率。

圖7 褐藻多酚得率與總酚得率的相關(guān)性分析結(jié)果Fig.7 Correlation analysis results between phlorotannins and total phenol

2.4 LC-TOF-MS鑒定提取物中褐藻多酚的結(jié)構(gòu)

利用LC-TOF-MS,在合并的餾分中鑒定出1個(gè)化合物(如圖8),該化合物在保留時(shí)間為14.8 min正離子模式下分子離子峰為m/z 375[M+H]+,其平均分子量為374.3036,理論值為374.2984,分子式為C18H14O9。分子離子經(jīng)電噴霧離子化裂解為 m/z為357和232的碎片峰,其中脫去水后形成特征碎片m/z 357[M+H—H2O]+,脫去間苯三酚及羥基氧形成離子碎片m/z 232[M+H—O-C6H6O3]+。由此結(jié)果可知此化合物為C-O-C氧化酚連接起來(lái)的間苯三酚三聚體[20]。酚類物質(zhì)在波長(zhǎng)在280 nm下具有紫外吸收[21],該餾分在280 nm下的紫外吸收色譜圖中保留時(shí)間為14.8 min處有可見(jiàn)吸收,進(jìn)一步佐證了該化合物的結(jié)構(gòu)。

圖8 m/z為375的離子流色譜圖和波長(zhǎng)為 280 nm下的紫外吸收色譜圖Fig.8 EICFigure of m/z=375 and UV absorption spectra at wavelength 280 nm

迄今發(fā)現(xiàn)分子量為374.3036的褐藻多酚有6個(gè),分別是:Fucophlorethol-A、Fucophlorethol-B、Fucophlorethol-C、Triphlorethol A、Triphlorethol C、Trifucol。其中前五種褐藻多酚的結(jié)構(gòu)中有C-O-C氧化酚連接。Fucophlorethol-A、Fucophlorethol-B、Fucophlorethol-C、Triphlorethol C分別從墨角藻(Fucusvesiculosus)[22]、褐藻(Laminaraiaochroleuca)[23]和Eiseniabicyclis[24]、Colpomeniabullosa[25]、Laminariaochroleuca[23]中被發(fā)現(xiàn)。Triphlorethol A是一種常見(jiàn)的三聚體,廣泛地存在于Cystophoraretroflexa[26]、昆布Eckloniastolonifera[27]、馬尾藻(Sargassumspinuligerum)[28]和昆布Eckloniacava[29]。銅藻是馬尾藻屬,初步推測(cè)該化合物是Triphlorethol A(如圖9)。

圖9 Triphloretol A的結(jié)構(gòu)式Fig.9 The structural formula of Triphloretol A

3 結(jié)論

用超聲波輔助法提取銅藻中的褐藻多酚得率的最佳工藝條件為:乙醇體積分?jǐn)?shù)為55%,液固比為42∶1 mL/g,提取超聲時(shí)間為58 min。在此條件下,褐藻多酚得率實(shí)際值為(25.16±0.34) mg/100 g。對(duì)于所得到的銅藻多酚提取物,Folin-Ciocalteu法測(cè)得的總酚得率與DMBA法測(cè)得的褐藻多酚得率呈正相關(guān)性。通過(guò)LC-TOF-MS鑒定出一種間苯三酚三聚體,推測(cè)該化合物為T(mén)riphlorethol A。