廣州地區(qū)福祿桐葉斑病病原鑒定

傅 昱，許俊寬，游春平

（仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，廣東 廣州 510225）

福祿桐（Polyscias guifoylei）又名南洋參，原產(chǎn)于太平洋諸島，是五加科南洋參屬（Polyscias）常綠灌木或小喬木。福祿桐株型柔美，枝繁葉茂，葉片與莖干獨(dú)特優(yōu)美，葉形多變，葉色也各具不同，生長(zhǎng)速度快，耐整形修剪，耐旱耐陰，是近幾年較為流行的高檔室內(nèi)盆栽觀葉植物［1］。近年來(lái)福祿桐在我國(guó)福建、臺(tái)灣及兩廣地區(qū)被廣泛引種與栽培，目前在我國(guó)內(nèi)地栽培的福祿桐有9種：羽葉福祿桐、南洋森、線葉南洋森、銀邊圓葉福祿桐、芹葉福祿桐、銀邊福祿桐、圓葉福祿桐、黃斑圓葉福祿桐和紅葉圓葉福祿桐［2］。

隨著福祿桐在內(nèi)地市場(chǎng)的不斷推廣，其種植量也隨之增加，在種植過(guò)程中一些病蟲害也相繼發(fā)生。2011年，Nelson等報(bào)道了美國(guó)夏威夷發(fā)生的福祿桐葉枯病，其癥狀特點(diǎn)是：葉片發(fā)病部位初期呈現(xiàn)不規(guī)則的半透明水漬狀病斑并常有琥珀色的分泌液，病斑后期中部呈棕色，邊緣為黑色，病健交界清晰；病斑沿葉脈發(fā)生，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致葉片卷曲變黃后脫落［3］。2014年，廣州市園藝苗圃場(chǎng)發(fā)現(xiàn)有癥狀類似的福祿桐葉斑病發(fā)生，發(fā)病率為10%～20%，嚴(yán)重時(shí)達(dá)30%～50%，廣州園藝苗圃場(chǎng)作為廣州市園藝植物盆栽的重要來(lái)源，福祿桐葉斑病的發(fā)生嚴(yán)重影響了該苗圃福祿桐植株的觀賞性和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。引起廣州地區(qū)福祿桐葉斑病的病原與Nelson等報(bào)道的是否一致還不清楚。本研究通過(guò)對(duì)病原菌的形態(tài)特征、16S rRNA基因序列以及生理生化性狀的分析，確定病原菌種類，為今后福祿桐葉斑病的防治以及病原菌的致病機(jī)理研究打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

植物材料：2015年6月于廣州市園藝苗圃場(chǎng)采集具有典型癥狀的福祿桐葉斑病植株10株，用于病原菌的分離純化和病害樣本的保存，健康供試植株由廣州市園藝苗圃場(chǎng)提供。

培養(yǎng)基：NA培養(yǎng)基、NB培養(yǎng)基和碳源利用培養(yǎng)基參照文獻(xiàn)［4-6］配方配制。

試劑：Hucker草酸銨結(jié)晶紫溶液、Lugol染液、脫色劑、負(fù)染溶液、陽(yáng)性緩沖液及Lugol’s I液等參照文獻(xiàn)［6］配方配制。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病原菌的分離純化及致病性測(cè)定 使用平板劃線分離法［7］對(duì)采集的福祿桐病葉進(jìn)行病原菌的分離，將劃線后的平板置于28℃培養(yǎng)箱黑暗培養(yǎng)48 h后，對(duì)平板上的單菌落進(jìn)行3～5次純化，直到得到一致的單菌落。致病性測(cè)定采用針刺法［7］進(jìn)行接種：用滅菌的醫(yī)用脫脂棉蘸取菌液覆蓋在健康福祿桐植株葉片針刺部位，對(duì)照接種無(wú)菌水，每個(gè)處理5次重復(fù)，于28℃光照條件下培養(yǎng)，48 h后將覆蓋葉片的菌液（或無(wú)菌水）去除，對(duì)葉片進(jìn)行保濕培養(yǎng)，每天觀察記錄發(fā)病情況。葉片發(fā)病后，對(duì)發(fā)病葉組織再次進(jìn)行病原菌的分離純化，比較接種后分離菌株與原接種菌株的形態(tài)異同。

1.2.2 病原菌的分子鑒定 將分離到的菌株轉(zhuǎn)接到NB培養(yǎng)液中，28℃、180 r/min震蕩培養(yǎng)48 h，利用東盛生物科技有限公司的細(xì)菌基因組DNA快速提取試劑盒提取菌株總DNA。

PCR反應(yīng)針對(duì)細(xì)菌的16S rRNA基因，擴(kuò)增所用引物為 27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和1492R（5’-CGGCTACCTTGTTACGAC-3’）［8］。PCR反應(yīng)體系為25 μL：12.5 μL 的2×Taq PCR Green Mix、5 μL的DNA模板、1 μL的引物27F（5 μmol/L）、1 μL的引物1492R（5 μmol/L）、5.5 μL的ddH2O。擴(kuò)增反應(yīng)程序：94℃預(yù)熱3 min；94℃變性30 s、55℃退火1 min、72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃再延伸7 min；4℃保存。

擴(kuò)增結(jié)束后將PCR產(chǎn)物送至上海英濰捷基貿(mào)易有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果利用NCBI進(jìn)行序列對(duì)比，并運(yùn)用MEGA6.0中的NJ（Neighbor-Joining）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，自展支持率分析采用1 000次重復(fù)。

1.2.3 病原菌生理生化鑒定 參照文獻(xiàn)［9］進(jìn)行生理生化性狀測(cè)定。配制碳源利用培養(yǎng)基，分裝試管并滅菌，待培養(yǎng)基冷卻到室溫時(shí)加入經(jīng)過(guò)濾滅菌的被測(cè)底物（糖醇類底物終濃度為0.5%～1%，其他底物濃度為0.1%～0.2%），再加入100 μL在NB培養(yǎng)液中培養(yǎng)18～24 h的細(xì)菌懸浮液。每種碳源試驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù)，對(duì)照不加碳源，于28℃搖床培養(yǎng)48 h。連續(xù)接種3代，每一代從上一代的懸浮液吸取100 μL的菌液接種，于相同的條件培養(yǎng)，能生長(zhǎng)者表示能利用該碳源。

2 結(jié)果與分析

2.1 福祿桐葉斑病癥狀特點(diǎn)及分離菌株的致病性測(cè)定

福祿桐葉斑病發(fā)病初期，病葉出現(xiàn)透明的水浸狀小點(diǎn)，然后逐漸擴(kuò)大成橢圓形或近圓形，中央褐色，邊緣油漬狀；病斑后期中部呈紅褐色斑點(diǎn)，中部斑點(diǎn)周圍呈黃褐色至黑褐色，病斑邊緣有淡黃色暈圈，病斑直徑約為4～6 mm，病健交界清晰。有些病斑發(fā)生在葉片邊緣或葉片頂部，呈半月形或不規(guī)則病斑，隨著病情加重，病斑繼續(xù)擴(kuò)大，葉片卷曲而掉落（圖1，封三）。

通過(guò)劃線分離法，從發(fā)病組織中分離出6個(gè)細(xì)菌菌株：FLT1-6，用針刺法將6個(gè)菌株分別回接到健康葉片中，保濕培養(yǎng)48 h后，只有分離物FLT4接種葉片出現(xiàn)水漬狀透明病斑，與田間發(fā)病初期癥狀一致，分離物FLT1-3、FLT5-6和無(wú)菌水接種的葉片均不產(chǎn)生病斑（圖2，封三）。從接種部位再次分離獲得的分離物形態(tài)特征和分子特征與原接種體FLT4一致。

圖1 福祿桐葉斑病田間發(fā)病癥狀

圖2 分離物回接后福祿桐葉片發(fā)病癥狀

圖3 葉斑病病原菌FLT菌落形態(tài)和革蘭氏反應(yīng)特征

2.2 病原菌株的形態(tài)特征

FLT4在NB平板上于28℃培養(yǎng)2 d后，菌落呈黃色并明顯向上凸起，圓形，邊緣光滑，表面濕潤(rùn)，易于挑取，不與培養(yǎng)基粘合，產(chǎn)生臭味，培養(yǎng)基無(wú)明顯顏色變化，革蘭氏陰性菌，單個(gè)菌體為桿狀，菌體大小為1.4～5 μm×0.5～0.6 μm（圖3，封三）。

2.3 病原菌的分子鑒定

利用細(xì)菌通用引物27F/1492R對(duì)病原菌株FLT4的16S rRNA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到片段大小為1 415 bp的擴(kuò)增產(chǎn)物。將擴(kuò)增產(chǎn)物序列（GenBank 收錄號(hào)：KY982974）在GenBank中進(jìn)行BLAST比對(duì)，并用MEGA6.0按照NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果（圖4）顯示，病原菌株FLT4 與X.campestrispv.vesicatoria（GenBank 收錄號(hào)：AM039952.1）、X.axonopodispv.citrumeloF1（GenBank 收錄號(hào)：CP002914.1）、X.citripv.strain jx-6（GenBank 收錄號(hào)：CP011827.1）、X.citrisubsp.citristrain UI7（GenBank 收錄號(hào)：CP008989.1） 和X.citrisubsp.citristrain NT17（GenBank 收錄號(hào)：CP008995.1）在同一分支上。

圖4 病原菌株FLT4及相關(guān)菌株基于16S rRNA序列的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

根據(jù)伯杰氏系統(tǒng)鑒定手冊(cè)（第2版）［8］，柑橘黃單胞菌（X.citri）作為一個(gè)變種并入地毯草黃單胞菌（X.axonopodis），野油菜黃單胞菌辣椒斑點(diǎn)病致病變種（X.campestrispv.vesicatoria）也歸入到地毯草黃單胞菌（X.axonopodis），既X.campestrispv.vesicatoria和X.citri均為X.axonipodis。

2.4 生理生化鑒定分析

根據(jù)病原菌的分子鑒定結(jié)果，再參照伯杰氏系統(tǒng)鑒定手冊(cè)（第2版）［8］對(duì)病原菌FLT4的18項(xiàng)生理生化性狀進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果（表1）顯示：病原菌FLT4能利用糊精、纖維二糖、乳糖、麥芽糖、6-脫氧-L-半乳糖、D-半乳糖、蜜二糖、丙氨酸、L-丙氨酸和L-丙氨酰甘氨酸與地毯草黃單胞菌（X.axonopdis）一致，相似性達(dá)55.56%。

表1 病原菌FLT4生理生化測(cè)定結(jié)果

3 結(jié)論與討論

葉斑病是植物葉部較為常見(jiàn)的病害，在糧食作物和經(jīng)濟(jì)作物上均有發(fā)生，但引起發(fā)病的病原物卻不盡相同，細(xì)菌、真菌、病毒等都可能引起葉斑?。?0］。本研究通過(guò)對(duì)病原菌株FLT4的分離純化和致病性測(cè)定，并結(jié)合分子生物學(xué)鑒定和生理生化測(cè)定初步將引起福祿桐葉斑病的病原菌鑒定為地毯草黃單胞（X.axonopodis）。在本研究中，福祿桐葉斑病病斑為透明的水漬狀，中央有褐色小點(diǎn)，這與Nelson等［3］所報(bào)道的夏威夷福祿桐葉枯病病癥類似，但其病斑沿著葉脈發(fā)病和病原物為X.campestrispv.hederae，則與本研究不同，可能的原因是采樣的地點(diǎn)、季節(jié)不同，或存在多種病原菌能引起福祿桐葉斑病的情況。迄今為止，暫未查詢到在廣州有相同或類似的有關(guān)地毯草黃單胞引起福祿桐產(chǎn)生葉斑病的報(bào)道，本研究為開(kāi)展該病的致病機(jī)理和抗病機(jī)理研究奠定了基礎(chǔ)，為該病的防治提供了參考。

據(jù)報(bào)道，X.axonopodis是多種經(jīng)濟(jì)作物和糧食作物的病原物，能引起柑橘潰瘍病、木薯細(xì)菌性枯萎病、瓜爾豆細(xì)菌性疫病、紅掌細(xì)菌性葉枯病以及絨果桕屬植物Mabea fi stulifera和巴西胡椒木葉斑病等多種病害［11-16］。其中，由地毯草黃單胞菌萬(wàn)年青變種（X.axonopodispv.dieffenbachia）引起的紅掌細(xì)菌性葉枯病在巴西、美國(guó)、荷蘭、意大利、菲律賓以及我國(guó)的海南、廣東和云南等地均有大面積發(fā)生，X.axonopodispv.dieffenbachia也被歐洲和地中海植物保護(hù)組織（European and Mediterranean Plant Protection Organization, EPPO）列入A2檢疫生物名單之中［14，16-18］；由地毯草黃單胞柑橘致病變種（X.axonopodispv.citri）引起的柑橘潰瘍病是影響全球柑橘種植業(yè)發(fā)展的重大檢疫性病害，其病原菌也是國(guó)內(nèi)外的重大檢疫性有害生物［19］。

16S rRNA序列在原核生物中高度保守，對(duì)該序列進(jìn)行測(cè)定已被廣泛應(yīng)用于細(xì)菌的分類鑒定，其技術(shù)相對(duì)比較成熟，但在一些親緣關(guān)系相近的種或同一種內(nèi)不同致病變種的鑒定方面還存在一定的局限性［20-21］。本研究中，基于16S rRNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)不能很好的區(qū)分黃單胞菌中不同致病變種的親緣關(guān)系，需通過(guò)對(duì)病原菌生理生化性狀的鑒定來(lái)進(jìn)一步確定病原菌的種類。但生理生化鑒定結(jié)果很難具體確定到病原菌的致病變種，因此，需進(jìn)一步對(duì)病原菌的特定序列進(jìn)行測(cè)定，并對(duì)病原菌的種內(nèi)遺傳分化進(jìn)行深入研究。