心室輔助裝置溶血檢測(cè)及關(guān)鍵問題研究

侯曉旭，李澍，王浩，羅維娜，王權(quán)，任海萍

中國(guó)食品藥品檢定研究院 醫(yī)療器械檢定所，北京 102629

引言

目前除心臟移植外，心室輔助裝置已經(jīng)作為一種臨床上可供考慮的選擇，對(duì)心力衰竭的病人進(jìn)行輔助，提高患者的生活質(zhì)量和生存率[1-2]。目前市面可用的心室輔助裝置基本都是連續(xù)旋轉(zhuǎn)式血泵（軸流泵和離心泵），溶血性是這些裝置的關(guān)鍵性能為之一，用于評(píng)價(jià)血泵對(duì)血液的損傷程度。從不良事件反饋上看，目前出現(xiàn)的中風(fēng)等術(shù)后不良反應(yīng)都與血泵溶血性能有關(guān)[3-4]。因此，量化心室輔助裝置的血液損傷程度、評(píng)價(jià)系統(tǒng)的溶血性能對(duì)質(zhì)量評(píng)價(jià)至關(guān)重要[5]。

從本質(zhì)上講，造成心室輔助裝置溶血的根本原因是機(jī)械剪切力和應(yīng)力暴露時(shí)間[6]。不同于人體心臟的容積變化式的血流驅(qū)動(dòng)，旋轉(zhuǎn)式血泵通過葉輪旋轉(zhuǎn)（一般都在1000 rpm以上），為血流提供動(dòng)力[7]?？梢韵胂?，在如此高速的旋轉(zhuǎn)過程中，紅細(xì)胞會(huì)受到很大的剪切力作用，從而引起細(xì)胞的變形（收縮和拉伸）。當(dāng)長(zhǎng)時(shí)間暴露在強(qiáng)剪切力條件下，細(xì)胞變形超過細(xì)胞所能承受的程度，暴露時(shí)間超過了人體的自我修復(fù)速度，紅細(xì)胞可能失能而破裂，從而使細(xì)胞內(nèi)的血紅蛋白游離到血漿中[6,8]。

標(biāo)準(zhǔn)溶血指數(shù)（Normalized Index of Hemolysis，NIH）是定量衡量溶血的特征指標(biāo)[9-10]。通過相對(duì)規(guī)范化的NIH測(cè)量可以定量了解血泵對(duì)血液的破壞程度。一般認(rèn)為NIH值大于＞0.1 g/100 L，則認(rèn)為出現(xiàn)溶血。ASTM F1841-97[11]標(biāo)準(zhǔn)對(duì)連續(xù)流血泵的溶血測(cè)試給出了指導(dǎo)方法，血泵需經(jīng)過6 h溶血測(cè)試，每1 h進(jìn)行一次血液采樣，最終用6 h測(cè)試的NIH平均值來(lái)評(píng)價(jià)血泵的溶血性能。本文在ASTM F1841-97的基礎(chǔ)上，針對(duì)標(biāo)準(zhǔn)中未進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明的部分進(jìn)行細(xì)化和討論。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 血液采集的要求

血液采自正常體溫、明顯的疾病特征的動(dòng)物血液，采集前禁食12 h。用大孔針（14 G）通過血管穿刺采集血液，并采集到含有肝素的標(biāo)準(zhǔn)血袋中。采血過程通過重力作用自然流出，或使用不超過100 mmHg的負(fù)壓引出。血液從采集到使用建議在24 h以內(nèi)，并在2℃～8℃環(huán)境下冷藏保存。血液在使用時(shí)推薦在37℃±1℃水浴下加溫至生理溫度。在水浴過程中要特別注意小氣泡的產(chǎn)生，這些小氣泡宜在進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)前通過取樣口進(jìn)行消除。為了去除血液中的微粒、微血栓和聚集的血小板，在血液進(jìn)入循環(huán)時(shí)用一個(gè)口徑為74 μm的濾網(wǎng)對(duì)血液進(jìn)行過濾。

1.1.2 測(cè)試回路及工作條件

封閉測(cè)試回路包括一根總長(zhǎng)為2 m，內(nèi)徑為9.5 mm的聚氯乙烯管，血袋（12 cm×12 cm），壓力傳感器，流量傳感器和待測(cè)試血泵。首先回路中應(yīng)充滿生理鹽水，以清洗并濕潤(rùn)所有與血液接觸的表面。在加血液之前，應(yīng)通過采樣口去除回路中的小氣泡。根據(jù)血液初始血?dú)夥治鼋Y(jié)果以及目標(biāo)紅細(xì)胞壓積值，計(jì)算灌注血液目標(biāo)體積和生理鹽水目標(biāo)體積。按照目標(biāo)體積從回路中抽出多余的生理鹽水，同時(shí)向回路中注入目標(biāo)體積的血液，注意避免回路中產(chǎn)生氣泡。用以控制壓力條件的阻力閥應(yīng)放在泵的出口側(cè)。在測(cè)試回路的入口及出口處連接壓力表，見圖1。泵的流量應(yīng)設(shè)定為（5±0.25）L/min，循環(huán)血液溫度為37℃±1℃。壓力設(shè)定為（100±10）mmHg[12-13]。

圖1 測(cè)試回路

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)步驟

圖1中描述了溶血測(cè)試的標(biāo)準(zhǔn)閉合回路，該回路由一臺(tái)被測(cè)試的泵、血袋、三通采樣口、壓力傳感器及一個(gè)阻力閥組成。血液被加熱到37℃，通過重力作用經(jīng)過三通管灌輸?shù)綔y(cè)試回路中。開啟血泵，將其調(diào)整到待測(cè)試的試驗(yàn)條件。在測(cè)試回路運(yùn)行大約5 min，并且回路中的氣泡已排出之后，通過采樣口采集第一個(gè)血樣，作為0時(shí)間點(diǎn)的血樣。

測(cè)試周期為6 h，在血泵循環(huán)5 min后采集第一個(gè)血樣，之后每隔1 h采集一次，共計(jì)6個(gè)血樣。為了確保采樣的準(zhǔn)確性，在采集血樣之前，對(duì)血袋進(jìn)行輕輕地?cái)D壓，并舍棄采樣口附近的2 mL血樣。在整個(gè)測(cè)試周期中循環(huán)血液溫度宜保持在37℃±1℃。

1.2.2 采樣過程

在循環(huán)期間，每小時(shí)從血袋中采集3～8 mL的血樣。在每次采樣時(shí)，采集兩份血樣，將第一次取的樣品丟棄，因?yàn)樗赡軙?huì)含有滯留在采樣口的一些血液。第二次采集的血樣應(yīng)用于測(cè)量血漿游離血紅蛋白。

1.2.3 游離血紅蛋白濃度的測(cè)試

采集的血液通過離心法獲得上清血漿[14-15]。血漿中的游離血紅蛋白通常以氧合血紅蛋白的形式存在，將血漿使用0.1%碳酸鈉溶液稀釋后其在415 nm處存在強(qiáng)吸收峰，采用微孔板分光光度計(jì)（酶標(biāo)儀）在415 nm波長(zhǎng)處讀數(shù)測(cè)定氧合血紅蛋白吸光度值，并通過在380 nm和450 nm波長(zhǎng)處的讀數(shù)消除血漿中尿卟啉的干擾。計(jì)算公式如下：

配 制 了 2.5、5、10、20、30、40、50、60、80、100、150 mg/dL濃度的血紅蛋白溶液，并加入0.01%的Na2CO3稀釋。最終測(cè)試結(jié)果如下，以血紅蛋白的吸光度對(duì)樣品濃度進(jìn)行回歸分析，并得到標(biāo)準(zhǔn)濃度曲線：y=0.0018x+0.00123（圖2）。血紅蛋白濃度與吸光度在2.5～150 mg/dL范圍內(nèi)均成線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.99674。

圖2 血紅蛋白濃度與吸光度濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.2.4 數(shù)據(jù)計(jì)算和分析

報(bào)告每臺(tái)血泵的NIH平均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差及變異系數(shù)。

式中： NIH表示標(biāo)準(zhǔn)溶血指數(shù)，單位為克每100 L（g/100L）；△free Hb指在采樣時(shí)間間隔內(nèi)，血漿游離血紅蛋白濃度的增加量（g/L）；V指回路容量，單位為升（L）；Q為流量，單位為升每分鐘（L/min）；Hct為紅細(xì)胞壓積，單位為百分比（%）；T為采樣時(shí)間間隔，單位為分鐘（min）。

2 討論

2.1 溶血限值的討論

不難設(shè)想，如果一個(gè)外來(lái)因素（例如心室輔助裝置）對(duì)紅細(xì)胞造成的破壞程度和速度不超過自然衰亡，那么可以認(rèn)為該裝置是安全可行的。因此，生物體對(duì)游離血紅蛋白的耐受度一直受到學(xué)者的關(guān)注。從公式(1)來(lái)看，標(biāo)準(zhǔn)溶血指數(shù)的定義其實(shí)質(zhì)就是在單位時(shí)間內(nèi)，通過單位橫截面積所破壞的紅細(xì)胞的質(zhì)量。由于人體自身的骨髓具有造血功能，紅細(xì)胞會(huì)自然衰亡并不斷更新，大約3個(gè)月左右，血液中的紅細(xì)胞將全部更新一次。因此，我們可以大概估算下溶血指數(shù)的最大允許值（Haemolytic Index，HI）。設(shè)一個(gè)正常成人的紅細(xì)胞在血液中的密度是14 g/100mL[12]，人體的血液的平均流量為5 L/min，總體積為5 L。則

因此，溶血指數(shù)的極限值為0.1 g/dL。對(duì)任何一種心室輔助裝置而言，若想臨床應(yīng)用，給予一定得冗余值，一般為最大值的十分之一左右，因此，要求其溶血指標(biāo)必須保證不得高于0.01 g/dL。

2.2 入組血液質(zhì)量要求

血泵引起的溶血主要取決于血泵的設(shè)計(jì)、結(jié)構(gòu)和所使用的材料。用于體外評(píng)價(jià)血液破壞的血源在很大程度上將會(huì)影響血泵性能評(píng)價(jià)的結(jié)果。體外溶血試驗(yàn)的試驗(yàn)結(jié)果很大程度上會(huì)受到供血者物種、血液的生化狀態(tài)（堿剩余、葡萄糖）、血紅蛋白及紅細(xì)胞壓積等因素的影響。因此，用于體外評(píng)價(jià)血泵溶血性能的血液進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化是非常重要的，而且這將會(huì)使試驗(yàn)結(jié)果具有普遍的可比性。

2.2.1 供血者物種的考慮

一般來(lái)說(shuō)，供血物種包括牛、羊和豬等大動(dòng)物以及志愿者的血液。Harboe[16]評(píng)估了剪切應(yīng)力對(duì)牛、綿羊和豬血液中的細(xì)胞和蛋白質(zhì)的影響。并使用流變儀對(duì)來(lái)自不同物種的血液進(jìn)行各種剪切速率0～8000 s分析?？傮w而言，增加剪切速率會(huì)使所有測(cè)試物種血液的血?jiǎng)?chuàng)傷增加。不同物種之間血液的破壞主要體現(xiàn)在溶血、血小板激活以及血管性血友病因子（von Willebrand Factor，vWF）的結(jié)構(gòu)和功能。與人血相比，在剪切力作用下，豬血具有最大的彈性、較少程度的溶血、相似的血細(xì)胞數(shù)量、較少的血小板激活以及較少的vWF損傷；牛血具有較少的溶血、相似的血細(xì)胞數(shù)量、較高的血細(xì)胞激活以及相似的vWF損傷，對(duì)于剪切力總體體現(xiàn)出較少的影響；綿羊血具有最小的彈性。牛血與人血最為相似，因此文獻(xiàn)建議用牛血來(lái)評(píng)估體外的溶血測(cè)試。

2.2.2 血液的生化狀態(tài)的考慮

為確保測(cè)試結(jié)果的準(zhǔn)確性，游離血紅蛋白濃度超過20 mg/dL的待測(cè)血液將不被采用。測(cè)試用血液的血細(xì)胞比容應(yīng)在28%～32%范圍內(nèi)。另外血液的其它指標(biāo)如pH值、血糖等參數(shù)應(yīng)在正常值范圍內(nèi)。血液的過酸或過堿都會(huì)導(dǎo)致血液的破壞。而另一方面，根據(jù)滲透學(xué)原理，當(dāng)外界的葡萄糖濃度過低時(shí)，葡萄糖溶液中的水分子開始擴(kuò)散進(jìn)入紅細(xì)胞，最終使紅細(xì)胞吸水膨脹至破裂，因而產(chǎn)生溶血現(xiàn)象。因此在體外測(cè)試溶血前，一般建議BE（堿剩余）調(diào)節(jié)在（0±5）nmol/L、葡萄糖濃度應(yīng)大于90 mg/dL。

2.3 游離血紅蛋白檢驗(yàn)方法的討論

測(cè)定血液中游離血紅蛋白濃度的方法有很多[15]，有物理測(cè)定方法，包括比重法、折射率法等，也可由根據(jù)血紅蛋白的化學(xué)結(jié)合力，如血紅蛋白可與O2和CO結(jié)合生成HBO2和HBCO，與氰化物結(jié)合生成氰化高鐵血紅蛋白，再根據(jù)衍生物的光譜特性進(jìn)行測(cè)定。由于測(cè)量方法較多，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)室間的檢測(cè)結(jié)果缺乏可比性。針對(duì)這種情況，國(guó)際血液學(xué)標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)成立了血紅蛋白專家組,該專家組于1967年在測(cè)定了氰化高鐵血紅蛋白摩爾吸光系數(shù)的基礎(chǔ)上，確定了以氰化高鐵血紅蛋白法為血紅蛋白測(cè)試的參考方法。但使用的氰化鉀試劑含有劇毒物質(zhì)，對(duì)使用者及環(huán)境有一定的危害，謹(jǐn)慎考慮，我們采用了碳酸鈉測(cè)試方法對(duì)游離血紅蛋白濃度進(jìn)行測(cè)試[15-16]。總體來(lái)說(shuō)，碳酸鈉的化學(xué)性質(zhì)相對(duì)穩(wěn)定，且無(wú)毒無(wú)生物危險(xiǎn)，水溶液呈堿性，能與血紅蛋白迅速結(jié)合形成紅色堿化血紅蛋白。因此，實(shí)際檢測(cè)中，采用碳酸鈉血紅蛋白測(cè)試法，能大量減少醫(yī)療廢棄物，很大程度上彌補(bǔ)氰化高鐵血紅蛋白法的不足，但為了保證試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，建議使用全血質(zhì)控品或與氰化高鐵血法同時(shí)檢測(cè)進(jìn)行校正。

3 結(jié)論

溶血特性是衡量VAD對(duì)血液成分和理化性質(zhì)影響的重要指標(biāo)。通過溶血測(cè)試，評(píng)價(jià)血泵的溶血性能，對(duì)于保證血泵的有效性和安全性具有重要意義。溶血指數(shù)NIH的物理意義是反映輸出100 L壓積標(biāo)準(zhǔn)化血液產(chǎn)生的FHB含量，是目前世界上公認(rèn)的體外評(píng)價(jià)血泵溶血性能的金標(biāo)準(zhǔn)。血泵設(shè)計(jì)廠商有必要使用具有良好血液相容性的血泵材料，并優(yōu)化加工工藝，使血泵具有良好的熱傳導(dǎo)性能和較低的機(jī)械產(chǎn)熱。設(shè)計(jì)時(shí)引入計(jì)算流體力學(xué)分析，優(yōu)化結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)，詳細(xì)分析泵體內(nèi)部流場(chǎng)和剪切應(yīng)力分布，減少于溶血密切相關(guān)的高剪切力和振蕩剪切力分布區(qū)域，減少血液接觸面積。本文采用ASTM F1841-97標(biāo)準(zhǔn)，搭建了檢測(cè)平臺(tái)，進(jìn)行了溶血指數(shù)測(cè)量，明晰了實(shí)現(xiàn)方法和細(xì)節(jié)，希望供研發(fā)和評(píng)價(jià)人員借鑒。

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