基于核磁共振技術(shù)的臨床尿毒癥的代謝組學(xué)研究

王振召 魏斌斌 陳 崢 諸宏偉 沈桂平 馮江華*

1(廈門(mén)大學(xué)電子科學(xué)系， 福建省等離子體與磁共振重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 廈門(mén) 361005)2(蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院， 蚌埠 233004)

1 引 言

尿毒癥是多數(shù)慢性腎臟疾病發(fā)展到終末期階段所表現(xiàn)出的臨床綜合征，它的發(fā)生會(huì)引起代謝性酸中毒以及多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的代謝紊亂，同時(shí)造成多數(shù)器官及系統(tǒng)病變，包括皮膚損害、心血管病變、胃腸道受損和腦出血等[1～3]，并常伴有多種并發(fā)癥狀。

近年來(lái)，尿毒癥的發(fā)病逐漸從中老年人群轉(zhuǎn)移到青壯年[4]，由于早期癥狀不明顯，患者常不重視，進(jìn)入到尿毒癥期卻未發(fā)現(xiàn)，錯(cuò)過(guò)了最佳治療時(shí)期，甚至一些已經(jīng)確診的尿毒癥患者會(huì)因?yàn)閾?dān)心透析治療的副作用而拒絕接受合理的治療。因此，對(duì)尿毒癥的診斷與檢查顯得尤為重要。在慢性腎臟病的早期，臨床上常表現(xiàn)為原發(fā)癥狀，對(duì)于尿毒癥的傳統(tǒng)檢查手段主要包括血常規(guī)檢查、尿常規(guī)檢查、腎功能檢測(cè)、血生化分析以及一些影像學(xué)檢查[5～8]。目前，關(guān)于尿毒癥的研究多集中在尿毒癥造成的多種并發(fā)癥及對(duì)部分代謝物的影響，如Madsen等[9]研究了尿毒癥通過(guò)調(diào)節(jié)體內(nèi)主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的表型來(lái)加速動(dòng)脈粥樣硬化；Mclntire等[10]考慮到尿毒癥患者食品利用率降低，研究了必需氨基酸亮氨酸在尿毒癥的營(yíng)養(yǎng)治療中的合成代謝效應(yīng)；Chen等[11]研究發(fā)現(xiàn)，尿毒癥能使生長(zhǎng)激素刺激的胰島素樣生長(zhǎng)因子-1表達(dá)減弱；Kumar等[12]研究了甲狀旁腺激素在終末期腎臟病中的代謝情況；王中華等[13]研究了多種代謝物在大鼠腎臟中的分布。同時(shí)，也有大量的文獻(xiàn)描述了胃腸道在腎臟損傷中的影響[14,15]。然而，目前尚缺少對(duì)尿毒癥總體的代謝機(jī)制變化的研究，對(duì)其具體的代謝特征描述不清楚，使其相應(yīng)的診斷和有效治療相對(duì)滯后。尿液作為腎臟的排泄物，包含眾多小分子代謝物的信息，能夠較為直觀地反映腎臟代謝環(huán)境的變化。尿毒癥是與腎損傷有關(guān)的疾病，體內(nèi)的代謝變化多由腎損傷引起，所以通過(guò)分析尿樣了解尿毒癥具有明顯的優(yōu)勢(shì)。尿樣容易獲得，且其中蛋白質(zhì)和脂質(zhì)含量低，可以體現(xiàn)核磁共振的檢測(cè)特點(diǎn)，已成為基于核磁共振的代謝組學(xué)研究特別是腎臟疾病代謝組學(xué)研究中主要的生物樣品[16]。本研究應(yīng)用基于核磁共振技術(shù)的尿樣代謝組學(xué)的方法，以期獲取可用于表征尿毒癥的定性和定量指標(biāo)，闡明尿毒癥體內(nèi)代謝機(jī)制和機(jī)體的生理變化，進(jìn)而輔助臨床上尿毒癥的確認(rèn)診斷和對(duì)癥治療。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

邁瑞B(yǎng)S-350E全自動(dòng)生化分析儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)；AVANCE III 600MHz核磁共振譜儀(德國(guó)Bruker公司)；低溫高速離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)。

含0.5%的三甲基硅基丙酸鈉 (TSP)的重水(Sigma-Aldrich公司)；K2HPO4、NaH2PO4(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1樣品的采集與配制關(guān)于臨床尿毒癥的代謝組學(xué)研究采用對(duì)照的設(shè)計(jì)原則，建立尿毒癥實(shí)驗(yàn)組及正常對(duì)照組。尿毒癥患者臨床癥狀復(fù)雜，常表現(xiàn)出厭食、嘔吐、腹瀉、口腔潰爛、呼氣有尿味、少尿、面色蒼白灰暗、消瘦、浮腫、全身瘙癢，并伴有頭痛、神志恍惚、乏力、失眠等一系列寒熱、虛實(shí)錯(cuò)雜之象[17]。本研究的尿毒癥患者及健康對(duì)照組尿樣均來(lái)自安徽省蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腎病科，其中包括29例臨床尿毒癥患者的尿樣及39例正常健康志愿者的尿液樣本，所有尿樣均在同一時(shí)間段采集，并記錄性別、年齡等信息。在采集樣本前均告知入試者本研究的內(nèi)容，所有參與研究的患者和健康志愿者均簽署知情同意書(shū)。尿樣采集后，加入0.1% NaN3，同時(shí)進(jìn)行液氮速凍后,——80℃保存。

進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，將所采集到的尿液樣品平均分為兩份，分別用于生化分析和代謝組學(xué)分析。

尿生化指標(biāo)檢測(cè)采用邁瑞B(yǎng)S-350E全自動(dòng)生化分析儀，對(duì)比較重要的臨床尿生化指標(biāo)，包括尿素、尿酸、葡萄糖和肌酐，利用隨機(jī)軟件獲取相應(yīng)的分析結(jié)果。對(duì)于代謝組學(xué)分析樣本，取出保存的尿液樣本進(jìn)行室溫解凍，充分融化后搖勻。離心，取500 μL上清液，與50 μL磷酸鹽重水緩沖溶液(1.5 mol/L， pH=7.4，含0.5% TSP)混合，振蕩10 s使混合均勻，于4℃以10000 g離心10 min，取上清液500 μL，移至5 mm核磁管中進(jìn)行核磁共振檢測(cè)。

2.2.2核磁共振氫譜數(shù)據(jù)采集及處理

尿樣的1H-NMR實(shí)驗(yàn)在600MHz核磁共振譜儀上進(jìn)行，1H共振頻率為600.13 MHz。實(shí)驗(yàn)溫度為298 K，采用帶有NOESYPR1D脈沖序列(RD-90°-t1-90°-tm-90°-Acq)進(jìn)行采樣。實(shí)際采樣中，使用5 mm的CPBBO正向觀察寬帶探頭，空掃次數(shù)為8次，弛豫延遲為4.0 s，采樣點(diǎn)數(shù)為32 K，采樣時(shí)間2.66 s， 累加次數(shù)為32次，譜寬為20 ppm。

對(duì)采集到的譜圖利用MestReNova (Version 9.0.1, Mestrelab Research S.L., Spain)軟件將原始FIDs信號(hào)充零到128 K，同時(shí)乘以線寬為1.0 Hz的指數(shù)窗函數(shù)。傅里葉變換后，將時(shí)域信號(hào)譜圖進(jìn)行人工的相位校正和基線調(diào)整，并以TSP在0 ppm處的單峰進(jìn)行定標(biāo)。切除化學(xué)位移6.20～5.45 ppm及5.20～4.45 ppm范圍內(nèi)的譜圖, 消除尿素峰及殘留水峰對(duì)譜圖的影響，同時(shí)保留4.67 ppm處β-葡萄糖雙峰以討論β-葡萄糖的變化情況，對(duì)每個(gè)譜圖以0.005 ppm為積分間距進(jìn)行等間距分段積分，積分范圍為9.50～0.60 ppm，對(duì)積分?jǐn)?shù)據(jù)相對(duì)于譜圖的總積分面積進(jìn)行歸一化。

2.2.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析及通路分析使用SIMCA (version14.1, Umetrics AB, Umea Sweden)對(duì)歸一化的數(shù)據(jù)進(jìn)行基于多變量統(tǒng)計(jì)的模式識(shí)別分析。首先進(jìn)行主成分分析(PCA)，采用中心化換算(Ctr)的數(shù)據(jù)標(biāo)度換算方式獲取尿毒癥患者與健康對(duì)照組之間的代謝輪廓和差異。進(jìn)一步進(jìn)行正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)，采用自適換算(UV)的數(shù)據(jù)標(biāo)度換算方式，最大化地凸顯模型內(nèi)部疾病組與對(duì)照組之間的差異。然后，通過(guò)排列實(shí)驗(yàn)隨機(jī)多次(n=200)改變分類變量Y的排列順序得到相應(yīng)不同的隨機(jī)Q2值對(duì)模型的有效性進(jìn)行進(jìn)一步的檢驗(yàn)，同時(shí)獲取代謝物差異特征相關(guān)的相關(guān)系數(shù)值(r)和變量重要性(VIP)值。

同時(shí)，為了更好地進(jìn)行特征代謝物的篩選，對(duì)積分?jǐn)?shù)據(jù)進(jìn)行了單變量統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，從相應(yīng)信號(hào)的積分區(qū)域?qū)Ω鞔x物的相對(duì)濃度進(jìn)行了定量分析。為了避免譜圖中重疊峰造成干擾，選擇了具有最少重疊的特征峰對(duì)有意義的代謝物進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。統(tǒng)計(jì)分析的結(jié)果用差異倍數(shù) (Fold-change) 值和t檢驗(yàn)進(jìn)行評(píng)估，其中t檢驗(yàn)值轉(zhuǎn)化為p值，用來(lái)統(tǒng)計(jì)差異的顯著性，以此獲得有顯著變化的代謝產(chǎn)物。Fold-change值是兩組代謝物濃度的比值，用來(lái)表示具有差異的代謝物的變化情況。

使用Fold-change值和t檢驗(yàn)值，并結(jié)合OPLS-DA中導(dǎo)出的相關(guān)系數(shù)值和VIP值，完成火山圖的繪制，用于總結(jié)和識(shí)別潛在的生物標(biāo)志物。篩選差異代謝物的標(biāo)準(zhǔn)為：相關(guān)系數(shù)的絕對(duì)值(|r|)>0.85、VIP值取前10%及p值(t-test值轉(zhuǎn)換而來(lái))<0.001(即縱坐標(biāo)值>3)，篩選出的差異代謝物可作為潛在的生物標(biāo)志物。

在篩選出潛在的生物標(biāo)志物后，為了更進(jìn)一步了解尿毒癥患者與健康人群之間的代謝組學(xué)差異。利用HMDB(Human Metabolome Database, http://www.hmdb.ca)、KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, http://www.kegg.jp)以及MetaboAnalyst3.0在線分析工具(http://www.metaboanalyst.ca/)等公開(kāi)的網(wǎng)上數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)模型的差異代謝物的代謝信息進(jìn)行分析，探究其中與尿毒癥相關(guān)的代謝通路，最后給出合理的生物化學(xué)解釋。

3 結(jié)果與討論

3.1 尿液的生化分析

首先對(duì)采集到的尿樣進(jìn)行狀態(tài)觀察和生化分析。對(duì)比健康對(duì)照組和尿毒癥患者的尿樣發(fā)現(xiàn)，尿毒癥患者的尿樣呈現(xiàn)出清如水的狀態(tài)，樣品澄清無(wú)沉淀，這可能是由于血液透析造成的結(jié)果，而健康對(duì)照組的尿樣呈現(xiàn)出正常的尿黃色，且其中有少量沉淀。同時(shí)，尿樣生化指標(biāo)分析結(jié)果(表1)表明，尿毒癥患者尿注中尿酸、尿素和肌酐的含量顯著偏低，而尿中葡萄糖的含量明顯偏高，表明尿毒癥患者體內(nèi)腎小管細(xì)胞大量受損，同時(shí)，體內(nèi)葡萄糖的氧化分解通路受阻，大量糖分分解為葡萄糖，卻不能得到充分而有效的利用[18～20]。

表1 尿毒癥患者和健康人群尿液主要臨床生化指標(biāo)

Table 1 Primary urinary biochemical index of uremia patients and health control

3.2 核磁共振譜圖分析

圖1為尿毒癥患者(U)和健康對(duì)照組(C)的尿液樣本的核磁共振氫譜平均積分譜圖(通過(guò)Matlab重新繪制)。根據(jù)文獻(xiàn)[21]、經(jīng)驗(yàn)以及參考公用數(shù)據(jù)庫(kù)的代謝組學(xué)相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)(Human Metabolome Database, http://www.hmdb.ca)，對(duì)譜圖進(jìn)行代謝物的準(zhǔn)確歸屬。本研究從譜圖中歸屬出70種代謝物，相應(yīng)的代謝物的詳細(xì)信息見(jiàn)表2。肉眼可見(jiàn)尿毒癥患者和健康對(duì)照組的特征性核磁共振譜圖，并發(fā)現(xiàn)其中兩組具有明顯的代謝差異，在尿毒癥患者的譜圖中，大多數(shù)代謝物特別是低場(chǎng)區(qū)(9.50～6.20 ppm)明顯偏低，證實(shí)了尿毒癥的代謝擾動(dòng)影響終端尿液的代謝產(chǎn)物，使其表現(xiàn)出極大的變化。從譜圖中可分辨出一些特征性的差異代謝物，如尿毒癥組中具有較高濃度的乙酸、乳酸、葡萄糖和牛磺酸等。

圖1 尿毒癥患者(U)和健康對(duì)照人群(C)尿液的平均1H NMR譜圖(9.50～0.60 ppm)。譜圖中去除了6.20～5.45 ppm處尿素峰及5.20～4.68 ppm和4.64～4.45 ppm兩處水峰及其影響的譜峰區(qū)域，虛線框起來(lái)的區(qū)域分別放大了相應(yīng)的倍數(shù)，使譜峰清晰可辨。圖中各代謝物的編號(hào)及詳細(xì)歸屬信息見(jiàn)表2Fig.1 Mean 1H nuclear magnetic resonance (NMR) spectra (9.50-0.60 ppm) of urine obtained from uremia patients (U) and healthy control subjects (C). The spectral regions in the dashed boxes are respectively vertically expanded compared with the spectral region of 3.00-6.20 ppm for the clarity. The keys for the numbers of assigned metabolites are given in Table 2

表2 人尿液1H NMR譜圖鑒定出的代謝物

Table 2 Identified metabolites from the NMR spectra of human urine

編號(hào)No.代謝物Metabolites化學(xué)位移(峰型)1H chemical shift(ppm)(multiplicity)11-甲基組氨酸 1-Methylhistidine(1-MH)7.04(sa),7.69(s)22-羥基異丁酸2-Hydroxyisobutyrate(HIB)1.36(s)32-氧異戊酸 2-Oxoisovalerate(OIV)1.11(d)43-羥基丁酸3-Hydroxybutyrate(3-HB)1.19(d),2.28(dd),2.40(dd),4.16(m)53-甲氧基-4-羥基扁桃體酸3-Methoxy-4-hydroxymandelate(MHM)6.98(d)6乙酰胺 Acetamide(AD)1.99(s)7乙酸 Acetate(Ace)1.92(s)8乙酰乙酸 Acetoacetate(AA)2.28(s)9丙酮 Acetone(Act)2.24(s)10乙酰膽堿 Acetylcholine(Ach)3.23(s)11腺苷 Adenosine(Ads)8.34(s)12丙氨酸 Alanine(Ala)1.49(d)13尿囊酸 Allantoate(Alt)5.35(m)14尿囊素 Allantoin(All)5.39(s)15氨基馬尿酸Aminohippurate(AH)6.91(d),7.71(d)16新煙堿 Anabasine(Ab)8.53(d)17天冬酰胺 Asparagine(Asn)2.83(m),2.91(m)18苯甲酸 Benzoate(Ben)7.48(t),7.87(d)19甜菜堿 Betaine(Bet)3.90(s)20膽汁酸 Bile acid(BA)0.65(m),0.75(m)21丁酸 Butyrate(Bu)0.91(t),1.56(m),2.19(m)22膽堿 Choline(Cho)3.20(s)23檸檬酸 Citrate(Ci)2.54(d),2.68(d)24肌酸 Creatine(Cr)3.04(s),3.94(s)25肌酐 Creatinine(Cn)3.05(s),4.06(s)26二甲胺 Dimethylamine(DMA)2.72(s)27乙醇 Ethanol(Eth)1.20(t),3.65(q)28乙醇胺 Ethanolamine(EA)3.15(t)29葉酸 Folic acid (FA)8.68(s)30甲酸 Formate(For)8.47(s)31富馬酸 Fumarate(Fum)6.53(s)32谷氨酸 Glutamate(Glu)2.07(m),2.13(m),2.35(m),3.78(m)33谷氨酰胺 Glutamine(Gln)2.46(m)34甘氨酸 Glycine(Gly)3.57(s)35乙醇酸 Glycolate(Gla)3.96(s)36胍基乙酸鹽Guanidoacetate(GA)3.80(s)37馬尿酸 Hippurate(Hip)3.97(d),7.56(t),7.64(t),7.84(d)38組氨酸 Histidine(His)7.12(s),7.93(s)39次黃嘌呤 Hypoxanthine(HX)8.20(s),8.22(s)編號(hào)No.代謝物Metabolites化學(xué)位移(峰型)1H chemical shift(ppm)(multiplicity)40吲哚-3-乳酸Indole-3-lactate(IL)7.18(d),7.21(d),7.75(d)41異丁酸 Isobutyrate(IB)1.07(d)42異亮氨酸 Isoleucine(Ile)0.94(t),1.01(d)43乳酸 Lactate(Lac)1.34(d),4.12(q)44亮氨酸 Leucine(Leu)0.97(t)45賴氨酸 Lysine(Lys)1.46(m),1.74(m),1.89(m),3.03(t)46蘋(píng)果酸 Malate(Mal)4.30(m)47丙二酸 Malonate(M)3.12(s)48間-羥基苯乙酸m-Hydroxyphenylacetate(m-HPA)6.79(m),6.80(m)49甲醇 Methanol(Mol)3.37(s)50蛋氨酸 Methionine(Met)2.14(s),2.16(m),2.66(t)51甲基丙二酸Methylmalonate(MM)1.25(d)52N,N-二甲基甘氨酸N,N-Dimethylglycine(DMG)2.93(s)53N-乙酰丙氨酸N-Acetylalanine(NAA)2.03(s)54煙堿 Nicotinamide(NA)8.28(m),8.72(d)55N-甲基煙酰胺N-Methylnicotinamide(NMN)8.18(m),8.91(d),8.97(d),9.29(s)56泛酸 Pantothenate(Pan)0.84(s),0.94(s)57對(duì)-羥基苯乙酸p-Hydrxoyphenylacetate(p-HPA)6.86(d),7.17(d)58苯乙酰甘氨酸Phenylacetylglycine(PAG)3.68(s),3.75(d),7.29(m),7.36(m),7.43(m)59吡啶甲酸 Picolinate(PA)7.51(d),7.90(d),8.55(m)60丙酮酸 Pyruvate(Py)2.35(s)61肌氨酸 Sarcosine(Sar)2.76(s),3.60(s)62琥珀酸 Succinate(Suc)2.41(s)63琥珀酰亞胺 Succinimide(Sum)2.79(s)64?；撬?Taurine(Tau)3.29(t),3.45(t)65反式烏頭酸t(yī)rans-Aconitate(Aco)6.60(s)66葫蘆巴堿Trigonelline(Tri)4.44(s),8.10(m),8.84(t),9.13(s)67N-氧-三甲胺Trimethylamine N-oxide(TMAO)3.27(s)68纈氨酸 Valine(Val)0.99(d),1.05(d)69α-葡萄糖α-Glucose(α-Glc)3.42(t),3.54,3.71(t), 3.84(m),5.24(d)70β-葡萄糖β-Glucose(β-Glc)3.25, 3.41(t),3.46(m), 3.49(t),3.72(dd), 3.90(dd)注:a 峰型: s, 單峰; d, 雙重峰; t, 三重峰; q, 四重峰; dd, 雙重雙重峰; m, 多重峰a Multiplicity: s, singlet; d, doublet; t, triplet; q, quartet; dd, doublet of doublets; m, multiplet.

為進(jìn)一步獲取其詳細(xì)的定量生物化學(xué)信息，從而對(duì)尿毒癥組和正常對(duì)照組之間的差異進(jìn)行客觀系統(tǒng)的評(píng)估，需要對(duì)譜圖導(dǎo)出的積分?jǐn)?shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)分析。

3.3 統(tǒng)計(jì)結(jié)果分析

由尿毒癥患者和健康對(duì)照人群的主成分分析(PCA)得分圖(圖2A)可見(jiàn)，尿毒癥組和正常對(duì)照組出現(xiàn)了明顯區(qū)別，表明兩者存在顯著的代謝差異，說(shuō)明尿毒癥確實(shí)影響到了機(jī)體的代謝功能。另外，尿毒癥患者團(tuán)聚性較差，可能是由于這些患者來(lái)自于不同發(fā)展期的尿毒癥造成的。進(jìn)一步對(duì)兩組進(jìn)行組間正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)，進(jìn)而獲取兩者之間顯著性的代謝差異。從其模型參數(shù)和排列實(shí)驗(yàn)的結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)尿毒癥組與對(duì)照組具有明顯區(qū)別(圖2B和圖2C)，反映了尿毒癥造成的體內(nèi)的代謝紊亂。

通過(guò)核磁共振譜圖的積分?jǐn)?shù)據(jù)進(jìn)行單變量統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，使用相應(yīng)特征峰信號(hào)的積分區(qū)域?qū)Ω鞔x物的相對(duì)濃度進(jìn)行定量分析，可以獲得尿毒癥患者和健康對(duì)照人群尿樣中代謝物含量的差異倍數(shù) (fold-change) 值和通過(guò)t檢驗(yàn)后轉(zhuǎn)化的p值。并結(jié)合多變量統(tǒng)計(jì)分析中模型的相關(guān)系數(shù)(r)和變量重要性(VIP)值，可以構(gòu)建四維(r值、VIP值、p值和fold-change值)火山圖(圖2D)。進(jìn)而可以系統(tǒng)性地對(duì)代謝物進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以獲得有顯著差異的潛在的特征代謝產(chǎn)物[22]。彩色火山圖表明尿毒癥組與對(duì)照組之間的代謝物變化，其中X軸為log2(Fold-change)，Y軸為——lgp，圓的大小為VIP值(按照取值分為10%、20%和剩余部分3部分，圓越大表示VIP值越靠前)，圓的顏色深淺表示相關(guān)系數(shù)的絕對(duì)值(圓的顏色越溫暖表示相關(guān)系數(shù)的絕對(duì)值越大)。使用三標(biāo)準(zhǔn)可以篩選得到尿毒癥患者的潛在的特征代謝物：相關(guān)系數(shù)的絕對(duì)值(|r|)>0.85、VIP值取前10%及p<0.001(即縱坐標(biāo)值>3)。火山圖中的代謝物用縮寫(xiě)表示，詳細(xì)信息參見(jiàn)表2和表3。

圖2 尿毒癥患者(U)與健康對(duì)照組(C)尿樣的主成分分析得分圖(A)、OPLS-DA得分圖(B)、模型的排列實(shí)驗(yàn)交叉驗(yàn)證圖(C)和相應(yīng)的火山圖(D)Fig.2 Principal component analysis(PCA)(A), orthogonal partial least square-discriminate analysis(OPLS-DA)(B), cross validation by permutation test (C) and corresponding volcano plots (D) based on NMR data of urine obtained from the uremia patients (U) and healthy controls (C)

表3 火山圖中差異代謝物的詳細(xì)信息

Table 3 Summary of metabolites statistical data

從火山圖(圖2D)可見(jiàn)，相較于健康對(duì)照組，尿毒癥患者尿液中的肌氨酸、天冬酰胺、2-羥基異丁酸、丁酸、乙醇胺、肌酐、N,N-二甲基組氨酸、谷氨酸、檸檬酸、3-羥基丁酸、丙酮、乙醇和賴氨酸的含量顯著偏低，而?；撬帷ⅵ?葡萄糖、β-葡萄糖、乳酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的含量顯著偏高。這些代謝物的變化可以作為潛在的變化信息用于表征尿毒癥患者的代謝情況。

3.4 代謝通路分析

整體性的代謝擾動(dòng)需要通過(guò)代謝通路圖來(lái)進(jìn)行描述。借助于KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)可以得到差異代謝物(圖2D和表3)之間的相互關(guān)系，進(jìn)而通過(guò)Visio繪制出相應(yīng)的代謝通路圖。從尿毒癥對(duì)體內(nèi)造成干擾的代謝通路圖(圖3)可見(jiàn)，這些代謝途徑主要涉及到糖代謝、能量代謝、脂質(zhì)代謝和氨基酸代謝中的部分代謝。

在尿毒癥患者尿液內(nèi)，支鏈氨基酸(包括纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸)的含量明顯偏高。支鏈氨基酸通常是重要而有效的營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑。人體內(nèi)的支鏈氨基酸的來(lái)源主要是日常蛋白質(zhì)類食物的攝入及體內(nèi)相關(guān)蛋白的分解，正常人體內(nèi)蛋白質(zhì)與氨基酸的代謝處于動(dòng)態(tài)平衡，體內(nèi)氨基酸的含量維持在穩(wěn)定水平，不會(huì)出現(xiàn)有差異性的變化。支鏈氨基酸相較于其它氨基酸能夠產(chǎn)生更多的能量[23]，釋放大量的ATP，同時(shí)能夠分解成相應(yīng)的輔酶A，參與到三羧酸循環(huán)(TCA循環(huán))中，被進(jìn)一步用作轉(zhuǎn)化為其它氨基酸、促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成與分解、促進(jìn)糖的異生以及合成其它營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等[24]，并且支鏈氨基酸具有調(diào)節(jié)免疫的作用[25,26]。支鏈氨基酸含量偏高，表明其參與的代謝反應(yīng)受阻，三者的含量在體內(nèi)造成了積累。支鏈氨基酸產(chǎn)生能量減少，一定程度上造成了體內(nèi)供能不足，同時(shí)免疫功能受到影響，體內(nèi)合成抗體減少，機(jī)體進(jìn)一步受損。

圖3 尿毒癥對(duì)體內(nèi)造成干擾的代謝通路圖。圖中橢圓形框中彩色的代謝物為出現(xiàn)明顯差異的代謝物。其中，紅色和綠色分別表示該代謝物在尿毒癥患者尿液中含量顯著偏高和偏低。不同的代謝路徑用不同顏色的大方框表示Fig.3 Disturbed metabolic pathways involved in uremia. The higher, lower and no significantly changed levels of the metabolites are represented by red, green and black ellipses. The different metabolic pathways are indicated by the different font colors

支鏈氨基酸能夠轉(zhuǎn)化為天冬酰胺并進(jìn)一步轉(zhuǎn)氨基生成天冬氨酸，天冬氨酸被用作蛋氨酸、蘇氨酸和賴氨酸等的原料[27]，支鏈氨基酸含量的升高造成了天冬酰胺的減少，使得向天冬氨酸的代謝途徑受到影響。

N,N-二甲基甘氨酸(DMG)是氨基酸的衍生物，肌酸又稱N-甲基甘氨酸，兩者均為機(jī)體內(nèi)膽堿向甘氨酸代謝的中間產(chǎn)物，DMG在體內(nèi)多種代謝中作為的甲基供體，肌氨酸在ATP能量代謝中可促進(jìn)ATP的合成[28]，兩者含量的減少表明相關(guān)代謝的紊亂。肌酐作為小分子量毒物，腎臟正常時(shí)幾乎全部隨尿排出，含量不受影響，而尿毒癥患者往往會(huì)在體內(nèi)蓄積造成通過(guò)尿液的排出含量較少。

賴氨酸和谷氨酸含量的減少，可能是受到了TCA循環(huán)的影響。賴氨酸具有保持體內(nèi)正常的滲透壓、增強(qiáng)免疫力的作用[29]，其含量的減少會(huì)導(dǎo)致機(jī)體的進(jìn)一步損傷。

能量代謝受到的影響不僅包括支鏈氨基酸的功能減弱，葡萄糖的糖酵解及TCA循環(huán)也會(huì)影響到能量代謝，尿毒癥患者尿液中α-葡萄糖、β-葡萄糖及乳酸的含量增加，檸檬酸含量減少。檸檬酸是TCA循環(huán)中重要的中間產(chǎn)物，檸檬酸含量的減少表明了TCA循環(huán)的異常，造成線粒體功能的紊亂，并進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡和分化。葡萄糖含量的增加表明體內(nèi)大量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被分解，同時(shí)乳酸含量升高表明被分解的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)有氧呼吸參與較少，大都參與到了無(wú)氧糖酵解中分解成乳酸并產(chǎn)生少量的ATP。由于尿毒癥導(dǎo)致體內(nèi)有氧代謝及其它產(chǎn)能方式受阻，糖酵解成為了患者獲取能量的主要來(lái)源，而糖酵解產(chǎn)生能量較少，需要更多的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)分解成葡萄糖，造成了葡萄糖及乳酸含量的升高。

?；撬崾且环N含硫氨基酸，游離于細(xì)胞液和體液中，具有清除自由基、調(diào)節(jié)滲透壓、維持體液平衡等作用[30]。腎臟會(huì)根據(jù)體內(nèi)?；撬岬暮空{(diào)節(jié)它的排泄[31]，尿毒癥患者的腎臟受損，導(dǎo)致尿液中?；撬岬暮可?。而丙酮和乙醇在體內(nèi)蓄積使得尿液中兩者的含量減少。

丁酸是短鏈脂肪酸的一種，主要來(lái)源于腸道內(nèi)微生物對(duì)未吸收的碳水化合物以及蛋白質(zhì)發(fā)酵的產(chǎn)物中，在人類體內(nèi)能夠促進(jìn)壞死的組織快速恢復(fù)[32]，其含量的減少可能導(dǎo)致組織壞死的進(jìn)一步惡化。3-羥基丁酸主要是人體內(nèi)脂肪酸代謝的產(chǎn)物之一，同時(shí)與體內(nèi)能量代謝紊亂有關(guān)[33]。乙醇胺參與體內(nèi)磷脂代謝，并與ATP反應(yīng)生成ADP和磷酸乙醇胺[34]。3-羥基丁酸和乙醇胺的減少表明了脂質(zhì)代謝和能量代謝的紊亂。

結(jié)合尿毒癥患者和健康對(duì)照組尿液的分析，可以發(fā)現(xiàn)二者存在顯著的差異代謝物，主要集中在支鏈氨基酸的代謝、葡萄糖的能量代謝、三羧酸循環(huán)代謝和脂代謝，而其代謝狀況表明尿毒癥造成了體內(nèi)嚴(yán)重的代謝紊亂。

4 結(jié) 論

尿毒癥會(huì)引起體內(nèi)多種代謝紊亂。本研究應(yīng)用基于1H-NMR的尿樣代謝組學(xué)方法，通過(guò)對(duì)尿毒癥患者與正常健康組尿樣的對(duì)比分析，分析了尿毒癥引起的代謝紊亂情況，明確了一些潛在的特征代謝物的發(fā)生發(fā)展特征，并用于初步闡述尿毒癥的生化機(jī)制和病理特征。后續(xù)的研究中，會(huì)結(jié)合尿毒癥早期及通過(guò)手術(shù)手段治療后恢復(fù)的情況進(jìn)行研究，為尿毒癥的診斷和治療提供更好的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。