miR-182、信號(hào)傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3、基質(zhì)金屬蛋白酶-7與食管癌老年患者臨床病理及預(yù)后的關(guān)系

王巖峰 鄭玉環(huán)

(大慶油田總醫(yī)院病理科，黑龍江 大慶 163001)

食管癌為食管腺上皮或者鱗狀上皮的惡性病變，多發(fā)生于老年人群，其進(jìn)展較為緩慢，早期診治者治愈率高，但發(fā)病較隱匿，早期癥狀不明顯，臨床病理為老年食管癌患者預(yù)后評(píng)估的主要方式，目前臨床上缺乏對(duì)食管癌高危人群篩選、早期診斷及預(yù)后評(píng)估的典型標(biāo)志物〔1〕。細(xì)胞癌變屬多因素、多階段過程，與系列基因突變有著良好的相關(guān)性〔2〕。微小RNA(miR)-182具有高度的組織及腫瘤特異性，且穩(wěn)定性高，可調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄，參與腫瘤發(fā)生發(fā)展，為潛在調(diào)控靶點(diǎn)。信號(hào)傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT)3作為一種原癌基因，可起到信號(hào)傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄作用，從而調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、分化及侵襲轉(zhuǎn)移等〔3〕。同時(shí)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)降解能夠?qū)е履[瘤發(fā)生侵襲與轉(zhuǎn)移，MMP-7為其主要類型之一，可降解多種細(xì)胞外基質(zhì)〔4〕。多個(gè)研究證實(shí)〔5,6〕，miR-182、STAT3、MMP-7于多種腫瘤組織中高度表達(dá)，并指出其異常表達(dá)可能和患者臨床病理和預(yù)后相關(guān)。本研究旨在探討miR-182、STAT3、MMP-7于食管癌發(fā)生中的機(jī)制，并分析其和臨床病理與預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1一般資料 大慶油田總醫(yī)院2014年1月至2015年6月67例老年食管癌患者，納入標(biāo)準(zhǔn)〔7〕：均經(jīng)病理組織活檢證實(shí)為食管癌；年齡≥60歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：接受新輔助放化療；全身系統(tǒng)明顯病變。年齡60～79歲，平均(72.14±5.32)歲；腫瘤直徑大小2～8 cm，平均(4.33±1.02)cm。

1.2方法 ①標(biāo)本收集：手術(shù)收集癌與癌旁組織，放置于液氮中并轉(zhuǎn)移至-80℃低溫箱待用。②miR-182測(cè)定：將凍存的食管細(xì)胞珠復(fù)蘇后常規(guī)傳代培養(yǎng)，于6孔板中接種，待細(xì)胞豐度至90%時(shí)停止培養(yǎng)。取磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗，加入miR提取試劑盒中裂解液，采集細(xì)胞，并置于-80℃低溫箱中待用。取食管組織標(biāo)本，進(jìn)行固化、研碎，并加入miR提取試劑盒中裂解液。取分光光度計(jì)測(cè)定miR濃度和質(zhì)量。反轉(zhuǎn)錄后，加入miR-182，放置于熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)儀中實(shí)施PCR擴(kuò)增。并按2-△△Ct法計(jì)算miR-182相對(duì)表達(dá)量。③STAT3、MMP-7測(cè)定：選用免疫組織化學(xué)染色法進(jìn)行，將標(biāo)本組織制作為蠟塊并切片，脫蠟至水，并常規(guī)切片。經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化，取3%過氧化氫溶液將內(nèi)源性過氧化氫酶滅活。微波抗原修復(fù)，取正常養(yǎng)血清進(jìn)行非特異性抗原封閉。再予以復(fù)染、脫水、透明并封片。在光學(xué)顯微鏡下觀察，選擇圖像分析系統(tǒng)拍片。選擇MIAS2000圖像分析系統(tǒng)處STAT3及MMP-7陽性區(qū)域平均光密度值，并以此代表陽性產(chǎn)物表達(dá)；STAT3于細(xì)胞核或者細(xì)胞質(zhì)中陽性表達(dá)，且表現(xiàn)為棕黃色顆粒樣物質(zhì)。MMP-7于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)陽性表達(dá)，且表現(xiàn)為棕黃色顆粒樣物質(zhì)〔8〕。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPPS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，Spearman等級(jí)相關(guān)分析，Kaplan-Meier法繪制生存曲線，Cox回歸模型實(shí)施多因素影響分析。

2 結(jié) 果

2.1miR-182、STAT3、MMP-7于食管癌組織與癌旁組織中表達(dá) miR-182于食管癌組織與癌旁組織高表達(dá)率分別為52.24%(35/67)和14.93%(10/67)，STAT3分別為64.18%(43/67)和17.91%(12/67)，MMP-7分別為55.22%(37/67)和16.42%(11/67)，三者癌組織高表達(dá)率均顯著高于癌旁組織(P<0.05)。

2.2miR-182、STAT3、MMP-7與食管癌老年患者臨床病理關(guān)系 miR-182、STAT3、MMP-7高表達(dá)與食管癌老年患者性別、年齡、腫瘤直徑無關(guān)(P>0.05)；miR-182、STAT3、MMP-7高表達(dá)與食管癌分化程度、T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期有關(guān)(P<0.05)，見表1。

表1 miR-182、STAT3、MMP-7高表達(dá)與食管癌老年患者臨床病理的關(guān)系〔n(%)〕

2.3食管癌腫瘤組織中miR-182、STAT3、MMP-7表達(dá)相關(guān)性 67例食管癌中，miR-182、STAT3、MMP-7均為陽性表達(dá)者32例，均為陰性表達(dá)20例，miR-182、STAT3、MMP-7均呈正相關(guān)(P<0.05，miR-182與STAT3r=0.421，miR-182與MMP-7r=0.560，STAT3與MMP-7r=0.409)。

2.4miR-182、STAT3、MMP-7表達(dá)和食管癌患者預(yù)后聯(lián)系 miR-182高表達(dá)者和低表達(dá)者2年生存率分別為(19/35)和(25/32)，STAT3分別為(23/43)和(19/24)，MMP-7分別為(17/37)和(24/30)，miR-182、STAT3、MMP-7高表達(dá)者2年生存率均分別顯著低于低表達(dá)者(P<0.05)，見圖1。Cox比例風(fēng)險(xiǎn)顯示，分化程度、T分期、臨床分期和食管癌患者預(yù)后無關(guān)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、miR-182、STAT3、MMP-7高表達(dá)為食管癌患者預(yù)后獨(dú)立危險(xiǎn)因素。見表2。

圖1 食管癌患者不同miR-182、STAT3、MMP-7表達(dá)的生存分析

因素BSBWaldχ2值P值OR95%CI分化程度0.5710.3822.2340.1381.7730.820～3.776T分期0.6870.3623.6010.0722.0100.984～4.130淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移0.8310.3754.9110.0242.3411.020～4.873臨床分期0.1650.4080.1640.6731.1860.539～0.268miR-1820.7780.3624.6190.0282.1101.084～4.321STAT30.6420.4402.1290.0193.1211.248～8.761MMP-70.7090.3414.2250.0322.0850.874～3.720

3 討 論

盡管目前多個(gè)臨床病理學(xué)特征能夠一定程度地評(píng)估預(yù)后，但由于個(gè)體及腫瘤差異無法準(zhǔn)確預(yù)測(cè)腫瘤預(yù)后〔9，10〕。近年來，隨著臨床對(duì)細(xì)胞癌變機(jī)制的不斷認(rèn)識(shí)，發(fā)現(xiàn)部分分子標(biāo)記物能夠于腫瘤發(fā)生發(fā)展及預(yù)后評(píng)估中起重要作用〔11〕。既往研究已證實(shí)〔12〕基因異常表達(dá)是腫瘤發(fā)生的主要機(jī)制，miR可通過誘導(dǎo)特異性基因沉默，引起靶mRNA降解并影響蛋白質(zhì)合成，轉(zhuǎn)錄后可負(fù)性調(diào)節(jié)基因表達(dá)，起到抑癌基因或癌基因作用，為基因表達(dá)的新型調(diào)控因子。目前miR在食管癌中表達(dá)備受臨床關(guān)注，多種miR可異常表達(dá)，其中miR-203及miR-375下調(diào)能夠避免促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，降低腫瘤分期；miR-106b及miR-192等明顯上調(diào)，能夠?qū)е履[瘤細(xì)胞增殖與轉(zhuǎn)移〔13，14〕。魯之中等〔15〕研究表明，食管癌組織中miR-182表達(dá)明顯高于癌旁組織，并指出其可于食管癌發(fā)病中發(fā)揮癌基因作用，和本結(jié)果研究相似。本研究說明miR-182可能調(diào)控食管癌發(fā)生發(fā)展，是影響食管癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，可作為預(yù)后判斷的觀察指標(biāo)。

細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)障礙能夠影響細(xì)胞正常生長(zhǎng)、分化及代謝，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。STAT3通路可于細(xì)胞周期調(diào)控和凋亡中起到重要作用，機(jī)體正常狀態(tài)下其激活相對(duì)快速且短暫，從而維持正常細(xì)胞生理功能〔16〕。其調(diào)控異?？沙掷m(xù)性激活，刺激相關(guān)基因異常表達(dá)，并經(jīng)多種途徑導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生增殖及惡性轉(zhuǎn)化，引起免疫逃逸，并發(fā)揮致癌作用。研究證實(shí)〔17，18〕，STAT3可于乳腺癌、結(jié)直腸癌等實(shí)體腫瘤組織中持續(xù)激活，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞形成并抑制其凋亡。本文結(jié)果和臨床研究報(bào)道〔19〕相似，提示其可一定程度反映食管癌的分化程度與侵襲轉(zhuǎn)移等惡性特征。

目前認(rèn)為腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移為多步驟的復(fù)雜過程，其中細(xì)胞外基質(zhì)與基底膜降解為其中心環(huán)節(jié)，臨床研究證實(shí)〔20〕，MMPs能夠通過降解相關(guān)蛋白質(zhì)，引起腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移，且可誘導(dǎo)血管新生，加劇腫瘤形成。MMP-7作為其重要成員，對(duì)細(xì)胞基質(zhì)有廣泛降解作用，且可刺激其他MMPs表達(dá)。相關(guān)研究報(bào)道〔21〕，MMP-7主要于食管癌細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜中表達(dá)，且呈異質(zhì)性表達(dá)，本研究也支持此觀點(diǎn)。本研究提示MMP-7高表達(dá)能夠促進(jìn)腫瘤進(jìn)展，并可反映腫瘤病理體征，一定程度預(yù)測(cè)腫瘤惡性程度，與Ishikawa等〔22〕研究報(bào)道結(jié)果相似。本研究結(jié)果顯示，食管癌miR-182、STAT3及MMP-7之間表達(dá)呈正相關(guān)，可能與其存在共同通路，或者可于共同刺激因素下激活，有待研究證實(shí)。