體癬動(dòng)物模型制備規(guī)范(草案)起草說明

中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)中藥實(shí)驗(yàn)藥理專業(yè)委員會(huì)

1 造模動(dòng)物[1-5]

現(xiàn)用于造體癬模型的動(dòng)物有猩猩、裸鼠、猴、兔、豚鼠、大鼠、小鼠等，豚鼠、大鼠是常用的造模型動(dòng)物。豚鼠對(duì)多種病原體敏感，常用于多種病原體的分離與診斷，是建立體癬模型最適宜的動(dòng)物。一般選用成年動(dòng)物，雌雄各半。

2 飼養(yǎng)環(huán)境[6]

動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境應(yīng)符合GB 14925-2010 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境與設(shè)施、《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物國家標(biāo)準(zhǔn)》《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》《中華人民共和國動(dòng)物保護(hù)法》等要求，符合相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)及等級(jí)動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境的要求。

3 造模方法及評(píng)價(jià)依據(jù)

目前體癬的病因病機(jī)尚無明確定論，但有“真菌感染是發(fā)生體癬的重要因素”的學(xué)說。中醫(yī)則因膚熱多汗、濕熱內(nèi)蘊(yùn)，或久病氣血虧損、正氣不足、抗邪無力等所致。主要基于西醫(yī)學(xué)說制備體癬模型。以西醫(yī)標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)為主，中醫(yī)標(biāo)準(zhǔn)供參考[7]。

體癬動(dòng)物模型評(píng)價(jià)的西醫(yī)標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)的是《皮膚性病學(xué)》[8]：①輕微的炎癥、紅斑、丘疹、水泡；②有丘疹和水皰組成的邊緣，中央有愈合傾向；③確診需真菌學(xué)檢查，包括直接鏡檢陽性或真菌培養(yǎng)陽性即可確診，但陰性不能除外診斷。體癬模型評(píng)價(jià)的中醫(yī)標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)《中醫(yī)皮膚病學(xué)》[9]：①初起出現(xiàn)群簇針頭大小淡紅色丘疹；②邊緣清楚，覆蓋鱗屑；③中央炎癥較輕或色素沉著；④可發(fā)全身或大部分肢體；⑤炎癥較重時(shí)邊緣有斷續(xù)水皰、膿皰、結(jié)痂；⑥鏡檢可查到菌絲與孢子。

3.1 刮傷法接種須癬毛癬菌(或石膏毛癬菌、或石膏樣小孢子菌等)制備豚鼠(大鼠體)癬模型[10-11]

原理：導(dǎo)致體癬的真菌以紅色毛癬菌最常見，還有須癬毛癬菌、斷發(fā)毛癬菌、犬小孢子菌、絮狀表皮癬菌和紫色毛癬菌等。真菌侵入表皮后寄生于表質(zhì)層，只在局部引起輕度炎癥，初起為紅丘疹或小水皰，繼之形成鱗屑，再向周圍逐漸擴(kuò)展成邊界清楚的環(huán)形損害，邊緣?？梢娗鹫睢⑺?，表面一般無滲液。

與臨床指標(biāo)吻合情況：本模型符合西醫(yī)標(biāo)準(zhǔn)①②③，吻合度≥90%；符合中醫(yī)標(biāo)準(zhǔn)①②③⑤⑥，吻合度≥80%。

注意：刮傷的面積直接影響后期真菌的接種；接種區(qū)域的打磨深度不好控制，應(yīng)盡量減少人為誤差。

3.2 穿刺法接種石膏毛癬菌制備豚鼠體癬模型[12]

原理：皮膚真菌感染以紅色毛癬菌最常見，還有須癬毛癬菌、斷發(fā)毛癬菌、犬小孢子菌、絮狀表皮癬菌和紫色毛癬菌等。真菌侵入表皮后寄生于表質(zhì)層，只在局部引起輕度炎癥，初起為紅丘疹或小水皰，繼之形成鱗屑，再向周圍逐漸擴(kuò)展成邊界清楚的環(huán)形損害，邊緣?？梢娗鹫?、水皰，表面一般無滲液。

與臨床指標(biāo)吻合情況：本模型符合西醫(yī)標(biāo)準(zhǔn)①②③，吻合度≥90%；符合中醫(yī)標(biāo)準(zhǔn)①②⑤⑥，中醫(yī)吻合度≥60%。

注意：接種真菌的量及活度是影響體癬模型的重要因素，應(yīng)盡量一致。穿刺法所致豚鼠體癬模型對(duì)中藥水煎液和粗提物比較敏感。

4 觀測(cè)指標(biāo)

4.1 表觀指標(biāo)：I類指標(biāo)(核心指標(biāo))

體癬的表觀指標(biāo)在西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)中占有重要地位，在評(píng)價(jià)體癬動(dòng)物模型時(shí)，表觀指標(biāo)也應(yīng)占主要地位。體癬動(dòng)物模型紅斑面積(可以采用圖像分析系統(tǒng)測(cè)定其具體面積的大小)、鱗屑情況等是最直接的表觀指標(biāo)，可將其分四級(jí)進(jìn)行積分：0分：無病變；1分：少數(shù)紅斑性丘疹或病變趨向痊愈，新生體毛長(zhǎng)出；2分：紅斑融合或呈島狀散在且周圍發(fā)紅；3分：紅斑全面擴(kuò)大，有大量鱗屑及厚皮；4分：伴有出血及病變。體癬動(dòng)物模型其他相關(guān)表觀指標(biāo)也可以進(jìn)行四級(jí)分級(jí)，有利于對(duì)模型情況的判斷。分級(jí)情況如下：

表1 體癬動(dòng)物模型表觀指標(biāo)的分級(jí)

根據(jù)西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)，體癬最直接的表現(xiàn)為病變局部皮膚有彌漫性紅斑、細(xì)碎鱗屑、小片棕褐色結(jié)癡。表觀指標(biāo)可以直接反映體癬模型復(fù)制成功與否，是核心指標(biāo)，權(quán)重系數(shù)0.4。

4.2 病理指標(biāo)：II類指標(biāo)(直接相關(guān)指標(biāo))

體癬動(dòng)物模型制備成功后局部病理變化，動(dòng)物皮膚鱗狀上皮明顯增生，角化層增厚，皮下組織可見彌散性炎細(xì)胞浸潤(rùn)。

體癬局部皮膚病理改變是評(píng)判皮損程度的依據(jù)，體癬局部組織病理半定量參考標(biāo)準(zhǔn)[10-11]：“-”：背側(cè)皮膚鱗狀上皮、角化層、皮下組織正常；“+”：背側(cè)皮膚鱗狀上皮有增生，角化層有增厚，皮下組織可見散在炎細(xì)胞浸潤(rùn)；“++”：背側(cè)皮膚鱗狀上皮明顯增生，角化層明顯增厚，皮下組織可見較多的炎細(xì)胞浸潤(rùn)；“+++”：背側(cè)膚鱗狀上皮顯著增生，角化層顯著增厚，皮下組織可見彌漫性炎細(xì)胞浸潤(rùn)。

病理指標(biāo)可準(zhǔn)確反映體癬炎細(xì)胞對(duì)受損組織各層皮膚的浸潤(rùn)程度以及受損組織各層愈合情況，專屬性強(qiáng)，是直接相關(guān)指標(biāo)，權(quán)重系數(shù)0.3。

4.3 病原學(xué)指標(biāo)：II類指標(biāo)(直接相關(guān)指標(biāo))

體癬病灶皮膚逆培養(yǎng)陽性率是模型成功的重要指標(biāo)，體癬病灶皮膚逆培養(yǎng)陰性率是藥物療效的重要指標(biāo)。其專屬性強(qiáng)，與病理指標(biāo)一樣是直接相關(guān)指標(biāo)，權(quán)重系數(shù)0.3。

4.4 指標(biāo)分類

表2顯示，將以上體癬動(dòng)物模型各類指標(biāo)進(jìn)行分級(jí)，并確定權(quán)重系數(shù)。

表2 體癬動(dòng)物模型各類指標(biāo)權(quán)重系數(shù)

體癬動(dòng)物模型I、II、III指標(biāo)可參照文獻(xiàn)法，均按整體為1進(jìn)行各自的量化積分，同一類的指標(biāo)如表觀指標(biāo)(I)是由紅斑面積、鱗屑情況、皮毛光澤度、皮毛脫落、結(jié)痂等多項(xiàng)指標(biāo)組成，目前是按同一貢獻(xiàn)度計(jì)算；如觀察的表觀指標(biāo)有5項(xiàng)，積分時(shí)各項(xiàng)小指標(biāo)均為0.2，該指標(biāo)最高分值為0.2。如具體每一類指標(biāo)中有特殊重要的指標(biāo)，可參照指標(biāo)分級(jí)時(shí)的權(quán)重，再對(duì)同一類指標(biāo)中的小指標(biāo)進(jìn)行不同的權(quán)重分級(jí)。II、III指標(biāo)的計(jì)算同此。

每一類指標(biāo)造模成功后的總積分，乘以相應(yīng)指標(biāo)的權(quán)重，將三級(jí)指標(biāo)積分相加，即體癬動(dòng)物模型制備成功時(shí)的總積分[13]。按上述方法計(jì)算，刮傷法接種須癬毛癬菌(或石膏毛癬菌，或石膏樣小孢子菌等)制備豚鼠(大鼠體)癬模型總積分約為0.84，穿刺法接種石膏毛癬菌制備豚鼠體癬模型總積分約為0.92。體癬動(dòng)物模型成功率相對(duì)較高，每次造?？赡軙?huì)出現(xiàn)不同的總積分，為保證每次制備體癬模型的基本一致，建議總積分可以有30%左右的偏差，以此作為評(píng)價(jià)體癬動(dòng)物模型成功與否的標(biāo)準(zhǔn)。所得總積分大于0.6，可認(rèn)為該模型制備成功。本草案計(jì)算方法及所得總積分僅供參考，研究者可根據(jù)不同制備模方法所觀測(cè)指標(biāo)另行計(jì)算，適當(dāng)調(diào)整。

4.5 說明

本草案及起草說明中的權(quán)重系數(shù)僅提示該類指標(biāo)在體癬模型制備及判定中的重要性，研究者可根據(jù)具體體癬模型防治實(shí)驗(yàn)，適當(dāng)進(jìn)行調(diào)整。

表觀指標(biāo)、病理指標(biāo)所采用的分類方法，可能因在不同的體癬模型中采用標(biāo)準(zhǔn)不一致，分類也會(huì)有所差異，可能未全面涵蓋體癬相關(guān)的所有指標(biāo)。上述標(biāo)準(zhǔn)及指標(biāo)重點(diǎn)提示，應(yīng)根據(jù)各類指標(biāo)對(duì)體癬模型的貢獻(xiàn)度不同進(jìn)行分類，盡量將單純的定性描述轉(zhuǎn)變成可量化或半量化指標(biāo)，提高判定的可控性；所列的具體分類、指標(biāo)等是供參考的，可根據(jù)具體體癬實(shí)驗(yàn)研究的特點(diǎn)增減或另行設(shè)定。