6-BA與ZT對芫花莖段外植體組織培養(yǎng)的影響

張 虎，巫建新，許建民，宋 微

(江蘇農(nóng)林職業(yè)技術學院，江蘇 句容 212400)

芫花(DaphnegenkwaSieb.et Zucc.)為瑞香科瑞香屬落葉灌木，主要分布在中國黃河流域以南地區(qū)。芫花花期在春季，花常3至7朵簇生于短花軸上，先于葉開放，其花朵錦簇，花色艷麗，具有較高的觀賞價值，為我國優(yōu)良野生花卉資源[1-3]。芫花性寒，有毒，全株可入藥，是我國重要的中藥材和生物農(nóng)藥[4-6]。

從20世紀60年代開始，尤其是90年代以后，芫花的生境遭到嚴重破壞，種群分布范圍縮小，居群數(shù)量及個體數(shù)量急劇下降，其野生可利用資源逐漸減少[7]。研究芫花的繁殖技術成為保護和利用該植物資源的迫切要求。采用組織培養(yǎng)方法繁殖芫花，可保持母本優(yōu)良性狀，為優(yōu)良單株的快速擴大繁殖提供有效途徑。

國內外對芫花的藥理學研究表明，芫花含有黃酮苷元等多種藥用成分，其不同器官中所含藥物成分及其含量不盡相同，通過不同加工與炮制方法，可有效提高其藥用成分含量，其藥用成分具有抗早孕、抗炎、抗腫瘤活性等作用[8-14]。對芫花生物農(nóng)藥的研究表明，芫花具有β-谷甾醇、雪松醇等殺蟲活性成分，其提取物對抑制、殺死天牛和尺蠖等害蟲具有活性[15-17]。對芫花抑菌效果的研究表明，芫花提取物具有多種抑菌成分，對辣椒疫霉病、番茄灰霉病等植物病原菌具有抑菌活性[18-19]。但對芫花作為觀賞植物的研究相對較少，董春玲等對芫花開發(fā)成新花卉作物的前景進行了分析，初步探討了其在園林應用的主要形式[20]。目前關于芫花繁殖與栽培技術的相關研究不多，其莖段外植體組織培養(yǎng)快速繁殖技術在國內外尚未見報道。

本研究以芫花莖段為外植體，研究其初代組織培養(yǎng)技術，以建立可以快速繁殖的芫花組織培養(yǎng)技術體系，為芫花種質資源保存、工廠化育苗等研究提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料

芫花母本植株選自江蘇省句容市，江蘇農(nóng)林職業(yè)技術學院林木種質資源圃。芫花莖段外植體采自野生芫花優(yōu)株播種繁殖的2年生苗。芫花組織培養(yǎng)試驗于2016年10月在江蘇農(nóng)林職業(yè)技術學院園藝工程中心植物組織培養(yǎng)室內進行。

1.2 方法

采集生長健壯，腋芽飽滿，無病蟲害的芫花當年生枝條，去除葉片，剪截成10 cm左右?guī)б秆壳o段，用洗衣粉液浸泡，清洗20 min，接著用流水沖洗12 h。

在超凈工作臺上，把外植體剪為3—4 cm莖段，用無菌水沖洗3遍。采用75%乙醇消毒莖段30 s，放入0.1%的升汞加3—5滴吐溫80的混合液浸泡消毒，處理時間分別為8，10，12，14 min；用無菌水沖洗后，剪截成2 cm左右具節(jié)莖段，接入MS固體培養(yǎng)基；每處理莖段30個，重復3次。

用消毒獲得的無菌帶芽莖段進行初代培養(yǎng)試驗。采用MS+0.2 mg/L NAA+(0.5，2.0，5.0) mg/L 6-BA和MS+0.1 mg/L NAA+(1.0，1.5，2.0) mg/L ZT，共6個處理進行試驗。每處理30個莖段，重復3次。

1.3 培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件

將接種外植體置于培養(yǎng)室進行培養(yǎng)，室內溫度(24±1) ℃，相對濕度75%，光照強度2 500 lx，光周期L14∶D10 ，培養(yǎng)25 d。MS固體培養(yǎng)基加入蔗糖30 g/L及瓊脂7 g/L，按配方質量濃度加入植物生長調節(jié)劑及調整酸堿度至pH為5.8。

1.4 數(shù)據(jù)處理

觀測污染率、死亡率、存活率、萌發(fā)率、玻璃化率、萌芽均高等指標，數(shù)據(jù)統(tǒng)計均在培養(yǎng)25 d時進行，數(shù)據(jù)采用 SPSS 軟件進行方差分析和多重比較。相關指標計算如下:

污染率(%)=(外植體污染數(shù)/接種外植體總數(shù))×100;

死亡率(%)=(外植體死亡數(shù)/接種外植體總數(shù))×100;

存活率(%)=100-污染率(%)-死亡率(%);

萌發(fā)率(%)=(腋芽萌發(fā)的外植體數(shù)/接種外植體總數(shù))×100;

玻璃化率(%)=(玻璃化外植體數(shù)/接種外植體總數(shù))×100;

萌芽均高(cm)=萌發(fā)新梢長度之和/接種外植體總數(shù)。

2 結果與分析

2.1 消毒方式對外植體滅菌效果的影響

2.1.1 預處理無流水沖洗環(huán)節(jié)的消毒方法對芫花莖段外植體滅菌效果的影響 預處理采用洗衣粉液浸泡芫花莖段外植體20 min，消毒采用75%乙醇30 s+0.1%升汞8—14 min進行滅菌處理,并調查污染率，將污染率數(shù)據(jù)進行方差分析，試驗結果見表1。

表1 預處理無流水沖洗環(huán)節(jié)的消毒方法對芫花莖段外 植體滅菌效果的影響

同列數(shù)據(jù)后相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)

預處理無流水沖洗環(huán)節(jié)的消毒方法對芫花莖段外植體消毒處理的污染率為87.8%—100.0%，各處理無顯著差異。由此可知，預處理過程中無流水沖洗環(huán)節(jié)的消毒方法，污染率高，外植體消毒效果不理想。

2.1.2 預處理加流水沖洗環(huán)節(jié)的消毒方法對芫花莖段外植體滅菌效果的影響 預處理采用洗衣粉液浸泡芫花莖段外植體20 min，接著用流水沖洗12 h；然后采用75%乙醇30 s +0.1%升汞加3—5滴吐溫80混合液8—14 min進行滅菌處理，結果見表2。

表2 預處理加流水沖洗的消毒方法對芫花莖段外植體滅菌效果的影響

處理污染率/%死亡率/%存活率/%75%乙醇30 s+升汞吐溫混合液8 min91.1 a3.3 b5.6 c75%乙醇30 s+升汞吐溫混合液10 min70.0 b8.9 b21.1 b75%乙醇30 s+升汞吐溫混合液12 min57.8 bc13.3 b28.9 a75%乙醇30 s+升汞吐溫混合液14 min44.4 c35.6 a20.0 b

同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

預處理加流水沖洗環(huán)節(jié)的消毒方法其污染率隨消毒時間的延長逐漸下降。消毒8 min處理的污染率為91.1%，顯著高于其他各處理；消毒14 min污染率最低，為44.4%，顯著低于8，10 min處理；消毒12，14 min處理污染率差異不顯著。

預處理加流水沖洗環(huán)節(jié)的消毒方法莖段外植體死亡率隨消毒時間的延長逐漸上升。消毒14 min死亡率為35.6%，顯著高于其他各處理；消毒8，10，12 min的處理，其死亡率均在13.3%以下，各處理間差異不顯著。

預處理加流水沖洗環(huán)節(jié)的消毒方法莖段外植體的存活率數(shù)據(jù)分析表明，消毒8min處理的存活率為5.6%，效果最差，顯著低于其他處理；消毒10 min和14 min存活率為21.1%和20.0%；消毒12 min效果最好，存活率達28.9%，顯著高于其他處理。

綜合分析污染率、死亡率與生存率的試驗結果可知，芫花莖段外植體的最佳消毒方法為預處理采用洗衣粉液浸泡芫花莖段外植體20 min，接著用流水沖洗12 h；消毒采用75%乙醇30 s+0.1%升汞吐溫80混合溶液12 min處理，其污染率為57.8%，死亡率為13.3%，存活率為28.9%。

2.2 6-BA與ZT質量濃度對初代培養(yǎng)的影響

采用6-BA與ZT不同質量濃度的植物生長調節(jié)劑配方處理對芫花莖段外植體萌發(fā)與生長情況的影響見表3。

6-BA與ZT不同質量濃度處理芫花莖段外植體，對萌芽率的影響結果表明，6-BA各質量濃度處理其萌芽率在34.4%以下，ZT各質量濃度處理其萌芽率在74.4%以上，6-BA處理萌芽率顯著低于ZT處理。由此可知，對芫花的外植體的初代培養(yǎng)細胞分裂素采用ZT，對芫花莖段外植體芽萌發(fā)的促進效果顯著優(yōu)于6-BA。在不同生長調節(jié)劑配方處理中，MS+0.1 mg/L NAA+1.5 mg/L ZT處理對芫花莖段外植體芽萌發(fā)效果顯著優(yōu)于其他處理，萌發(fā)率達到92.2%。

表3 6-BA與ZT質量濃度對芫花莖段初代培養(yǎng)的影響

同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

6-BA與ZT不同質量濃度處理芫花莖段外植體，對玻璃化率的影響結果表明，隨著細胞分裂素6-BA與ZT質量濃度升高，芫花莖段外植體初代培養(yǎng)玻璃化現(xiàn)象逐漸加劇。6-BA處理玻璃化率在52.2%以上，ZT處理玻璃化率在42.2%以下，6-BA處理玻璃化率顯著高于ZT處理。在不同生長調節(jié)劑配方處理中，MS+0.1 mg/L NAA+1.0 mg/L ZT 處理與MS+0.1 mg/L NAA+1.5 mg/L ZT處理，對芫花莖段外植體初代培養(yǎng)中減少玻璃化現(xiàn)象顯著優(yōu)于其他處理，玻璃化率小于22.3%。

6-BA與ZT不同質量濃度處理芫花莖段外植體，對萌芽平均高度的影響結果表明，6-BA處理萌芽均高在0.66 cm以下，ZT處理萌芽均高在1.06 cm以上，6-BA處理萌芽均高顯著低于ZT處理。在不同生長調節(jié)劑配方處理中，MS+0.1 mg/L NAA+1.0 mg/L ZT 處理與MS+0.1 mg/L NAA+1.5 mg/L ZT處理，對芫花莖段外植體初代培養(yǎng)中萌芽平均高度顯著優(yōu)于其他處理，萌芽均高分別為1.67 cm和2.13 cm。

綜合分析萌發(fā)率、玻璃化率與萌芽均高的試驗結果可知，芫花莖段外植體初代培養(yǎng)誘導叢生芽的最佳配方為MS+0.1 mg/L NAA+1.5 mg/L ZT，其萌發(fā)率為92.2%，玻璃化率為22.3%，萌芽均高為2.13 cm。

芫花莖段外植體誘導叢生芽，不同歷時的生長情況見圖1。

圖1 芫花莖段外植體初代培養(yǎng)生長情況

3 結論與討論

綜上所述，芫花莖段外植體的最佳消毒方法，為預處理采用洗衣粉液浸泡20 min，用流水沖洗12 h；消毒采用75%乙醇30 s+0.1%升汞吐溫80混合溶液12 min處理，其污染率為57.8%，死亡率為13.3%，存活率為28.9%。芫花莖段外植體初代培養(yǎng)誘導叢生芽的最佳配方為MS+0.1 mg/L NAA+1.5 mg/L ZT，其萌發(fā)率為92.2%，玻璃化率為22.3%，萌芽均高為2.13 cm。

植物組織培養(yǎng)過程中，外植體帶菌是最主要的污染來源[21]。外植體體表被毛或表面粗糙則消毒困難，采用乙醇、升汞等殺菌劑消毒，消毒時間短則污染率高，延長消毒時間則會導致外植體中毒致死加劇[22]。消毒預處理過程中，外植體采用流水沖洗有助于去除附著在體表組織的污物，在消毒溶液中添加表面活性劑吐溫，有助于殺菌劑浸潤外植體表面，進而提高殺菌效果[23]。芫花莖段外植體消毒效果試驗表明，預處理增加流水沖洗環(huán)節(jié)，升汞消毒添加吐溫80，是提高其外植體消毒效果的有效途徑。這與芫花新梢表面密被茸毛、污染物不易清潔的特性相關。

植物體細胞具有全能性，實踐中愈傷組織能否表達其全能性，進而產(chǎn)生叢生芽具有不確定性。本試驗采用芫花莖段外植體，誘導叢生芽的初代組織培養(yǎng)方法，較張恒基等采用腋芽外植體脫分化形成愈傷組織[24]，進一步誘導叢生芽的培養(yǎng)方法更為便捷。2種方法研究思路不同，可互為補充。

植株生長發(fā)育過程與植株的內源和外源激素種類、含量及配比等有密切關系[25]。植物對于不同外源激素的響應成因復雜。本試驗芫花莖段外植體的初代培養(yǎng)中，細胞分裂素ZT對芫花莖段芽萌發(fā)與生長的促進效果明顯優(yōu)于6-BA，這一結論與張恒基等對芫花愈傷組織分化成芽和不定芽增殖試驗研究結論相似[24]。這一結果表明，芫花莖段外植體組織培養(yǎng)時，在芽的分化、萌發(fā)、長成階段，ZT作為外源激素具有重要促進作用，6-BA不可替代其作用。

植物組織培養(yǎng)過程的玻璃化苗發(fā)生百分率和細胞分裂素成正相關,其中6-BA的影響大于ZT和KT[26]。本試驗中，6-BA較ZT更容易導致芫花試管苗的玻璃化現(xiàn)象，這一結論與陳兵先等結論相一致[26]。本試驗中，ZT的質量濃度為1.0—1.5 mg/L，其玻璃化率維持在17.8%—22.3%之間；ZT的質量濃度達到2.0 mg/L時，玻璃化率升高至42.2%，顯著高于ZT其他處理。從本試驗結果看，芫花莖段外植體組織培養(yǎng)中，ZT質量濃度應限制在 2.0 mg/L以下。

張慧君等研究認為，植物的外源激素須通過對內源激素的調節(jié)，來控制器官的生長發(fā)育，各種植物生長物質的水平，都通過影響植物外植體的基因表達而引起器官分化[27]。芫花組織培養(yǎng)休眠芽的萌發(fā)、愈傷組織分化成芽、成枝的過程中，外源激素如何影響內源激素，進而完成形態(tài)構成的機理，還有待進一步研究。