農(nóng)大5號(hào)鈣果葉片芽誘導(dǎo)及其植株再生研究

韓向峰，李志芳，曹 琴，張海平，程小愛(ài)

（1.佛山市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，廣東 佛山 528145；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，山西 太谷 030800；3.定襄縣國(guó)有林場(chǎng)，山西 定襄 035400；4.太谷縣農(nóng)業(yè)委員會(huì)，山西 太谷 030800）

鈣果，種名歐李（Cerasus humilisBunge），果實(shí)中含有豐富的維生素、礦物質(zhì)、蛋白質(zhì)和各種氨基酸，每100 g含鈣量達(dá)60 mg，被稱(chēng)為天然的補(bǔ)鈣水果［1-6］。山西農(nóng)業(yè)大學(xué)經(jīng)過(guò)近30年的研究，已選育出農(nóng)大4號(hào)、農(nóng)大5號(hào)等系列優(yōu)良品種，為鈣果的人工栽培提供了豐富的良種資源。采用組織培養(yǎng)可以迅速擴(kuò)大良種苗木，由于鈣果樹(shù)體矮小、結(jié)果早，離體再生技術(shù)不僅可以繁育良種苗木，還可作為基因轉(zhuǎn)化、功能基因驗(yàn)證提供一種適宜于果樹(shù)的模式植物，為果樹(shù)的品種改良提供有效的生物技術(shù)途徑。目前，關(guān)于鈣果誘導(dǎo)器官分化、再生的研究已有一些報(bào)道［3，5］，但在品種、外植體來(lái)源、輔助處理、煉苗移栽等方面還不夠完整。本研究從鈣果葉片誘導(dǎo)不定芽、芽的繼代增值、生根和馴化移栽成苗到最終建立完整的無(wú)性繁殖體系進(jìn)行試驗(yàn)，為完善鈣果植株再生體系研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2011年將山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝研究所溫室中的農(nóng)大5號(hào)鈣果2年生苗及其組培實(shí)驗(yàn)室中的組培繼代苗、壯苗引種到佛山市農(nóng)科所的溫室和組培室。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 外植體的處理 從溫室中取2年生農(nóng)大5號(hào)鈣果苗新梢頂端2～3片剛展開(kāi)的嫩葉，放入燒杯。葉片經(jīng)75%酒精30 s和2%次氯酸鈉2 min消毒后，用無(wú)菌水再清洗3～4次，置于無(wú)菌濾紙吸干表面水分，葉片切去邊緣，并切去與滅菌劑接觸過(guò)的一段葉柄，接入培養(yǎng)基中。直接切取組培瓶中的繼代苗和壯苗中上部已展開(kāi)的葉片用于試驗(yàn)培養(yǎng)。

1.2.2 葉片誘導(dǎo)不定芽培養(yǎng)基的篩選 基本培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，日常光照時(shí)間為14 h/d，光照強(qiáng)度2 000 lx左右，培養(yǎng)溫度24（±2）℃。

（1）不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物的篩選。采用培養(yǎng)基 IAA（0、0.05、0.1 mg/L），NAA（0、0.05、0.1 mg/L），6-BA（0.8、1.0、1.2 mg/L）， 培養(yǎng)基〔MS、1/2MS（半）、1/2MS（全）〕4因素3水平正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，共9個(gè)處理，每個(gè)處理接種5～6瓶，每瓶放3～4個(gè)葉片，兩次重復(fù)，其中1/2MS（半）指MS的大量元素用量減半；1/2MS（全）指MS的全部元素用量減半。將葉片滅菌后去其邊緣，在與葉片主脈垂直方向橫切兩刀，使其邊緣相連，內(nèi)部均分為3部分后葉背向上放置于培養(yǎng)基上。觀察葉片的動(dòng)態(tài)變化，調(diào)查發(fā)生愈傷組織和不定芽誘導(dǎo)的情況。

（2）AgNO3、照光、葉片放置方式、部位等因素篩選。以不定芽誘導(dǎo)率較高的8號(hào)和6號(hào)培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，將葉片去頭去尾，再切掉邊緣，將葉片均勻切成葉尖、葉中和帶一點(diǎn)葉柄的葉基3部分。設(shè)置AgNO3（0、0.1、0.2 mg/L）、照光（全光照、暗培養(yǎng)、無(wú)光照）、放置方式（正放、反放、側(cè)放）、部位（葉基、葉中、葉尖）4因素3水平正交試驗(yàn)，其中正放指葉背接觸培養(yǎng)基；反放為指葉面接觸培養(yǎng)基；側(cè)放指與主脈相平行的葉緣一邊垂直插入培養(yǎng)基中一半，共9個(gè)處理，每個(gè)處理兩個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)6瓶，接種30 d后，觀察其誘導(dǎo)效果，計(jì)算誘導(dǎo)率。

芽誘導(dǎo)率（%）=再生出不定芽的外植體數(shù)/接種的外植體總數(shù)×100

1.2.3 葉片誘導(dǎo)出不定芽的繼代培養(yǎng) 將葉片誘導(dǎo)出的不定芽先在MS+IAA 0.05 mg/L培養(yǎng)基中壯苗后，再接種到MS+6-BA 0.05 mg/L+IAA 0.05 mg/L培養(yǎng)基上循環(huán)壯苗，觀察其芽苗生長(zhǎng)狀態(tài)。將經(jīng)過(guò)壯苗的莖段和莖尖轉(zhuǎn)接到MS+6-BA 0.2 mg/L培養(yǎng)基上分化培養(yǎng)，兩次重復(fù)，每次重復(fù)接種30個(gè)高約1 cm的健壯繼代莖段，20 d后調(diào)查其總增殖數(shù)、增殖率、分化芽的健壯情況及其可利用程度。

1.2.4 葉片再生不定芽的生根培養(yǎng) 葉片再生不定芽在MS+6-BA 0.05 mg/L+IAA 0.05 mg/L培養(yǎng)基上培養(yǎng)22 d后，選長(zhǎng)勢(shì)健壯的莖段部分進(jìn)行繼代培養(yǎng)，部分截取1.5 cm左右莖尖接種到生根培養(yǎng)基：1/2MS+IAA 1.2 mg/L，2次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)接種5瓶，每18根一瓶，15 d后調(diào)查其生根率。

1.2.5 葉片再生植株的煉苗與移栽 （1）第一階段：光培煉苗、閉瓶煉苗和開(kāi)瓶煉苗。組培苗在生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)約15 d后，根系長(zhǎng)到0.5～1.0 cm，將生根苗玻璃瓶移入室溫25～28℃、光照5 000～8 000 lx的溫室進(jìn)行光培閉瓶煉苗。10 d后生根苗有新葉長(zhǎng)出，葉片變大增厚，根系長(zhǎng)到約3 cm，植株已復(fù)壯。此時(shí)將封口膜打開(kāi)進(jìn)行開(kāi)瓶煉苗。將1 000倍的多菌靈液加入生根苗瓶?jī)?nèi)，殺菌液的高度約0.5 cm，在室溫25～28℃、光照5 000～8 000 lx條件下開(kāi)瓶煉苗2～3 d。煉苗過(guò)程中，對(duì)煉苗溫室也要進(jìn)行殺菌消毒。

（2）第二階段：基質(zhì)煉苗。瓶?jī)?nèi)煉苗后，將生根苗輕輕從玻璃瓶取出，用1 000倍多菌靈液清洗消毒后移栽到消過(guò)毒的基質(zhì)（深層土：泥炭：河沙：珍珠巖）中，澆透水，并扣小拱棚，上面加蓋遮陽(yáng)網(wǎng)，約40 d后，幼苗基本由異養(yǎng)為主變成自養(yǎng)能適應(yīng)溫室環(huán)境，完成馴化過(guò)程。

（3）第三階段：營(yíng)養(yǎng)杯煉苗?；|(zhì)煉苗后，苗長(zhǎng)5～8 cm，當(dāng)基部開(kāi)始半木質(zhì)化，根系變?yōu)楹稚?，有大量的毛?xì)跟產(chǎn)生時(shí)，將幼苗移栽到營(yíng)養(yǎng)杯中，澆透水，并扣小拱棚緩苗一周。之后去掉小拱棚，小苗開(kāi)始快速生長(zhǎng)。約30 d煉苗生長(zhǎng)后，去掉營(yíng)養(yǎng)杯，帶上土坨定植到大田中，進(jìn)行正常的田間管理。最后調(diào)查煉苗移栽成活率。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用鄧肯方差分析進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉片誘導(dǎo)不定芽的動(dòng)態(tài)變化

鈣果葉片在接種3 d彎曲隆起開(kāi)始啟動(dòng)，葉柄部位開(kāi)始逐漸膨大。培養(yǎng)10 d左右，葉柄傷口部位和主脈傷口部位產(chǎn)生少量愈傷，同時(shí)從葉柄的形成層處與產(chǎn)生愈傷的結(jié)合處出現(xiàn)綠色芽點(diǎn)，有的從膨大葉柄上分化出綠色芽點(diǎn)，有的從愈傷組織中分化出綠色芽點(diǎn)。3 d左右即可看到幼小的芽體長(zhǎng)出，從小芽體周?chē)只龃貭钣籽?，并不斷增多，一個(gè)誘導(dǎo)部位最多可以分化30多個(gè)芽體，但芽的質(zhì)量有強(qiáng)弱之分。其次產(chǎn)生芽的部位為葉片中部主脈傷口處，且?guī)缀醵际菑娜~背上誘導(dǎo)出芽。誘導(dǎo)出芽的時(shí)間主要集中在接種后10～15 d，約有90%的不定芽都在此時(shí)間段內(nèi)誘導(dǎo)出來(lái)，且多數(shù)不定芽較壯，但部分芽出現(xiàn)了玻璃化現(xiàn)象（圖1，封二）。此后仍有少量芽繼續(xù)從葉片邊緣或其他部位產(chǎn)生，但一般誘導(dǎo)出的不定芽較弱。

2.2 培養(yǎng)基和不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)葉片誘導(dǎo)芽再生的影響

2.2.1 溫室葉片誘導(dǎo)芽 從表1可以看出，8號(hào)處理的不定芽再生誘導(dǎo)率平均達(dá)41.05%，6號(hào)處理次之，平均誘導(dǎo)率為31.6%，其他處理均較差。由極差分析可知，培養(yǎng)基是影響不定芽誘導(dǎo)的主要因子。各因素的主次關(guān)系為培養(yǎng)基＞NAA＞6-BA＞IAA，最佳培養(yǎng)基及激素配比為1/2MS（全部元素減半）+IAA 0.1 mg/L+NAA 0.05 mg/L+6-BA 0.8 mg/L，即8號(hào)處理最佳。次之為1/2MS（大量元素減半）+IAA 0.05 mg/L+NAA 0.1 mg/L+6-BA 1.0 mg/L（與6號(hào)處理中的6-BA稍有差異）。

通過(guò)上述分析，篩選出鈣果溫室葉片誘導(dǎo)不定芽的最佳培養(yǎng)基為1/2MS（全部元素用量減半），其次為1/2MS（大量元素用量減半），生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比為IAA 0.1 mg/L、NAA 0.05 mg/L和6-BA 0.8 mg/L，其次為IAA 0.05 mg/L、NAA 0.1 mg/L和 6-BA 1.0 mg/L。

表1 培養(yǎng)基和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)溫室葉片的芽誘導(dǎo)

2.2.2 組培繼代分化苗葉片誘導(dǎo)芽 從表2可以看出，9個(gè)處理組合的不定芽再生誘導(dǎo)中，6號(hào)處理最好、平均誘導(dǎo)率達(dá)44.38%，最高達(dá)68.75%。由極差比較可知，IAA的極差最大，是影響繼代分化苗葉片不定芽再生的主要因子。各因素的主次關(guān)系為：IAA＞培養(yǎng)基＞NAA＞6-BA，本試驗(yàn)中最佳培養(yǎng)基及植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比為：1/2MS（大量元素用量減半）+ IAA 0.05 mg/L+ NAA 0.1 mg/L+6-BA 0.8 mg/L，即6號(hào)處理。

表2 培養(yǎng)基和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合對(duì)分化苗葉片的芽誘導(dǎo)

2.2.3 組培繼代壯苗葉片誘導(dǎo)芽 從表3可以看出，9個(gè)處理組合的不定芽再生誘導(dǎo)中，6號(hào)處理最好，平均芽誘導(dǎo)率為25.66%。由極差比較可知，NAA的極差最大，是影響繼代壯苗葉片不定芽再生的主要因子。各因素的主次關(guān)系為NAA＞IAA＞培養(yǎng)基＞6-BA，本試驗(yàn)中最佳培養(yǎng)基及植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比為：1/2 MS（大量元素減半）+IAA 0.05 mg/L+NAA 0.1 mg/L+6-BA 0.8 mg/L，即6號(hào)處理。

可見(jiàn)，盡管葉片來(lái)源不同均可以誘導(dǎo)出不定芽。適合于溫室葉片誘導(dǎo)不定芽再生的最佳培養(yǎng)基為1/2MS（全部元素減半）+IAA 0.1 mg/L+NAA 0.05 mg/L+6-BA 0.8 mg/L，即8號(hào)處理。其最高誘導(dǎo)率為42.1%，影響此類(lèi)葉片不定芽誘導(dǎo)因素的主次關(guān)系為培養(yǎng)基＞NAA＞6-BA＞IAA，各因素水平影響誘導(dǎo)效果的順序依次為NAA＞培養(yǎng)基＞6-BA＞IAA。適合組培繼代苗和壯苗葉片誘導(dǎo)不定芽再生的最佳培養(yǎng)基為1/2MS（大量元素減半）+IAA 0.05 mg/L+NAA 0.1 mg/L+6-BA 0.8 mg/L，即6號(hào)處理。不管分化苗還是壯苗，影響不定芽誘導(dǎo)的最主要因子均為生長(zhǎng)素類(lèi)，最次的因素為細(xì)胞分裂素6-BA。

表3 培養(yǎng)基和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)壯苗葉片的芽誘導(dǎo)

2.3 AgNO3、光照、放置方式、部位等處理組合對(duì)誘導(dǎo)不定芽的影響

2.3.1 在6號(hào)培養(yǎng)基中對(duì)芽再生的影響 從表4可以看出，處理9的不定芽誘導(dǎo)率最好，即在培養(yǎng)基中添加0.2 mg/L AgNO3、用帶一段葉柄的葉基部位、反放，無(wú)光條件下培養(yǎng)，平均誘導(dǎo)率達(dá)25%，其最高誘導(dǎo)率為35%；處理7次之，平均誘導(dǎo)率達(dá)20.0%；極差比較可知，AgNO3是影響6號(hào)培養(yǎng)基不定芽誘導(dǎo)率的主要因素。同時(shí)看出，影響因素的主次關(guān)系為：AgNO3＞放置方式或葉片部位＞光照?？梢?jiàn)，處理組合為在全光照條件下，以帶葉柄的葉基部分為材料，AgNO30.2 mg/L，將葉片反放在6號(hào)培養(yǎng)基上最佳。

表4 6號(hào)培養(yǎng)基不同處理組合對(duì)芽再生的影響

2.3.2 在8號(hào)培養(yǎng)基中對(duì)芽再生的影響 從表5可以看出，處理9組合的不定芽誘導(dǎo)率表現(xiàn)最好，即在培養(yǎng)基中添加0.2 mg/L AgNO3、采用無(wú)光、葉片反放、用帶一段葉柄的葉基部位處理的平均誘導(dǎo)率達(dá)22.5%，其最高誘導(dǎo)率為25%；極差比較可知，葉片部位的極差最大，是影響8號(hào)培養(yǎng)基不定芽誘導(dǎo)率的主要因素。影響因素的主次關(guān)系表現(xiàn)為：葉片部位＞放置方式＞AgNO3＞光照，最佳處理組合為：在暗培養(yǎng)條件下，以帶葉柄的葉基部分為材料，AgNO30.2 mg/L，葉片反放在8號(hào)培養(yǎng)基上，與9個(gè)處理組合在6號(hào)培養(yǎng)基上的最佳組合結(jié)果基本一致，但不同的是在8號(hào)培養(yǎng)基上的芽誘導(dǎo)率整體上沒(méi)有在6號(hào)培養(yǎng)基的高，可能是因?yàn)镹AA對(duì)誘導(dǎo)芽的作用較IAA好。

表5 在8號(hào)培養(yǎng)基上不同處理組合對(duì)芽再生的影響

綜上可知，4個(gè)影響不定芽誘導(dǎo)率的因素中，葉片部位、葉片放置方式和AgNO3均影響不定芽再生，且處理水平也一致，均為帶葉柄葉基、葉片反放、AgNO3均為0.2 mg/L。而光照條件影響最小，各水平之間無(wú)顯著性差異。

2.4 葉片再生不定芽的繼代、生根培養(yǎng)與馴化培養(yǎng)

由試驗(yàn)結(jié)果可知，農(nóng)大5號(hào)不定芽在繼代培養(yǎng)中平均增殖率為2.97%，且芽苗多數(shù)都生長(zhǎng)短粗、健壯，無(wú)玻璃苗產(chǎn)生；在生根培養(yǎng)中平均生根率為89.17%，最高生根率達(dá)到90%，生根條數(shù)均在2條以上，長(zhǎng)勢(shì)良好（圖2，封二）。農(nóng)大5號(hào)煉苗成活率高達(dá)到77.5%，可見(jiàn)鈣果組培苗的適應(yīng)性非常強(qiáng)。

3 結(jié)論與討論

已有研究表明，硝酸銀可抑制乙烯的合成，促進(jìn)愈傷組織再生芽的能力，可以增加外植體產(chǎn)生不定芽的數(shù)目及提高植株再生頻率［6-9］。本試驗(yàn)結(jié)果表明，相對(duì)于其他試驗(yàn)因素而言，硝酸銀對(duì)不定芽再生有較大影響，這與前人分析結(jié)果一致，但對(duì)于不定芽誘導(dǎo)率的整體提升表現(xiàn)效果不明顯。暗培養(yǎng)或弱光條件有利于誘導(dǎo)細(xì)胞分裂，可以提高葉片再生［5，10-11］。在葉片誘導(dǎo)愈傷組織的預(yù)實(shí)驗(yàn)中，也發(fā)現(xiàn)葉片在弱光或光暗培養(yǎng)下誘導(dǎo)愈傷組織產(chǎn)生的時(shí)間較全光照提前3～5 d，且愈傷組織在相同時(shí)間段產(chǎn)生的量也較全光照條件下多，這與多數(shù)報(bào)道的結(jié)論一致。本試驗(yàn)中用葉片直接誘導(dǎo)不定芽的試驗(yàn)結(jié)果表明，光照條件對(duì)葉片再生試驗(yàn)的影響都不顯著，且不定芽的再生也未見(jiàn)明顯提高。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，帶葉柄的葉基再生不定芽的能力最強(qiáng)，與師校欣等在櫻桃砧木離體培養(yǎng)中得出的結(jié)論［12-20］一致。關(guān)于葉片的放置方式，一般認(rèn)為雙子葉植物葉背面有大量氣孔，葉背面與培養(yǎng)基接觸，有利于營(yíng)養(yǎng)吸收，因此，采用葉背接觸培養(yǎng)基較多。在本試驗(yàn)中，葉片正面接觸培養(yǎng)基明顯的較葉背面接觸培養(yǎng)基效果好。因此葉片的放置方式對(duì)誘導(dǎo)不定芽的影響，也可能因不同的樹(shù)種而有所差異。其他樹(shù)種（如蘋(píng)果、海棠、草莓、梨、黃楊等）上也有類(lèi)似現(xiàn)象。

本試驗(yàn)僅對(duì)MS培養(yǎng)基元素添加的量進(jìn)行了研究，未涉及其他類(lèi)型的培養(yǎng)基，其后可以繼續(xù)研究。就MS培養(yǎng)基來(lái)說(shuō)，以全部元素或大量元素減半為好。就植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑來(lái)看，生長(zhǎng)素對(duì)芽的誘導(dǎo)要比細(xì)胞激動(dòng)素更為重要，因此，對(duì)于鈣果芽誘導(dǎo)，細(xì)胞激動(dòng)素的濃度應(yīng)相對(duì)固定，應(yīng)更多考慮調(diào)配生長(zhǎng)素如NAA、IAA的濃度。

組培苗是在人工控制條件下生長(zhǎng)，移出試管后即由異養(yǎng)轉(zhuǎn)為自養(yǎng)，環(huán)境條件的劇烈變化，影響著組培苗的成活率。組織培養(yǎng)苗能否大量應(yīng)用于生產(chǎn)，特別是木本植物能否取得好的效益，取決于組培苗能否有高的成活率，對(duì)移栽的基質(zhì)、溫度、濕度及光照等都要加以嚴(yán)格控制。

圖1 鈣果葉片直接誘導(dǎo)不定芽

圖2 鈣果葉片誘導(dǎo)不定芽的增殖（A）、生根（B）與煉苗（C）