豬葡萄球菌感染BALB/c小鼠血清中細(xì)胞因子表達(dá)的抗體芯片分析

李 艷，王 磊，蔡汝健，蔣智勇，勾紅潮，楚品品，宋 帥，李春玲

（廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物衛(wèi)生研究所/廣東省畜禽疫病防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)部獸用藥物與診斷技術(shù)廣東科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，廣東 廣州 510640）

仔豬滲出性皮炎（exudative epidermit, EE）是由葡萄球菌感染引起的一種急性傳染病，仔豬感染后會(huì)出現(xiàn)全身性皮炎，最終導(dǎo)致脫水和全身衰竭而死亡，死亡率可達(dá)70%［1-2］。該病的發(fā)生給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，丹麥、日本、德國(guó)、俄羅斯等國(guó)家也有該病發(fā)病及病原的研究［3-6］。豬葡萄球菌可分為有毒力型和無(wú)毒力型菌株，其分泌的脫落毒素是主要的毒力因子［7-8］。目前已有5種豬葡萄球菌分泌的表皮脫落毒素被發(fā)現(xiàn)并命名，分別是丹麥學(xué)者鑒定的ExhA、ExhB、ExhC和ExhD，以及日本學(xué)者鑒定的SHETB［9-10］。

已有研究顯示，炎性細(xì)胞因子在疾病的發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用［11］。同時(shí)檢測(cè)多種炎性細(xì)胞因子的表達(dá)水平將有助于深入了解豬葡萄球菌的感染過(guò)程，而且有可能發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵的致病性因子?？贵w芯片技術(shù)是一種檢測(cè)生物樣品中蛋白表達(dá)模式的方法，其憑借高通量、高靈敏度、高特異性和低樣本量等特點(diǎn)，為蛋白質(zhì)表達(dá)的快速、平行分析提供了技術(shù)平臺(tái)［12］。此外，抗體芯片對(duì)疾病相關(guān)生物標(biāo)簽的發(fā)現(xiàn)、藥物靶點(diǎn)的篩選等具有重要作用［13-15］。

本研究通過(guò)抗體芯片技術(shù)檢測(cè)了豬葡萄球菌感染BALB/c小鼠后血清炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，旨在研究炎性細(xì)胞因子在豬葡萄球菌感染過(guò)程中的作用，同時(shí)篩選可能的疾病相關(guān)生物標(biāo)簽。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

菌株CF-1（JQ728492）分離自廣東省暴發(fā)滲出性皮炎的某豬場(chǎng)病豬；AAM-CYT-G2炎癥因子抗體芯片購(gòu)自廣州RayBiotech公司；4周齡BALB/c小鼠購(gòu)自南方醫(yī)科大學(xué)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 血清采集 將4周齡BALB/c小鼠24只隨機(jī)分為2組，每組12只。試驗(yàn)組的每只小鼠經(jīng)肌肉和皮下注射菌液0.2 mL（CF-1含量1.0×108CFU），對(duì)照組的小鼠注射滅菌的PBS液。均在注射后24、48 h采集血液，收集血清，于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 細(xì)菌的分離鑒定 無(wú)菌條件下，采集小鼠的內(nèi)臟，分別接種于血瓊脂平板、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)18 h，次日挑取單個(gè)菌落進(jìn)行染色鏡檢，并進(jìn)行劃線純培養(yǎng)。

1.2.3 血清細(xì)胞因子的檢測(cè) 血清細(xì)胞因子的檢測(cè)采用RayBiotech Mouse Cytokine Antibody Array G Series 5 芯片技術(shù)測(cè)定（含RayBiotech公司原裝試劑盒），AAM-CYT-G2芯片布局見(jiàn)表1。將玻片芯片取出，每張玻片4個(gè)樣本實(shí)驗(yàn)區(qū)，每個(gè)樣本實(shí)驗(yàn)區(qū)的微陣列中固定了32種細(xì)胞因子的抗體及陽(yáng)性和陰性對(duì)照，每個(gè)細(xì)胞因子位點(diǎn)重復(fù)測(cè)定2次。主要操作步驟如下：（1）每個(gè)芯片孔中加入100 μL封閉液，封閉30 min。抽去封閉液，每孔加入100 μL樣品，每個(gè)陣列1個(gè)樣品，孵育過(guò)夜。（2）使用Thermo Scientific Wellwash Versa 芯片洗板機(jī)清洗玻片，每孔加入250 μL洗液Ⅰ，清洗6次；每孔加入250 μL洗液Ⅱ，清洗5次。（3）加入70 μL生物素標(biāo)記抗體，孵育1 h，清洗玻片同步驟（2）。（4）每孔加入70 μL熒光素標(biāo)記的鏈霉抗生物素蛋白，在室溫下避光孵育1～2 h，清洗玻片同步驟（2）。（5）采用GenePix 4000B Microarray Scanner激光掃描儀掃描芯片，用AAM-CYT-G2數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

表1 AAM-CYT-G2芯片膜上細(xì)胞因子位置

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 使用微陣列（SAM）軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析，差異值≥2.0倍表明細(xì)胞因子的表達(dá)上調(diào)顯著，差異值≤0.5倍表明細(xì)胞因子的表達(dá)下調(diào)顯著，細(xì)胞因子的表達(dá)在0.5～2倍之間表明無(wú)顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌的分離鑒定

細(xì)菌在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和綿羊鮮血平板培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，菌落形態(tài)光滑濕潤(rùn)，呈瓷白色；在血平板上不溶血，在麥康凱培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)。通過(guò)顯微鏡觀察到藍(lán)紫色葡萄狀球菌（圖1，封三）。

2.2 不同處理小鼠血清細(xì)胞因子的差異表達(dá)

2.2.1 感染后24 h血清細(xì)胞因子的表達(dá) 感染后24 h試驗(yàn)組與對(duì)照組的小鼠血清細(xì)胞樣本芯片掃描結(jié)果如圖2（封三）所示。芯片掃描結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組中共有5個(gè)血清細(xì)胞因子表達(dá)出現(xiàn)了顯著性變化，其中表達(dá)升高2倍以上的細(xì)胞因子有4個(gè)，包括G-CSF、IL-6、KC和MCP-5，IL-12的表達(dá)低于對(duì)照組一半。由表2可知，試驗(yàn)組血清中G-CSF、IL-6、KC和MCP-5的表達(dá)分別為對(duì)照組的3490.13、9.98、44.25、7.05倍，IL-12的 表 達(dá)量為對(duì)照組的0.49倍。

2.2.2 感染后48 h血清細(xì)胞因子的表達(dá) 感染后48 h試驗(yàn)組與對(duì)照組的小鼠血清細(xì)胞樣本芯片掃描結(jié)果如圖3（封三）所示。芯片掃描結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，血清細(xì)胞因子中共有4個(gè)細(xì)胞因子表達(dá)出現(xiàn)了顯著性變化，其中表達(dá)升高2倍以上的細(xì)胞因子有3個(gè)，包括G-CSF、KC和MCP-5；IL-12的表達(dá)同樣低于對(duì)照組一半。由表2可知，試驗(yàn)組血清中G-CSF、KC和MCP-5的表達(dá)分別為對(duì)照組的1423.58、3.78、3.44倍，IL-12的表達(dá)量?jī)H為對(duì)照組的0.47倍。

2.3 CF-1感染BALB/c小鼠后小鼠血清細(xì)胞因子差異表達(dá)

CF-1感染BALB/c小鼠后24、48 h，血清細(xì)胞因子芯片掃描（圖2、圖3，封三）及差異表達(dá)分析結(jié)果（表2）顯示，感染后24、48 h有3種細(xì)胞因子表達(dá)水平均升高2倍以上，分別為G-CSF、KC和MCP-5；表達(dá)水平均低于對(duì)照一半的細(xì)胞因子為IL-12。

表2 細(xì)胞因子差異表達(dá)變化倍數(shù)

3 結(jié)論與討論

近年來(lái)，蛋白質(zhì)芯片技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)譜分析、新藥研發(fā)、藥物靶標(biāo)識(shí)別、臨床診斷及預(yù)后標(biāo)記篩選?？贵w芯片作為最常用的一種蛋白質(zhì)芯片，具有全面準(zhǔn)確反映疾病發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中蛋白質(zhì)表達(dá)水平等特點(diǎn)，已成為生物樣品中蛋白質(zhì)分子檢測(cè)的重要手段［16］。細(xì)胞因子是炎癥性疾病的重要調(diào)節(jié)因子，是目前發(fā)病機(jī)制研究的熱點(diǎn)之一［17-18］。豬葡萄球菌感染過(guò)程中可能涉及免疫系統(tǒng)的異常激活和抑制以及促炎/抗炎反應(yīng)等，單一細(xì)胞因子檢測(cè)不能為疾病的進(jìn)展情況提供可靠信息，系統(tǒng)細(xì)胞因子檢測(cè)如細(xì)胞因子抗體微陣列技術(shù)能提供全面的細(xì)胞因子表達(dá)數(shù)據(jù)。細(xì)胞因子抗體芯片研究現(xiàn)已應(yīng)用于糖尿病、腫瘤、心血管疾病、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病研究［19-20］，因此我們使用細(xì)胞因子抗體芯片技術(shù)檢測(cè)感染豬葡萄球菌CF-1株BALB/c小鼠血清中細(xì)胞因子的表達(dá)，了解豬葡萄球菌感染過(guò)程中炎性細(xì)胞因子表達(dá)的相關(guān)性。在本研究中，使用小鼠細(xì)胞因子抗體微陣列技術(shù)同時(shí)檢測(cè)32種細(xì)胞因子，并篩選了5種具有顯著差異的細(xì)胞因子，其中4個(gè)細(xì)胞因子（G-CSF、IL-6、KC、MCP-5）在豬葡萄球菌感染小鼠血清中上調(diào)表達(dá)，IL-12在豬葡萄球菌感染的小鼠的血清中下調(diào)表達(dá)。在前期研究報(bào)道中，我們采用細(xì)胞因子抗體芯片技術(shù)檢測(cè)了豬葡萄球菌ZC-4株感染BALB/c小鼠血清中細(xì)胞因子的表達(dá)［21］，發(fā)現(xiàn)了4種具有顯著差異的細(xì)胞因子，其中G-CSF、IL-6及KC上調(diào)表達(dá)，下調(diào)表達(dá)的是IL-12。綜合豬葡萄球菌ZC-4株和CF-1株感染小鼠血清細(xì)胞因子差異表達(dá)結(jié)果，篩選豬葡萄球菌感染小鼠血清差異表達(dá)細(xì)胞因子，其中表達(dá)上調(diào)的細(xì)胞因子為G-CSF、IL-6及KC，下調(diào)表達(dá)的是IL-12。提示這些細(xì)胞因子有可能作為豬葡萄球菌感染血清的蛋白分子標(biāo)記物。

IL-6主要由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，在免疫系統(tǒng)功能調(diào)節(jié)、炎癥感染反應(yīng)、骨髓組織造血功能調(diào)控等方面具有多效性。IL-6是一種非常重要的炎癥因子，參與炎癥和免疫反應(yīng)，在慢性炎癥和自身免疫性疾病中發(fā)揮病理作用［22］。本研究中促炎因子IL-6在感染早期表達(dá)顯著升高，暗示在豬葡萄球菌感染早期的炎癥過(guò)程中發(fā)揮了主要作用。粒細(xì)胞集落刺激因子（granulocyte colony-stimulating factor, G-CSF）是一種多肽鏈的細(xì)胞生長(zhǎng)因子。近年來(lái)，已發(fā)現(xiàn)G-CSF不僅特異性地調(diào)節(jié)粒細(xì)胞的增值和分化，而且還增強(qiáng)了成熟粒細(xì)胞的功能，同時(shí)具有免疫調(diào)節(jié)、血管保護(hù)、抗動(dòng)脈粥樣硬化和保護(hù)神經(jīng)作用［23］。G-CSF通過(guò)調(diào)節(jié)多種免疫細(xì)胞來(lái)影響機(jī)體的免疫反應(yīng)［24］。KC也稱為CXCL1，屬于CXC趨化因子家族，CXC趨化因子參與細(xì)胞內(nèi)外多種生命活動(dòng)，如炎性反應(yīng)、損傷修復(fù)等［25］，腫瘤組織中CXCL1的高表達(dá)與疾病的不良預(yù)后相關(guān)［24-26］。本研究中，G-CSF和KC的表達(dá)也顯著升高，其在豬葡萄球菌感染中的作用需要進(jìn)一步研究。

本研究采用細(xì)胞因子抗體芯片技術(shù)獲得了一組非常有意義的數(shù)據(jù)，初步篩選了豬葡萄球菌感染小鼠后的血清蛋白標(biāo)記物。同時(shí)，在篩選過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，還有一些細(xì)胞因子可能在豬葡萄球菌的感染過(guò)程中起作用，為了解豬葡萄球菌感染的分子機(jī)制提供參考。

圖1 分離菌革蘭氏染色鏡檢結(jié)果（×100）

圖2 感染后24 h 血清AAM-CYT-G2細(xì)胞因子抗體芯片檢測(cè)結(jié)果

圖3 感染后48 h 血清AAM-CYT-G2細(xì)胞因子抗體芯片檢測(cè)結(jié)果