基于離子通道的電化學(xué)傳感技術(shù)研究進展

姜曉晶 梁榮寧 秦 偉

1(中國科學(xué)院海岸帶環(huán)境過程與生態(tài)修復(fù)重點實驗室和山東省海岸帶環(huán)境過程重點實驗室，中國科學(xué)院煙臺海岸帶研究所， 煙臺 264003)2(中國科學(xué)院大學(xué)， 北京 10049)

1 引 言

生物體的新陳代謝需要不斷與外界環(huán)境進行物質(zhì)交換和能量傳遞，這些過程必須借助離子通道(Ion channel)完成。天然離子通道是細胞膜上一類特殊的親水性蛋白質(zhì)微孔道，選擇性地使特定離子進出細胞。離子通道最典型的特點是具有選擇性和門控制性。選擇性是指通道具有選擇性通透作用，在通道開放時只允許特定離子順電化學(xué)差流動；門控制性是指通道的開放和關(guān)閉，此特性使得通道能夠靈敏地感受外界刺激并調(diào)節(jié)自身的開放和關(guān)閉。常見離子通道主要包括兩大類：天然生物離子通道和人工合成離子通道。其中，天然生物離子通道主要由生物膜、跨膜蛋白和通道構(gòu)成，此類型常用的通道主要有葡萄球菌α-溶血素(α-HL)、氣單胞菌溶素(Aerolysin)、分歧桿菌屬孔道蛋白A(MspA)以及大腸桿菌的外膜蛋白G(OmpG)等。人工合成離子通道是受生物離子通道啟發(fā)而人工制備的離子通道，該類型的離子通道通常采用一定的基底材料(如聚合物[1]、硅基材料[2,3]、玻璃[4]、氧化鋁[5]、石墨烯[6,7]和MoS2[8]等)，利用離子束刻蝕[9]、電子束刻蝕[10]等方法進行制備。兩種類型離子通道各有優(yōu)缺點：天然生物離子通道信號分辨能力強，但穩(wěn)定性差且不適合大規(guī)模生產(chǎn)；人工離子通道尺寸可控、易于陣列化且重現(xiàn)性好，但其制備成本高[11]， 信號噪音較大[12]。

2 離子通道基電化學(xué)傳感技術(shù)

基于離子通道的電化學(xué)傳感技術(shù)的工作原理是利用離子通道作為識別元件，待測物流經(jīng)離子通道時產(chǎn)生感應(yīng)信號，隨后被換能器接收，轉(zhuǎn)化為可測量的電化學(xué)信號(如電流、阻抗、電位)，然后經(jīng)過放大、儲存，最后通過電化學(xué)儀器顯示記錄下來。根據(jù)電化學(xué)信號的不同，可大致分為電流型、阻抗型以及電位型離子通道檢測技術(shù)。

圖1 離子通道傳感技術(shù)應(yīng)用對象示意圖Fig.1 Application objects of ion-channel sensing

2.1 電流型離子通道傳感技術(shù)

圖2為典型電流型離子通道傳感的檢測示意圖及響應(yīng)圖，其中離子通道連接兩個充滿電解質(zhì)溶液的隔室，通過施加電壓從而產(chǎn)生通過通道的離子電流，以電流表檢測的電流變化為響應(yīng)信號。其檢測原理是當(dāng)通道一側(cè)加入待測分析物時，在外加電場的驅(qū)動下分析物會穿過離子通道進入通道另一側(cè)。當(dāng)分析物與離子通道尺寸相當(dāng)時，通道會出現(xiàn)瞬時阻塞，產(chǎn)生下降的電流脈沖，電流脈沖變化的幅度、持續(xù)時間和頻率取決于分析物的特征(如待測物大小及形狀，電荷以及分析物和孔之間的相互作用等)[31～33]。目前，此技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于環(huán)境監(jiān)測[34]、癌癥分析[35]、物質(zhì)分離[36,37]等領(lǐng)域，該技術(shù)具有檢測速度快、換能方式簡單等優(yōu)點，但常規(guī)的電流型離子通道傳感技術(shù)存在選擇性低、靈敏度差等缺點。

圖2 (A)基于電流法的離子通道傳感檢測DNA示意圖以及(B)典型電流響應(yīng)[14]Fig.2 (A) Schematic diagram and (B) typical response curve for current-based ion-channel sensing of DNA[14]

1996年，Kasianowicz等[38]首次報道了基于天然生物離子通道α-HL的電流型核酸檢測技術(shù)，此工作開創(chuàng)了基于離子通道電化學(xué)檢測DNA的新領(lǐng)域。該研究采用電泳法驅(qū)動單鏈DNA(ssDNA)和RNA分子通過α-HL通道，當(dāng)生物分子位置發(fā)生變化時，瞬時電流發(fā)生改變，他們發(fā)現(xiàn)電流頻率與分析物濃度相關(guān)且持續(xù)時間與分子的長度成一定比例關(guān)系。近年來，龍億濤研究組在生物離子通道基電流型檢測技術(shù)方面做了大量研究工作，他們利用氣單胞菌溶素Aerolysin作為離子通道，實現(xiàn)了對未經(jīng)修飾的寡聚核苷酸分子[39]的直接電化學(xué)檢測。然而，需要指出的是，上述檢測方法對靶向目標物質(zhì)的選擇性不足，體積相似的非目標分子也可以進入離子通道，產(chǎn)生干擾目標信號的離子電流特征，從而降低檢測的準確度。

針對此問題，人們通過在離子通道或分析物上修飾輔助物質(zhì)進一步提高檢測的選擇性。在天然生物離子通道修飾研究方面，F(xiàn)ahie等[40]報道了生物素配體修飾的生物離子通道OmpG用于高選擇性檢測生物素結(jié)合蛋白，該通道可區(qū)分復(fù)雜混合物中生物素結(jié)合蛋白的幾種結(jié)構(gòu)同源物[41]。對于人工固態(tài)離子通道而言，一般通過共價修飾的方式改進通道識別選擇性。Jiang的研究組[42]對聚合物人工離子通道進行了選擇性修飾，他們在納米離子通道孔道中修飾G-四聯(lián)體DNA，當(dāng)K+存在時，它會與G-四聯(lián)體DNA發(fā)生作用并使得DNA構(gòu)型發(fā)生變化，進一步導(dǎo)致跨膜電流降低，從而實現(xiàn)K+的檢測?；陬愃圃?，他們將鋅指蛋白修飾到聚合物人工納米離子通道中，構(gòu)筑了鋅的高選擇性仿生離子通道[43]，此外他們也將一定長度的單鏈DNA修飾到聚合物納米離子通道中，用于高選擇性地檢測Hg2+[44]。Gao等[45]對玻璃基人工離子通道進行選擇性修飾，他們將大環(huán)二氧四胺衍生物共價修飾到通道內(nèi)表面，實現(xiàn)了對汞離子的高選擇性檢測。White研究組[46]在玻璃基人工離子通道內(nèi)表面修飾胺基，通過變化溶液pH值，使離子通道表面胺基質(zhì)子化或去質(zhì)子化，從而構(gòu)建出pH門控效應(yīng)的電化學(xué)傳感器。此外，通過在目標分析物上修飾特定功能性物質(zhì)，也可以提高離子通道對待測物的選擇性。例如在核酸上結(jié)合一種聚陽離子納米載體[47]，聚陽離子載體可以在目標核酸上施加一定的偶極矩，通過電泳力將納米載體-靶DNA復(fù)合物驅(qū)動到離子通道中，而不具有結(jié)合載體的非目標分子被排斥在通道外， 不產(chǎn)生任何干擾信號，從而提高離子通道檢測的選擇性。

在傳統(tǒng)的電流型離子通道分析技術(shù)中，分析物穿過離子通道的時間通常較短(～1 ms)，這導(dǎo)致此類型傳感方法的靈敏度一般較低。解決此問題的關(guān)鍵在于減慢分析物的運動速度，并延長它們在離子通道孔內(nèi)的停留時間，從而獲得時間可分辨的信號，并最終實現(xiàn)檢測靈敏度的提高。Meller的研究組等[48]在減慢蛋白質(zhì)通過離子通道速度方面做了大量研究工作。他們利用激光誘導(dǎo)產(chǎn)生出與分析物電泳運動方向相反的電滲流，從而減慢分析物通過離子通道的速度，使得小分子蛋白能夠被檢測。同時，他們也發(fā)現(xiàn)，通過將電解質(zhì)pH微調(diào)至分析物蛋白的等電點(pI)，也可以減慢分析蛋白的速度[49]。Plesa等[25]在監(jiān)測及減慢DNA通過通道速度方面開展了諸多研究工作。他們通過監(jiān)測標記的DNA通過離子通道過程中的位置變化，從而確定DNA通過離子通道的速度。他們報道了使用谷氨酸溶液來減慢DNA速度的方法[50]，與常規(guī)使用的KCl溶液相比，谷氨酸鹽溶液具有較低的電導(dǎo)率和較高的粘度。粘度的增加使得谷氨酸鹽溶液對DNA分子具有更大的拖曳力，這使得DNA分子通過離子通道的時間延長，從而進一步顯著提高測量靈敏度。最近的研究中，他們通過使用高濃度LiCl緩沖液代替KCl溶液以降低DNA分子通過離子通道的速度，可以獲得更高的測量帶寬[51]。

2.2 阻抗型離子通道傳感技術(shù)

電化學(xué)阻抗型離子通道檢測體系主要由離子通道和電解質(zhì)(溶液)兩部分組成，使用阻抗分析儀在室溫下進行阻抗譜的測量和記錄。傳統(tǒng)阻抗分析的一般原理是電子在電極/電解質(zhì)界面發(fā)生轉(zhuǎn)移時，由于電子傳導(dǎo)速率與溶液離子傳導(dǎo)速率不同，導(dǎo)致電子轉(zhuǎn)移不同步，產(chǎn)生電子轉(zhuǎn)移電阻。在阻抗基離子通道傳感技術(shù)中，離子通道的功能化修飾會使得電子轉(zhuǎn)移電阻略微降低，而功能化離子通道與分析物的相互作用則會使得電子轉(zhuǎn)移電阻顯著增加，據(jù)此可以實現(xiàn)對分析物濃度、帶電情況和結(jié)構(gòu)特征等多種參數(shù)的檢測。基于阻抗法的離子通道傳感技術(shù)的檢測原理以及典型阻抗響應(yīng)譜如圖3所示。此類型傳感技術(shù)具有換能方式簡單、檢測靈敏度高等優(yōu)點[52～55]。然而，該技術(shù)也存在復(fù)雜電化學(xué)阻抗譜分析與解釋困難、等效電路模型缺乏唯一性等諸多不足。目前，阻抗型離子通道傳感技術(shù)主要用于生物大分子的檢測[56]。

氧化鋁基人工固態(tài)離子通道由于其具有高度有序、易于修飾以及非特異性吸附弱等特點，在阻抗基離子通道傳感技術(shù)中得到廣泛使用。然而未經(jīng)修飾的氧化鋁離子通道難以用于實現(xiàn)高選擇性的阻抗檢測，已報道的文獻多采用功能化修飾的氧化鋁通道作為傳感元件。Wu等[56]利用小分子單鏈DNA(ssDNA)對氧化鋁離子通道進行修飾，實現(xiàn)了雜交DNA的阻抗檢測，同時他們也發(fā)現(xiàn)降低離子通道孔的密度，有利于實現(xiàn)電化學(xué)阻抗譜中離子通道電阻和膜電容的清晰識別。Kant等[57]將大分子鏈霉抗生物素蛋白修飾到多孔道氧化鋁的內(nèi)表面，并研究了氧化鋁離子通道面積和孔數(shù)對化學(xué)和生物傳感的影響。他們發(fā)現(xiàn)，與大離子通道陣列相比，小面積和低孔數(shù)離子通道可以達到更好的生物傳感性能。最近，有研究者將大分子的人類氣味結(jié)合蛋白(hOBP)固定于氧化鋁離子通道表面，實現(xiàn)了醛和脂肪酸的高選擇性、高靈敏度電化學(xué)阻抗檢測[5]。hOBP不僅可與親脂性分子結(jié)合，而且對親水性的醛和脂肪酸也呈現(xiàn)出較高的親和力，當(dāng)hOBP與醛或脂肪酸發(fā)生相互作用后，電荷轉(zhuǎn)移電阻和離子通道電阻的串聯(lián)電阻顯著增加，從而實現(xiàn)對醛和脂肪酸的檢測，該方法對苯甲醛和二十二碳六烯酸的檢出限可分別達到10——9mg/mL和10——12mg/mL量級。

圖3 (A)基于阻抗法的離子通道傳感檢測DNA雜化示意圖以及(B)典型阻抗圖譜[56]Fig.3 (A) Detection diagram and (B) typical impedance spectroscopy for impedance-based ion-channel sensing of DNA hybridization[56]

2.3 電位型離子通道傳感技術(shù)

電位型離子通道傳感技術(shù)，主要是指基于離子選擇性電極的離子通道傳感技術(shù)。離子選擇性電極檢測技術(shù)具有操作簡單、成本低廉以及選擇性高等優(yōu)點，特別適合于現(xiàn)場快速分析。近年來，研究者將此類電極與離子通道相結(jié)合，發(fā)展了諸多離子通道基離子選擇性電極檢測技術(shù)，實現(xiàn)了對無機離子、生物大分子等的高靈敏、高選擇性檢測，可以預(yù)見此類技術(shù)未來有望應(yīng)用于臨床化驗、環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域。與其它電化學(xué)離子通道傳感技術(shù)相比，該技術(shù)具有構(gòu)建方法簡單、選擇性高等優(yōu)點，但是由于離子通道內(nèi)識別反應(yīng)發(fā)生過程中無額外電化學(xué)驅(qū)動力存在，使得采用此技術(shù)所構(gòu)建的傳感器更新較為困難。

目前，已研發(fā)的離子通道基離子選擇性電極檢測技術(shù)主要可分為兩大類，即零電流技術(shù)和電流驅(qū)動技術(shù)。在零電流條件下測定時，一般采用兩電極體系，即將離子通道、離子選擇性電極以及外參比電極之間用導(dǎo)線連接組成一個完整的測量回路，將其置于待測溶液中，離子通道中選擇性識別反應(yīng)可對待測溶液中離子濃度變化產(chǎn)生影響，并進一步對電位信號變化產(chǎn)生影響，通過電位計測量該電位變化，從而實現(xiàn)待測物檢測。在該條件下，離子的擴散過程僅依靠濃度差。電流驅(qū)動條件下的電位檢測技術(shù)是指基于計時電位技術(shù)的電位分析檢測技術(shù)，該技術(shù)是通過控制電極表面施加電流的方向、時間以及電流的大小，能夠有效調(diào)控通過離子通道修飾的聚合物膜離子選擇性電極的離子通量，從而實現(xiàn)待測物快速檢測[58]。電流驅(qū)動條件下的電位檢測體系一般采用三電極體系，由工作電極、參比電極和輔助電極組成。

圖4 (A)基于平衡電位的離子通道傳感檢測小RNA示意圖、(B)測量裝置以及(C)典型電位響應(yīng)[59]Fig.4 (A) Schematic illustration, (B) measurement setup and (C) typical potential response for equilibrium potential-based ion-channel sensing of microRNA[59]

圖5 離子載體修飾的金離子通道[60]Fig.5 Schematic representation of gold-based ion channel modified with ionophore[60]

Gyurcsanyi等將功能化的離子通道與離子選擇性電極相結(jié)合，實現(xiàn)了小RNA (miRNA )的電位檢測[59]，此傳感器的基本原理如圖4所示。該研究利用帶正電的肽-核酸修飾離子通道，帶負電荷的miRNA經(jīng)過離子通道時會由于電荷中和作用使得離子通道不帶電，此過程采用K+作為指示離子指示電荷中和作用過程，K+選擇性電極作為指示電極測定K+濃度變化，從而實現(xiàn)miRNA的檢測。需要指出的是，此過程核酸待測物識別過程與電極檢測過程是分別進行的，而且識別過程僅依賴電荷作用使得檢測缺乏選擇性。為了解決此問題，他們將親脂性的離子載體、離子交換劑等修飾于金離子通道內(nèi)表面，構(gòu)建了集識別和檢測為一體的離子通道基離子選擇性電極(圖5)，離子載體的存在可以保證電極的高選擇性識別，最終實現(xiàn)了Ag+的高選擇性、高靈敏電位檢測[60]。最近，他們又將親水性的多肽修飾于金離子通道內(nèi)，構(gòu)建了高選擇性的Cu2+選擇性離子通道傳感器[61]。

Xu等[62]提出了一種基于計時電位分析法的離子通道傳感用于蛋白質(zhì)的檢測，檢測原理如圖6所示。在該檢測體系中，聚合物膜鈉離子選擇性電極膜表面首先修飾生物素，當(dāng)溶液中加入親和素后，生物素與親和素會發(fā)生鍵合作用，此作用會抑制電流驅(qū)動的Na+從溶液相進入敏感膜相的離子通量，此離子通量的變化可用于定量檢測溶液中的親和素。此外，研究表明，通過降低電極敏感膜的比表面積可以提高檢測靈敏度。鑒于此，他們將固態(tài)氧化鋁離子通道覆蓋于生物素修飾的電極膜表面，有效降低了電極比表面積，進一步提高了電位檢測親和素的靈敏度。

圖6 (A)基于電位法的離子通道傳感檢測抗原抗體相互作用示意圖以及(B)典型電位響應(yīng)[62]Fig.6 (A) Detection diagram and (B) typical potential response for potentiometry-based ion-channel sensing of antigen-antibody interactions[62]

3 結(jié) 語

在過去的十余年中，基于離子通道的電化學(xué)檢測技術(shù)取得了較大的進展。雖然目前離子通道基電化學(xué)傳感器技術(shù)在選擇性、靈敏度以及穩(wěn)定性等方面已取得諸多突破，然而，離子通道技術(shù)仍然面臨著諸多挑戰(zhàn)，如可供選擇的生物離子通道種類十分有限， 以及人工離子通道的穩(wěn)定性和均一性缺乏等，伴隨著DNA工程技術(shù)、納米技術(shù)以及3D打印技術(shù)的發(fā)展，這些問題有望在未來得以解決。此外，離子通道傳感領(lǐng)域面臨的最大問題是只有少數(shù)相關(guān)化學(xué)與生物傳感器已被用于實際樣品分析，而大部分仍然處于概念驗證階段，這就要求研究人員更加深入地研究可應(yīng)用于現(xiàn)場快速檢測的技術(shù)，以更好地將離子通道基化學(xué)和生物傳感器應(yīng)用于實際復(fù)雜樣品的檢測中。