抑制α-葡萄糖苷酶活性鷹嘴豆乳制備條件優(yōu)化

瞿恒賢,李啟明,黃玉軍,陳 霞,印伯星,顧瑞霞,陳大衛(wèi)，*

(1.揚(yáng)州大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,江蘇省乳品生物技術(shù)與安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇揚(yáng)州 225009;2.新希望乳業(yè)股份有限公司,四川成都 610000)

鷹嘴豆(Cicerarietinum),又名桃爾豆、雞豆、雞心豆等,起源于亞洲西部和中東地區(qū)。我國鷹嘴豆種植主要分布在新疆、甘肅等地,在新疆已有2500年應(yīng)用歷史[1]。鷹嘴豆作為一種古老的豆類植物,營養(yǎng)價值非常高,同時也具有較強(qiáng)的功能特性和特殊風(fēng)味,是一種健康食品。鷹嘴豆中含有豐富的不飽和脂肪酸、大豆異黃酮和皂苷等多種生理活性物質(zhì),能改善糖尿病小鼠的血糖和血脂,其含有的異黃酮在降低血清甘油三酯方面的作用尤為突出[2-3]。凱賽爾·阿不都克熱木等[4]研究發(fā)現(xiàn),鷹嘴豆總皂苷對糖尿病大鼠血糖血脂具有調(diào)節(jié)作用。

α-葡萄糖苷酶(α-Glucosidases)是淀粉水解酶類的一種[5],主要作用是通過水解α-1,4糖苷鍵,從淀粉和有關(guān)多糖的非還原端切下葡萄糖[6]。人體對淀粉、糊精、蔗糖等碳水化合物的吸收利用主要依賴于小腸刷狀緣上該酶的活性[7]。抑制α-葡萄糖苷酶活性,可以減緩葡萄糖的生成和吸收,從而起到降低血糖的作用[8]。目前的研究也表明,α-葡萄糖苷酶抑制劑不僅對糖尿病和肥胖癥具有預(yù)防作用,同時還兼?zhèn)淇鼓[瘤和抗ADS病毒的能力[9-10]。因此,研究對α-葡萄糖苷酶的抑制作用具有十分重要的意義。

隨著鷹嘴豆的食用及保健價值逐漸認(rèn)知,市場對鷹嘴豆產(chǎn)品的需求與日俱增。目前,鷹嘴豆食品主要有鷹嘴豆乳系列飲料、罐頭食品、速溶食品、膨化食品等[11]。鷹嘴豆乳飲料的研究主要集中在簡單的調(diào)配及穩(wěn)定性的研究[12-14],對鷹嘴豆乳產(chǎn)品功能特性的強(qiáng)化卻鮮有研究。在加工的過程中，加工工藝對鷹嘴豆中的活性成分具有一定的影響。本研究以α-葡萄糖苷酶抑制率為指標(biāo)，優(yōu)化鷹嘴豆乳的酶解條件,使鷹嘴豆中的活性成分得以溶出,從而制備抑制α-葡萄糖苷酶活性的鷹嘴豆乳。同時為了得到良好的穩(wěn)定性,防止鷹嘴豆乳蛋白質(zhì)的沉淀,以離心沉淀率為指標(biāo),通過單因素實(shí)驗(yàn)選擇合適的穩(wěn)定劑及濃度,并通過正交實(shí)驗(yàn)對穩(wěn)定劑進(jìn)行了復(fù)配,為開發(fā)功能性鷹嘴豆乳奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鷹嘴豆(蛋白質(zhì)、脂肪、淀粉含量分別為22.50%、5.50%、50.00%) 新疆木壘縣;α-淀粉酶(20000 U/mL)、糖化酶(100000 U/g)、α-葡萄糖苷酶(30000 U/g) 江蘇銳陽生物技術(shù)有限公司;4-硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(PNPG) 美國Sigma公司;明膠、黃原膠、卡拉膠、海藻酸鈉、果膠、瓜爾豆膠 上海昊岳實(shí)業(yè)有限公司;濃硫酸、鹽酸、硼酸(分析純) 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1510型酶標(biāo)儀、MACH1.6R型離心機(jī) 美國Thermo公司;HH-6型恒溫水浴鍋 國華電器有限公司;PL2002電子天平(1/100) 梅特勒-托利多儀器有限公司;UDK159全自動凱氏定氮儀 意大利VELP公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 鷹嘴豆乳的制備 整體流程為:鷹嘴豆→篩選→清洗烘干→磨粉→浸泡→磨漿→過濾→糊化→液化→糖化→穩(wěn)定劑調(diào)配→二次均質(zhì)→殺菌。

篩選表面有光澤、無霉變、顆粒飽滿的鷹嘴豆,清洗60 ℃烘干后磨粉浸泡,按一定料水比磨漿后100目篩過濾。制得的鷹嘴豆乳80 ℃糊化后,加入20000 U/mL的高溫α-淀粉酶(終濃度7 kU/kg)95 ℃液化,再加入100000 U/g的糖化酶(終濃度200 kU/kg)60 ℃糖化。加入復(fù)配穩(wěn)定劑,二次均質(zhì)(21 MPa 65 ℃,5 MPa 65 ℃),并于75 ℃殺菌25 min。

1.2.2 鷹嘴豆粉浸泡與制漿條件的確定 浸泡條件:取1.2.1中所得鷹嘴豆粉,在常溫下浸泡不同時間(1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 h)后以料水比1∶8 (g/mL)磨漿,100目篩過濾,測定所制備鷹嘴豆乳的蛋白質(zhì)含量和蛋白質(zhì)得率。制漿條件:鷹嘴豆粉在常溫下采用最佳浸泡時間浸泡并按1∶3、1∶4、1∶5、1∶8、1∶9、1∶10、1∶12 (g/mL)不同料水比制漿,100目篩過濾后,測定制備的鷹嘴豆乳的蛋白質(zhì)含量和蛋白質(zhì)得率。

1.2.3 鷹嘴豆乳酶解條件優(yōu)化 糊化:取最佳浸泡條件和制漿條件制得的鷹嘴豆乳,80 ℃糊化60 min,每隔10 min取鷹嘴豆乳,測定其對α-葡萄糖苷酶的抑制率。液化:鷹嘴豆乳80 ℃糊化40 min后,按照1.2.1中條件液化60 min,每隔10 min取鷹嘴豆乳測定對α-葡萄糖苷酶的抑制率。糖化:鷹嘴豆乳80 ℃糊化40 min,95 ℃液化40 min后,降溫至60 ℃,按照1.2.1條件糖化14h,每隔1～2h取鷹嘴豆乳測定對α-葡萄糖苷酶的抑制率。

1.2.4 單一穩(wěn)定劑對鷹嘴豆乳穩(wěn)定性的影響 將瓜爾豆膠、黃原膠、果膠、卡拉膠和海藻酸鈉這5種膠體,按照不同的添加量(0.01%、0.02%、0.03%、0.05%、0.10%、0.30%、0.50%)單獨(dú)加入到鷹嘴豆乳中,按1.2.1中方法均質(zhì)、殺菌后放置24 h,以離心沉淀率為指標(biāo),比較其穩(wěn)定效果。

1.2.5 穩(wěn)定劑的復(fù)配 復(fù)配穩(wěn)定劑效果往往高于單一穩(wěn)定劑,因此本實(shí)驗(yàn)采取正交實(shí)驗(yàn)的方法進(jìn)行復(fù)配,因素水平如表1所示。

表1 穩(wěn)定劑復(fù)配因素水平表

1.2.6 蛋白質(zhì)含量的測定 采用凱氏定氮法[15]測定蛋白質(zhì)含量,利用下式計算蛋白質(zhì)得率:

蛋白質(zhì)理論值=鷹嘴豆蛋白質(zhì)含量×料水比

1.2.7α-葡萄糖苷酶抑制率的測定 參考文獻(xiàn)[16]中方法稍作改動。在600 μL 0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.8)中分別加入200 μLα-葡萄糖苷酶(0.2 U/mL)和100 μL鷹嘴豆乳;將混合物于37 ℃水浴10 min,再加入300 μL 20 mmol/L PNPG溶液,繼續(xù)反應(yīng)5 min;加入1 mL 1 mol/L Na2CO3作為反應(yīng)終止液,于405 nm處測定其吸光值,計算α-葡萄糖苷酶抑制率。

式中,a為含有α-葡萄糖苷酶溶液但不含鷹嘴豆乳的吸光值;b為不含α-葡萄糖苷酶溶液及鷹嘴豆乳的吸光值;c為含有α-葡萄糖苷酶溶液及鷹嘴豆乳的測定吸光值;d為不含α-葡萄糖苷酶溶液但含鷹嘴豆乳的測定吸光值。

1.2.8 離心沉淀率的測定 取10 mL鷹嘴豆乳,離心(3000×g,30 min),棄上清,將離心管倒置30 min,稱取沉淀物重量,利用下式計算離心率:

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均平行測定三次,使用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,所有數(shù)據(jù)均采用SPSS進(jìn)行統(tǒng)計分析,采用Excel作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 鷹嘴豆粉制漿條件的確定

2.1.1 鷹嘴豆粉浸泡條件的確定 不同浸泡時間后所得鷹嘴豆乳的蛋白質(zhì)得率如圖1所示。

圖1 浸泡時間對鷹嘴豆乳蛋白質(zhì)得率的影響

由圖1可知,浸泡時間低于4 h時,蛋白質(zhì)得率較低,低于90%,造成了蛋白質(zhì)的浪費(fèi),不適合鷹嘴豆乳制品的工業(yè)化生產(chǎn);當(dāng)浸泡時間在7 h以上時,蛋白質(zhì)得率顯著升高(p<0.05),并趨于穩(wěn)定,此時蛋白質(zhì)得率達(dá)到96%以上。故最終選擇7 h為最適的浸泡時間。

2.1.2 鷹嘴豆粉制漿條件的確定 不同料水比所得鷹嘴豆乳的蛋白質(zhì)含量及蛋白質(zhì)得率如圖2所示。

圖2 不同料水比對鷹嘴豆乳蛋白質(zhì)含量及得率的影響

由圖2可知,鷹嘴豆粉與水的料液比低于1∶5 (g/mL)時,蛋白質(zhì)得率小于90%。當(dāng)料水比大于1∶5 (g/mL)時,蛋白質(zhì)的得率顯著升高(p<0.05)。料水比達(dá)到1∶8 (g/mL)時,蛋白質(zhì)得率趨于穩(wěn)定。為了在保證蛋白質(zhì)含量符合國家標(biāo)準(zhǔn)[17]規(guī)定的前提下,大大提高了鷹嘴豆乳蛋白質(zhì)的得率,最終選用料水比1∶10 (g/mL)進(jìn)行磨漿,此時蛋白質(zhì)得率較高，達(dá)到97.89%,且豆乳的蛋白質(zhì)含量為2.01%,符合國家標(biāo)準(zhǔn)。

2.2 鷹嘴豆乳酶解條件優(yōu)化

為獲取α-葡萄糖苷酶抑制率較高的鷹嘴豆乳,對鷹嘴豆乳糊化、液化、糖化時間進(jìn)行了優(yōu)化。

2.2.1 糊化時間對鷹嘴豆乳α-葡萄糖苷酶抑制率的影響 不同糊化時間處理后鷹嘴豆乳α-葡萄糖苷酶抑制率測定結(jié)果如圖3所示。

圖3 糊化時間對鷹嘴豆乳α-葡萄糖苷酶抑制率的影響

由圖3可知,糊化時間為10 min時,α-葡萄糖苷酶抑制率僅為31.08%;隨著時間的延長,α-葡萄糖苷酶抑制率呈逐漸上升趨勢;糊化時間為40 min時,α-葡萄糖苷酶抑制率最高,為48.49%;糊化時間40 min后,α-葡萄糖苷酶抑制率顯著下降(p<0.05)。故選用的最適糊化時間為40 min。

2.2.2 液化時間對鷹嘴豆乳α-葡萄糖苷酶抑制率的影響 不同液化時間處理后鷹嘴豆乳α-葡萄糖苷酶抑制率測定結(jié)果如圖4所示。

圖4 液化時間對鷹嘴豆乳α-葡萄糖苷酶抑制率的影響

由圖4可知,液化時間為10～20 min時,α-葡萄糖苷酶抑制率無顯著差異(p>0.05);液化時間30 min后,α-葡萄糖苷酶抑制率顯著上升(p<0.05);液化時間為40 min時,達(dá)到最高,為65.48%;液化時間40 min后,α-葡萄糖苷酶抑制率顯著下降(p<0.05)。故選擇的最適液化時間為40 min。

2.2.3 糖化時間對鷹嘴豆乳α-葡萄糖苷酶抑制率的影響 不同糖化時間處理后鷹嘴豆乳α-葡萄糖苷酶抑制率測定結(jié)果如圖5所示。

圖5 糖化時間對鷹嘴豆乳α-葡萄糖苷酶抑制率的影響

由圖5可知,糖化前4 h,α-葡萄糖苷酶抑制率呈上升趨勢;糖化時間為4～12 h時的α-葡萄糖苷酶抑制率最高,均在78%左右,各個時間點(diǎn)無顯著性差異(p>0.05)。糖化時間12 h后,α-葡萄糖苷酶抑制率顯著下降(p<0.05)。為保證水解完全且盡量縮短反應(yīng)時間,故選擇的最適的糖化時間為6 h。

鷹嘴豆乳80 ℃糊化40 min,95 ℃液化40 min,60 ℃糖化6 h后,對α-葡萄糖苷酶抑制作用最佳。這可能是因?yàn)?鷹嘴豆中的α-葡萄糖苷酶抑制劑(如糖蛋白)經(jīng)酶解后得到充分釋放,淀粉等大分子成分降解,鷹嘴豆中含有的活性成分如黃酮、皂苷、多糖等活性成分得以充分溶出,使得α-葡萄糖苷酶抑制率升高[18-21]。但鷹嘴豆乳在糊化40 min、液化40 min和糖化10 h后繼續(xù)水解,α-葡萄糖苷酶抑制率逐漸下降,這可能是因?yàn)?隨著時間的延長,鷹嘴豆乳的活性成分逐漸分解并且含量下降,造成其活性功能的降低[22]。

2.3 單一穩(wěn)定劑對鷹嘴豆乳穩(wěn)定性的影響

單一穩(wěn)定劑不同添加量對鷹嘴豆乳離心沉淀率的影響如圖6所示。

圖6 單一穩(wěn)定劑添加量對對鷹嘴豆乳離心沉淀率的影響

由圖6A可知,當(dāng)瓜爾豆膠添加量小于0.03%時,鷹嘴豆乳的離心沉淀率呈升高趨勢;隨著瓜爾豆膠添加量的增加,離心沉淀率降低;瓜爾豆膠添加量為0.1%時,離心沉淀率最低,為19.23%;瓜爾豆膠添加量超過0.1%以后,離心沉淀率顯著升高(p<0.05)。故選擇0.1%為瓜爾豆膠最適添加量。

由圖6B可知,當(dāng)鷹嘴豆乳中黃原膠添加量為0～0.1%時,離心沉淀率先升高后緩慢降低;在黃原膠添加量為0.1%時,離心沉淀率最低,為20.43%;黃原膠添加量大于0.1%時,離心沉淀率顯著升高(p<0.05)。故最終選擇0.1%為黃原膠最適添加量。

由圖6D可知,在卡拉膠添加量小于0.01%時,鷹嘴豆乳的離心沉淀率呈升高趨勢;卡拉膠添加量在0.01%～0.1%范圍內(nèi)時,隨著添加量的增大,離心沉淀率顯著降低(p<0.05);當(dāng)卡拉膠添加量為0.1%時,離心沉淀率最小,為19.87%;卡拉膠添加量大于0.1%時,離心沉淀率顯著升高(p<0.05)。故最終選擇0.1%為卡拉膠最適添加量。

由圖6C、6E可知,在鷹嘴豆乳中分別添加果膠和海藻酸鈉以后,當(dāng)果膠和海藻酸鈉的添加量為0.01%時,離心沉淀率分別為20.70%和21.40%,均高于不添加穩(wěn)定劑時的離心沉淀率,且隨著添加量的增大,離心沉淀率不斷增大,故海藻酸鈉和果膠對鷹嘴豆乳的穩(wěn)定性均無明顯效果。

當(dāng)瓜爾豆膠、卡拉膠、黃原膠添加量分別小于0.03%、0.01%、0.01%添加量時,離心沉淀率反而升高,這可能是因?yàn)?加入的瓜爾豆膠、卡拉膠與黃原膠未達(dá)到一定的濃度,產(chǎn)生了絮凝現(xiàn)象,促進(jìn)了聚集的發(fā)生,使得離心沉淀率升高[23]。而在瓜爾豆膠、卡拉膠及黃原膠添加量超過0.1%后,離心沉淀率不同程度的增長,可能是因?yàn)樘砑恿窟^高導(dǎo)致粘度過大,產(chǎn)品變粘稠,導(dǎo)致離心率的增加,此時的離心沉淀率并不能準(zhǔn)確反映產(chǎn)品的穩(wěn)定性[24]。此外,產(chǎn)品變得粘稠糊口，也會影響到飲料的整體口感。

2.4 復(fù)配穩(wěn)定劑對應(yīng)對豆乳穩(wěn)定性的影響

在單一穩(wěn)定劑實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,選擇瓜爾豆膠、卡拉膠、黃原膠為實(shí)驗(yàn)因素,以離心沉淀率為考察指標(biāo),采取正交實(shí)驗(yàn)的方法進(jìn)行復(fù)配實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表2。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由極差分析看出,RB>RA>RC,卡拉膠添加量對鷹嘴豆乳穩(wěn)定性的影響最大,瓜爾豆膠次之,黃原膠最小。復(fù)配穩(wěn)定劑的最佳配方為A1B3C2,即瓜爾豆膠添加量0.08%,卡拉膠添加量0.10%,黃原膠添加量 0.08%,此時測得產(chǎn)品的離心沉淀率為18.86%。

3 結(jié)論

本研究通過先磨粉后浸泡的方式,確定了鷹嘴豆粉浸泡與制漿的條件:浸泡時間為7 h,料水比1∶10 (g/mL),此時鷹嘴豆乳蛋白質(zhì)的得率為97.89%。在保證蛋白質(zhì)含量符合國家標(biāo)準(zhǔn)[17]規(guī)定的前提下,大大提高了鷹嘴豆乳蛋白質(zhì)的得率。為得到對α-葡萄糖苷酶具有較高抑制作用的鷹嘴豆乳,以α-葡萄糖苷酶抑制率為指標(biāo),研究了糊化、液化、糖化條件對α-葡萄糖苷酶抑制作用的變化,結(jié)果表明,鷹嘴豆乳80 ℃糊化40 min,95 ℃液化40 min,60 ℃糖化6 h后,對α-葡萄糖苷酶抑制作用最高,抑制率達(dá)78.08%。

同時,采用復(fù)配穩(wěn)定劑保證鷹嘴豆乳產(chǎn)品的穩(wěn)定性。單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,瓜爾豆膠、卡拉膠和黃原膠能夠提高鷹嘴豆乳的穩(wěn)定性。正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,卡拉膠、瓜爾豆膠、黃原膠添加量分別為0.10%、0.08%、0.08%時,鷹嘴豆乳的穩(wěn)定性好,風(fēng)味獨(dú)特,口感柔和,且依然保持較高的α-葡萄糖苷酶抑制率,此時鷹嘴豆乳穩(wěn)定性最高,離心沉淀率為18.86%。