云南產(chǎn)黃皮疣柄牛肝菌基本營(yíng)養(yǎng)成分 和抗氧化活性

劉秋鳴,李 笑,肖俊江,孫麗平

(昆明理工大學(xué)云南省食品安全研究院,云南昆明 650500)

黃皮疣柄牛肝菌(Leccinellumcrocipodium),又稱黃癩頭,屬真菌界(Fungi),擔(dān)子菌門(Basidiomycota),傘菌綱(Agaricomycetes),牛肝菌目(Boletales),牛肝菌科(Boletaceae),疣柄牛肝菌屬(Leccinellum),在松、落葉櫟類林地上群生或單生,屬于外生菌根菌[1]。在我國(guó)江蘇、安徽、福建、貴州、臺(tái)灣等地均有分布,在云南省,常見于除西雙版納等熱帶地區(qū)之外的市場(chǎng)[2]。

黃皮疣柄牛肝菌味道鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富,含蛋白質(zhì)、總糖、脂肪、氨基酸等營(yíng)養(yǎng)成分及多種礦質(zhì)元素[3-4]。食用菌多酚被發(fā)現(xiàn)具有一定抗氧化活性[5]。王婷婷等[6]研究了黃皮疣柄牛肝菌、馬勃菌、黑牛肝菌、雞樅4種野生菌的多酚含量及活性,發(fā)現(xiàn)黃皮疣柄牛肝菌中多酚含量最高,抗氧化活性最好。劉雨陽等[7]研究發(fā)現(xiàn)黃皮疣柄牛肝菌多酚提取物對(duì)Caco-2結(jié)腸癌細(xì)胞具有一定程度的抑制作用。

本研究采集了云南省主要產(chǎn)區(qū)25個(gè)位點(diǎn)的黃皮疣柄牛肝菌樣本,測(cè)定了子實(shí)體的基本營(yíng)養(yǎng)成分,分析了子實(shí)體多酚粗提物中多酚含量與其DPPH·清除能力、ABTS+·清除能力、鐵離子還原能力和金屬螯合能力的相關(guān)性,探討了云南各產(chǎn)地的黃皮疣柄牛肝菌子實(shí)體的營(yíng)養(yǎng)性與功能性。本研究采樣范圍廣,研究結(jié)果具有一定代表性,能為消費(fèi)者、食品制造商以及食品研究人員提供科學(xué)信息,為黃皮疣柄牛肝菌的綜合利用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黃皮疣柄牛肝菌 采集時(shí)間和地點(diǎn)如表1所示,樣品采集當(dāng)天帶回實(shí)驗(yàn)室,削除表面不可食部分,先后用流動(dòng)水和超純水清洗,冷凍干燥,研磨粉碎,過40目絹篩,于棕色抽真空的干燥器中儲(chǔ)存,待測(cè);1,1-二苯-1-苦基苯肼自由基(DPPH·)、2,2-氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)、Fe3+-三吡啶三吖嗪(TPTZ)、6-羥基-2,5,7,8-四甲基苯并二氫吡喃-2-羧酸(Trolox)、EDTA、Ferrozine(菲洛嗪) 美國(guó)Sigma公司;其它試劑 均為分析純。

表1 樣品采集地點(diǎn)和時(shí)間Table 1 Collecting location and time of sample

Alpha 1-2/LD型冷凍干燥機(jī) 德國(guó)CHRIST;DL-5-B型低速大容量多管離心機(jī)、TGL-20B型高速臺(tái)式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;UV-6100型紫外可見分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司;SB5200D型超聲波清洗機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司;HH-2型恒溫水浴鍋 金壇市瑞爾電器有限公司;SX-4-10型馬弗爐 長(zhǎng)沙市華光電爐廠;SZF-06A型脂肪測(cè)定儀 上海新嘉電子有限公司;DHG9070A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 基本營(yíng)養(yǎng)成分測(cè)定 粗蛋白含量測(cè)定依據(jù)GB 5009.5-2010,采用凱氏定氮法。粗脂肪含量測(cè)定依據(jù)GB/T 5009.6-2003,采用索氏抽提法。粗灰分含量測(cè)定依據(jù)GB 5009.4-2010,采用灼燒法?？扇苄钥偺呛繙y(cè)定采用苯酚硫酸法。以上結(jié)果均表達(dá)為%干重(DW)。

1.2.2 多酚提取 準(zhǔn)確稱取1.0 g樣品于50 mL離心管中,加入15 mL 70%甲醇,連續(xù)超聲輔助提取1 h,輸出功率200 W。5000 r/min離心10 min,收集上清液。向沉淀中加入10 mL 70%甲醇重復(fù)提取步驟,合并上清液,并用70%甲醇定容至25 mL,得樣品多酚粗提液,儲(chǔ)存于4 ℃待測(cè)。

1.2.3 多酚含量測(cè)定 采用Folin-Ciocalteu比色法[8]測(cè)定多酚含量。標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:準(zhǔn)確吸取0.5 mL 0、20、40、60、80、100 μg/mL沒食子酸的標(biāo)準(zhǔn)工作液于10 mL連蓋離心管中,加2.5 mL 10%福林酚試劑,搖勻,靜置5 min,加2.0 mL 7.5%碳酸鈉溶液,搖勻,室溫下避光反應(yīng)60 min,于765 nm下測(cè)定吸光值,以吸光值和標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度為坐標(biāo)建立曲線。以0.5 mL多酚粗提液代替沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)工作液,按照上述方法測(cè)定吸光值,計(jì)算黃皮疣柄牛肝菌多酚含量,結(jié)果表達(dá)為mg沒食子酸當(dāng)量/g干樣(mg GAE/g DW)。

1.2.4 DPPH·清除能力測(cè)定 0.1 mmol/L DPPH·甲醇溶液配制:精確稱取DPPH 0.1972 g,溶于甲醇,定容至500 mL,配制成1 mmol/L DPPH甲醇母液,取DPPH甲醇母液用甲醇稀釋10倍即得0.1 mmol/L DPPH·甲醇溶液。

DPPH·清除能力測(cè)定采用文獻(xiàn)[9]的方法。取0.4 mL粗多酚提取液,加入2 mL 0.1 mmol/L DPPH·甲醇溶液,混勻,室溫避光反應(yīng)30 min,于517 nm下測(cè)定吸光值。Trolox作陽性對(duì)照,以20～100 μmol/L濃度的Trolox DPPH·清除能力做標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品DPPH·清除能力結(jié)果表示為Trolox當(dāng)量(μmole TE/g DW)。

1.2.5 ABTS+·清除能力測(cè)定 ABTS+·清除能力參考文獻(xiàn)[10]方法測(cè)定,稍作修改。取5 mL 7 mmol/L的ABTS溶液與88 μL過硫酸鉀(40 mmol/L)的混合,于室溫黑暗中放置12 h,制備ABTS+·儲(chǔ)備液。該儲(chǔ)備液用70%乙醇稀釋至734 nm下吸光值為0.70±0.02,得ABTS+·工作液。取4 mL ABTS+·工作液與0.5 mL多酚粗提液混合,于30 ℃水浴條件下反應(yīng)6 min,于734 nm下測(cè)定吸光值。70%甲醇代替樣品做空白對(duì)照。Trolox作陽性對(duì)照,以20～100 μmol/L濃度的Trolox ABTS+·清除能力做標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品ABTS+·清除能力測(cè)定結(jié)果表示為Trolox當(dāng)量(μmole TE/g DW)。

1.2.6 鐵離子還原能力(FRAP)測(cè)定 采用文獻(xiàn)[11]的方法,稍作修改。標(biāo)準(zhǔn)曲線:將0.3 mol/L的醋酸緩沖液(pH3.6)、10 mmol/L TPTZ和20 mmol/L FeCl3溶液按10∶1∶1的比例配制成FRAP工作液。取濃度0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L FeSO4·7H2O溶液各150 μL,分別加入4.5 mL FRAP試劑,混勻后37 ℃水浴條件下反應(yīng)10 min,測(cè)定593 nm處吸光值,以FeSO4·7H2O濃度和吸光值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品測(cè)定:4.5 mL FRAP工作液與150 μL多酚粗提液混合,混勻后37 ℃水浴條件下反應(yīng)10 min,于593 nm處測(cè)定吸光值。70%甲醇代替樣品做空白對(duì)照。樣品鐵離子還原能力(FRAP值)以每100克干質(zhì)量樣品達(dá)到同樣吸光度所需FeSO4毫摩爾數(shù)表示(mmole Fe2+E/100 g)。

1.2.7 金屬螯合能力測(cè)定 Fe2+螯合能力測(cè)定參考文獻(xiàn)[9]方法測(cè)定。1 mL多酚粗提液與3.7 mL超純水混合,加入100 μL 2 mmol/L FeCl2,混合30 s,再加入200 μL 5 mmol/L菲洛嗪,混勻,室溫靜置10 min,于562 nm處測(cè)定吸光值。70%甲醇代替樣品做空白對(duì)照。EDTA做陽性對(duì)照,以0.034～0.171 mmol/L的EDTA Fe2+螯合能力做標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品Fe2+螯合能力測(cè)定結(jié)果表示為EDTA當(dāng)量(μmole EDTA E/g)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

2 結(jié)果與分析

2.1 菌體基本成分和總酚含量

黃皮疣柄牛肝菌子實(shí)體的基本成分測(cè)定結(jié)果如表2所示。不同產(chǎn)地黃皮疣柄牛肝菌粗蛋白含量為24.54% DW±0.33% DW～37.25% DW±0.71% DW,29號(hào)樣品陸良的粗蛋白含量最高,為37.25% DW±0.71% DW,29個(gè)樣本粗蛋白含量均值為29.55%,高于野生菌中美味牛肝菌、銅色牛肝菌和網(wǎng)柄牛肝菌以及常見栽培食用菌中的平菇、金針菇等[12]食用菌子實(shí)體的粗蛋白含量。食用菌的總糖含量是其營(yíng)養(yǎng)和質(zhì)量評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)之一,包括水溶性多糖、寡糖和單糖。食用菌中的多糖具有比較復(fù)雜而全面的生理活性和功能[13-14]。本研究中不同產(chǎn)地黃皮疣柄牛肝菌子實(shí)體的可溶性總糖含量為7.03% DW±0.30% DW～19.03% DW±0.03% DW,低于一些常見食用菌[15]香菇(32.4%)、平菇(22.25%)、金針菇(47.89%)等。粗脂肪含量相對(duì)較低的5個(gè)樣本為寧洱(0.88% DW±0.37% DW)、花山3(1.30% DW±0.16% DW)、江川(1.51% DW±0.04% DW)、墨江(1.59% DW±0.06% DW)和峨山(1.67% DW±0.27% DW),其它24個(gè)樣本中脂肪含量為1.85% DW±0.12% DW～3.78%±0.03% DW,均值為2.83%,與梅文泉等[3]測(cè)定黃皮疣柄牛肝菌營(yíng)養(yǎng)成分分析比較,脂肪含量略高。不同產(chǎn)地黃皮疣柄牛肝菌粗灰分含量4.31% DW±0.02% DW～7.07% DW±0.04% DW,低于Barros等[16]測(cè)定的幾種食用菌(7.07%～16.48%)。從表2可以看出,不同產(chǎn)地和采集時(shí)間的黃皮疣柄牛肝菌子實(shí)體的基本營(yíng)養(yǎng)成分含量存在顯著性差異(p<0.05),這可能是因?yàn)樯L(zhǎng)環(huán)境的不同,采集時(shí)間的差異,但總體上有高蛋白低脂肪、含有一定量可溶性總糖的特點(diǎn)。

表2 黃皮疣柄牛肝菌基本營(yíng)養(yǎng)成分和總酚含量Table 2 Proximate composition and polyphenols contents of Leccinum crocipodium

真菌類食物可提供給人體具有多重生物活性的多酚類物質(zhì),多酚類物質(zhì)具有活潑的多羥基結(jié)構(gòu),從而具有較強(qiáng)的供電子能力,使其成為有效的抗氧化活性成分[17]。本研究提取黃皮疣柄牛肝菌總酚并測(cè)定其含量,結(jié)果如表2所示,不同產(chǎn)地黃皮疣柄牛肝菌總酚含量為(12.25±0.67)～(24.44±0.72) mg GAE/g DW,相對(duì)較高的6個(gè)樣本為宜良(24.44±0.72) mg GAE/g DW、陸良(23.83±0.06) mg GAE/g DW、峨山(23.61±0.69) mg GAE/g DW、硯山(20.27±0.14) mg GAE/g DW、建水(20.11±0.03) mg GAE/g DW和通海(20.08±0.42) mg GAE/g DW,最低為祿豐(12.25±0.67) mg GAE/g DW。本研究黃皮疣柄牛肝菌總酚含量略高于侯文井等[18]報(bào)道的美味牛肝菌、元蘑、榛蘑和黑木耳中總酚含量,說明黃皮疣柄牛肝菌是一種多酚含量豐富的野生食用菌。

2.2 粗多酚提取物的抗氧化性分析

DPPH·清除能力被廣泛用于評(píng)價(jià)多酚的抗氧化能力以及天然抗氧化劑的篩選。如表3所示,不同產(chǎn)地黃皮疣柄牛肝菌多酚粗提物都具有一定DPPH·清除能力。普洱(2.38±0.03) μmole TE/g、宜良(2.56±0.02) μmole TE/g、寧洱(2.58±0.01) μmole TE/g 3個(gè)樣本的DPPH·清除能力相對(duì)較低,其均值為2.51 μmole TE/g。其它26個(gè)樣本的DPPH·清除能力為(2.77±0.07)～(3.39±0.01) μmole TE/g,均值為3.20 μmole TE/g,高出相對(duì)較低的3個(gè)樣本均值(2.51 μmole TE/g)的127%。抗氧化劑對(duì)DPPH自由基的清除作用是由于其供氫能力,蘑菇提取物的抗氧化活性可能是多酚類物質(zhì)中的羥基作用,蘑菇粗多酚可能是天然抗氧化劑的潛在來源。

表3 黃皮疣柄牛肝菌粗多酚提取物的抗氧化能力和金屬螯合能力Table 3 Antioxidant activities and metal chelating ability of Leccinum crocipodium

ABTS不僅是親水型化合物還是親脂型化合物,比較容易反應(yīng)。ABTS+·的清除是電子轉(zhuǎn)移過程,體系中的抗氧化劑與其反應(yīng)將會(huì)使溶液褪色,表現(xiàn)為吸光值的降低[19],從而反映出試樣抗氧化能力的大小。不同產(chǎn)地黃皮疣柄牛肝菌多酚粗提物都具有很好的ABTS+·清除能力,且存在顯著性差異(p<0.05)。ABTS+·清除能力范圍為(1.85±0.01)～(3.00±0.05) μmole TE/g,相對(duì)較高的5個(gè)樣本為花山4(3.00±0.05) μmole TE/g、東川(2.97±0.01) μmole TE/g、花山2(2.83±0.02) μmole TE/g、開遠(yuǎn)(2.77±0.01) μmole TE/g和丘北(2.76±0.01) μmole TE/g,均值為2.87 μmole TE/g,高出其它剩余24個(gè)地區(qū)均值(2.31 μmole TE/g)的124%。

FRAP還原能力為抗氧化劑將Fe3+還原為Fe2+,Fe2+與TPTZ結(jié)合生成藍(lán)色絡(luò)合物,該絡(luò)合物在波長(zhǎng)593 nm處有最大吸收。吸光度越大,表明抗氧化劑的還原能力越強(qiáng),也就是有更高的抗氧化活性[20]。不同樣本黃皮疣柄牛肝菌多酚粗提物均表現(xiàn)較高的FRAP還原能力,相對(duì)較高的3個(gè)樣本為峨山、尋甸、花山4,其FRAP值分別(1.74±0.03)、(1.60±0.02)、(1.46±0.02) mmole Fe2+E/100 g,均值為1.6 mmole Fe2+E/100 g,相對(duì)較低的4個(gè)地區(qū)為寧洱(0.74±0.01 mmole Fe2+E/100 g)、石林(0.85±0.02 mmole Fe2+E/100 g)、沾益(0.90±0.00 mmole Fe2+E/100 g)和嵩明(0.95±0.03 mmole Fe2+E/100 g)。其它22個(gè)地區(qū)的FRAP還原能力為0.97～1.36 mmole Fe2+E/100 g,均值為1.06 mmole Fe2+E/100 g。FRAP還原能力相對(duì)較高的前3個(gè)地區(qū)的均值高出其它剩余22個(gè)地區(qū)均值的151%。

Ozgen等[21]研究認(rèn)為DPPH、ABTS和FRAP抗氧化評(píng)價(jià)模型簡(jiǎn)單、穩(wěn)定、極易操作,反應(yīng)機(jī)制上,DPPH、ABTS和FRAP均評(píng)價(jià)了抗氧化物質(zhì)的單電子轉(zhuǎn)移能力,但是其反應(yīng)體系極性不同,為了綜合評(píng)價(jià)天然抗氧化物的抗氧化活性,需要多模型的抗氧化評(píng)價(jià)體系,DPPH、ABTS和FRAP三個(gè)體系的聯(lián)合應(yīng)用是合適的。

適量的鐵對(duì)于細(xì)胞功能有重要作用,例如氧運(yùn)輸、細(xì)胞呼吸和許多鐵金屬酶的輔因子,而過量的游離鐵會(huì)導(dǎo)致Fenton反應(yīng)產(chǎn)生活性氧物質(zhì)[22],因此金屬離子螯合可以一定程度上降低金屬離子的催化作用,避免自由基的生成,這也是一種評(píng)價(jià)試樣抗氧化性能常用的方法。不同樣本黃皮疣柄牛肝菌多酚粗提物具有很好的Fe2+螯合能力,且存在一定的顯著性差異(p<0.05),相對(duì)較高的為祿豐(3.29±0.03) μmole EDTA E/g、花山3(3.27±0.03) μmole EDTA E/g、江川(3.06±0.01) μmole EDTA E/g、峨山(3.04±0.00) μmole EDTA E/g、丘北(3.03±0.03) μmole EDTA E/g,這5個(gè)地區(qū)Fe2+螯合能力均值為3.14 μmole EDTA E/g,高出其它剩余22個(gè)地區(qū)均值(2.25 μmole EDTA E/g)的140%。

2.3 抗氧化活性與總酚含量相關(guān)性分析

DPPH·清除能力、ABTS+·清除能力是基于分光光度法,通過測(cè)定樣品清除自由基的能力來表征其抗氧化能力。FRAP法反映的是樣品還原Fe3+的能力,MCA法則測(cè)定樣品螯合Fe2+的能力。植物抗氧化能力與其多酚、黃酮類、VC、VE和類胡蘿卜素等物質(zhì)含量有一定的相關(guān)性[23]。不同評(píng)價(jià)體系下黃皮疣柄牛肝菌抗氧化活性與總酚含量相關(guān)性分析如表4所示。總酚含量(TPC)與ABTS+·清除活性和FRAP還原能力在0.01水平下顯著正相關(guān),相關(guān)系數(shù)分別為0.275和0.287。表明,在ABTS+·清除活性和FRAP還原能力兩種抗氧化評(píng)價(jià)體系下,酚類化合物可能是黃皮疣柄牛肝菌表現(xiàn)抗氧化能力的重要因素之一。酚類化合物,如類黃酮、酚酸和縮合單寧通常被認(rèn)為是植物抗氧化能力的主要貢獻(xiàn)者[22]。同時(shí),不同評(píng)價(jià)體系之間的相關(guān)性分析表明,DPPH·清除能力與FRAP還原能力和ABTS+·清除能力在0.01水平下顯著正相關(guān),相關(guān)系數(shù)為0.372和0.370。在0.05水平下,FRAP還原能力和ABTS+·清除能力成正相關(guān),相關(guān)系數(shù)為0.263。不同評(píng)價(jià)體系之間的顯著相關(guān)性表明,抗氧化測(cè)定方法是可靠的。不同的抗氧化反應(yīng)體系適用于不同的氧化應(yīng)激反應(yīng)。因此,在測(cè)定物質(zhì)抗氧化能力時(shí),可以根據(jù)需要采用多種方法來綜合評(píng)價(jià)其抗氧化活性。

表4 抗氧化活性與總酚含量相關(guān)性Table 4 Correlation between antioxidant activity and total phenol content

3 結(jié)論

本文初步探討了云南主要產(chǎn)區(qū)25個(gè)位點(diǎn)黃皮疣柄牛肝菌的基本營(yíng)養(yǎng)成分和抗氧化活性。研究發(fā)現(xiàn)黃皮疣柄牛肝菌具有高蛋白低脂肪、富含多酚的特點(diǎn)。菌體多酚粗提物對(duì)DPPH·、ABTS+·具有很好的清除能力,對(duì)Fe3+具有良好的還原能力,且具有很好的Fe2+螯合能力。酚類化合物與抗氧化活性相關(guān)性分析表明其可能是黃皮疣柄牛肝菌抗氧化活性的重要因素之一。云南產(chǎn)黃皮疣柄牛肝菌不僅基本營(yíng)養(yǎng)成分豐富,是良好的膳食來源,而且抗氧化活性較好。本研究向消費(fèi)者、營(yíng)養(yǎng)學(xué)家和食品研究人員提供了關(guān)于黃皮疣柄牛肝菌體外抗氧化活性的新信息,為野生食用牛肝菌的資源利用提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。