不同產(chǎn)地葡萄花青素提取物的HPLC特征圖譜構(gòu)建及其生物活性分析

譚西 王馨悅 周欣 陳華國(guó)

摘要：【目的】對(duì)富含花青素的巨峰葡萄提取物指紋圖譜進(jìn)行測(cè)定并構(gòu)建其特征圖譜，考察不同產(chǎn)地巨峰葡萄提取物的抗氧化活性、乙酰膽堿酯酶（AChE）抑制活性及α-淀粉酶抑制活性，研究巨峰葡萄花青素的譜—效關(guān)系，明確其結(jié)構(gòu)與生物活性規(guī)律，為富含花青素植物資源的開發(fā)與利用提供參考依據(jù)?！痉椒ā恳?2個(gè)產(chǎn)地巨峰葡萄為研究對(duì)象，對(duì)其進(jìn)行花青素提取，檢測(cè)提取物的指紋圖譜并構(gòu)建特征圖譜，綜合評(píng)價(jià)不同產(chǎn)地樣品的抗氧化活性、AChE抑制活性和α-淀粉酶抑制活性，并對(duì)其進(jìn)行譜—效關(guān)系研究?！窘Y(jié)果】確定9、12、21、50和55號(hào)5個(gè)峰為巨峰葡萄的指紋圖譜特征峰。12個(gè)產(chǎn)地的巨峰葡萄花青素含量差異顯著（P<0.05，下同），以山東產(chǎn)地的含量最高（3.93 mg/g），湖北產(chǎn)地的最低（0.13 mg/g）。福建產(chǎn)地的巨峰葡萄提取物抗氧化能力最強(qiáng)，其對(duì)DPPH自由基和ABTS自由基的清除能力顯著強(qiáng)于其他產(chǎn)地的巨峰葡萄;山東產(chǎn)地巨峰葡萄提取物的AChE抑制活性最強(qiáng)（抑制率33.6%），其次是福建產(chǎn)地;浙江產(chǎn)地巨峰葡萄提取物的α-淀粉酶抑制活性最強(qiáng)，其次是新疆產(chǎn)地，內(nèi)蒙古產(chǎn)地的抑制活性最弱。譜—效關(guān)系分析結(jié)果表明，DPPH和ABTS法均可用于評(píng)價(jià)巨峰葡萄提取物抗氧化活性，5個(gè)特征峰與生物活性有較強(qiáng)的關(guān)聯(lián)性，其中12、21和50號(hào)峰與其抗氧化活性呈顯著或極顯著（P<0.01）相關(guān)，9、21和55號(hào)峰對(duì)α-淀粉酶抑制活性有一定貢獻(xiàn)，12、21和50號(hào)峰對(duì)AChE抑制活性具有較大貢獻(xiàn)。【結(jié)論】富含花青素的巨峰葡萄提取物具有良好的抗氧化活性、α-淀粉酶抑制活性和AChE抑制活性，可作為抗氧化、預(yù)防治療高血糖和阿爾茨海默病的潛在物質(zhì)。

關(guān)鍵詞： 巨峰葡萄;花青素;特征圖譜構(gòu)建;生物活性;譜—效關(guān)系

中圖分類號(hào)： S663.1;TS209? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2018）11-2263-10

Construction of HPLC characteristic chromatogram and bioactivity of anthocyanin extracts in Kyoho grape from different areas

TAN Xi1，2，3， WANG Xin-yue1，2，3， ZHOU Xin1，2，3 ， CHEN Hua-guo1，2，3*

（1Key Laboratory for Information System of Mountainous Areas and Protection of Ecological Environment，Guizhou Normal University， Guiyang? 550001， China; 2Guizhou Engineering Laboratory for Quality Control & Evaluation Technology of Medicine， Guizhou Normal University， Guiyang? 550001， China; 3Research Center for Quality Control of Natural Medicine， Guizhou Normal University， Guiyang? 550001， China）

Abstract：【Objective】The fingerprint chromatogram of anthocyanin-rich Kyoho grape（Vitis vinifera L.×V. labrusca Kyoho） extract was determined and its characteristic chromatogram was constructed. The antioxidant activity，acetylcholinesterase（AChE） inhibitory activity and α-amylase inhibitory activity of Kyoho grape extract from different habitats were investigated. The spectrum-activity relationship of anthocyanins from Kyoho grape was studied in order to explore its structure and biological activity regulation，and to provide reference for the development and utilization of anthocyanin-rich plant resources. 【Method】Taking Kyoho grapes from 12 different areas as research objects，anthocyanins were extrac-ted，fingerprints of extracts were detected and characteristic chromatogram were constructed. Antioxidant activity， AChE inhibitory activity and α-amylase inhibitory activity of the samples from different areas were evaluated comprehensively. Finally，the spectrum-effect relationship was studied. 【Result】The five peaks of No. 9，12，21，50 and 55 were identified as the characteristic peaks of Kyoho grapes fingerprints chromatogram .The anthocyanin contents of Kyoho grape from 12 producing areas were significantly different（P<0.05，the same below）. The highest anthocyanin content was found in Shandong origin（3.93 mg/g） and the lowest in Hubei origin（0.13 mg/g）. The antioxidant activity of Kyoho grape extract from Fujian origin was the strongest，and its scavenging ability to DPPH and ABTS free radicals was significantly stronger than that of Kyoho grape from other areas.The AChE inhibitory activity of Kyoho grape extract from Shandong origin was the strongest （inhibition rate was 33.6%），followed by Fujian origin.The inhibitory activity of α-amylase of Kyoho grape extract from Zhejiang origin was the strongest，those from Xinjiang and Inner Mongolia origins were the weakest.Spectrum-effect relationship analysis showed that DPPH and ABTS methods could be used to evaluate the antioxidant activity of Kyoho grape extract， and the five characteristic peaks had strong correlation with biological activity. Among them，peaks No. 12，21 and 50 were significantly or extremely（P<0.01） correlated with their antioxidant activities，peaks No. 9， 21 and 55 contributed to the inhibitory activity of α-amylase，and peaks No. 12，21 and 50 contributed greatly to the inhibitory activity of AChE. 【Conclusion】Anthocyanin-rich Kyoho grape extract has fine antioxidant activity，α-amylase inhibitory activity and AChE inhibitory activity. It can be used as a potential substance for antioxidation， prevention and treatment of hypoglycemia and Alzheimer's disease.

Key words：Kyoho grape;anthocyanin;characteristic chromatogram construction; biological activity;spectrum-effect relationships

0 引言

【研究意義】花青素是一類含有多種酚羥基的黃酮類化合物，廣泛分布于植物的根、莖、葉、花及果實(shí)組織中（孫建霞等，2008）。研究表明，花青素具有抗氧化、抗炎抗菌、抗腫瘤、預(yù)防心腦血管疾病、降血糖等藥用功效（徐春明等，2013，陳華國(guó)等，2018），因來(lái)源廣泛、細(xì)胞毒性小及食用安全等特點(diǎn)而廣受國(guó)內(nèi)外相關(guān)科技研究者的關(guān)注。葡萄（Vitis vinifera L.）是一種富含花青素（矢車菊素-3-葡萄糖苷、天竺葵素-3-葡萄糖苷、芍藥色素-3-葡萄糖苷、錦葵色素-3-乙酰葡萄糖苷等）的水果（Cassidy et al.，2013），對(duì)比不同產(chǎn)地同一品種葡萄中花青素提取物的生物活性，分析指標(biāo)間的譜—效關(guān)系，對(duì)開發(fā)和利用富含花青素的植物資源具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】目前，已有一些關(guān)于葡萄花青素的研究，主要集中在提取分離純化、抗氧化活性及組分鑒定方面。Frenich等（2010）利用高效液相色譜（HPLC）成功從葡萄皮中提取鑒定了3-O-葡萄糖苷。楊慧等（2015）以新疆紫葡萄為試驗(yàn)材料，研究發(fā)現(xiàn)超聲波輔助乙醇法提取花青素較傳統(tǒng)乙醇浸提法平均提取率提高20.5%。杜月嬌等（2017）發(fā)現(xiàn)山葡萄花青素主要由飛燕草素、矢車菊素、矮牽牛素、芍藥素及錦葵素組成，其含量分別為51.03、19.30、13.54、3.00和99.91 mg/100 g。葛艷琳（2018）研究發(fā)現(xiàn)，山葡萄皮花青素濃度與其對(duì)DPPH自由基的清除能力呈正相關(guān)，且抗氧化活性高于抗壞血酸。Kharadze等（2018）對(duì)5個(gè)地方葡萄品種的紅葡萄酒樣品進(jìn)行花青素研究，發(fā)現(xiàn)葡萄酒花青素含量與其抗氧化活性呈正相關(guān)。MohdMaidin等（2018）研究發(fā)現(xiàn)表面活性劑TWEEN20對(duì)紅葡萄渣花青素提取物具有穩(wěn)定作用。【本研究切入點(diǎn)】雖然已有關(guān)于葡萄花青素的研究，但其研究?jī)?nèi)容與形式較單一，對(duì)體外降血糖（α-淀粉酶抑制活性）、改善心腦血管疾病功能[乙酰膽堿酯酶（AChE）抑制活性]及探索富含花青素提取物的譜—效關(guān)系研究較少，且大多研究局限于某產(chǎn)地的某種樣品，缺乏可比性、系統(tǒng)性和科學(xué)性。本研究以來(lái)自不同省（市）富含花青素的巨峰葡萄為研究對(duì)象開展相關(guān)研究，比以往的單一研究形式有所突破?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】構(gòu)建巨峰葡萄富含花青素提取物的特征圖譜，對(duì)比不同產(chǎn)地巨峰葡萄富含花青素提取物的抗氧化活性、AChE抑制活性及α-淀粉酶抑制活性，分析各指標(biāo)間的譜—效關(guān)系，以期為富含花青素植物資源的開發(fā)與利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

巨峰葡萄（V. vinifera L.×V. labrusca Kyoho）分別購(gòu)自北京市、廣東（廣州）、山東（濟(jì)寧）、新疆（烏魯木齊）、重慶市、浙江（杭州）、福建（福州）、四川（成都）、內(nèi)蒙古（呼和浩特）、湖北（武漢）、江西（南昌）和貴州（貴陽(yáng)）。無(wú)水乙醇（分析純）購(gòu)自天津市富宇精細(xì)化工有限公司;甲醇和鹽酸（優(yōu)級(jí)純）購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;磷酸氫二鉀和磷酸二氫鉀（分析純）購(gòu)自天津博迪化工股份有限公司;乙腈（色譜純）購(gòu)自美國(guó)Tedia公司;冰乙酸和可溶性淀粉（分析純）購(gòu)自天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司;甲酸（分析純）購(gòu)自重慶茂業(yè)化學(xué)試劑有限公司;矢車菊-3-O-葡萄糖苷（純度≥99%）和維生素C（純度≥99%）購(gòu)自貴州迪大科技有限責(zé)任公司;2'-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）（純度≥98%）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）（純度≥98%）和5，5'-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）（DTNB）（純度≥98%）均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;α-淀粉酶（分析純）、二硝基水楊酸（純度>98%）、酒石酸鉀鈉（純度>98%）、AChE（純度≥99%）和碘代硫代乙酰膽堿（ATCI）（純度≥99%）均購(gòu)自大連美侖生物技術(shù)有限公司。

主要儀器設(shè)備：明澈純水/超純水系統(tǒng)（法國(guó)Millipore公司），Spectra Max Plus 384酶標(biāo)儀（美國(guó)Molecular Device公司），XS 105十萬(wàn)分之一分析天平、AL 204萬(wàn)分之一分析天平[梅特勒—托利多儀器（上海）有限公司]，R-200旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士BUCHI公司），電熱恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司），Eppendorf Research Plus微量移液器（德國(guó)Eppendorf公司），TD5M低速離心機(jī)（長(zhǎng)沙邁佳森儀器設(shè)備有限公司），三洋微波爐EM-202MS1（合肥榮事達(dá)三洋電器有限公司），美的攪拌機(jī)MJ-220BP01A（廣東美的生活電器制造有限公司），Agilent 1260高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司），Hypersil GOLD C18柱（美國(guó)Thermo Scientific）。

1. 2 花青素提取物制備

1. 2. 1 花青素提取 在本課題組前期研究的基礎(chǔ)上，參照Wen等（2015）的方法略作修改，將12個(gè)產(chǎn)地巨峰葡萄各自粉碎勻漿后，以料液比1∶10加入52%乙醇溶液，微波提取4 min（微波功率469 W），提取液于低速離心機(jī)3500 r/min離心5 min后取上清液減壓濃縮，冷凍干燥后制成浸膏，置于干燥罐中存放備用。

1. 2. 2 花青素純化 參照本課題組前期研究（Wen et al.，2016），將花青素提取物加水稀釋至花青素質(zhì)量濃度為0.75 mg/mL，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至1。聚酰胺樹脂（60～100目）用95%乙醇煮沸4 h后以純水洗凈，作為填料裝柱，將稀釋后的樣品提取物以5 BV/h的速度上柱5 BV，隨后用3 BV純水洗脫，再用80%乙醇（pH 3）以5 BV/h的速度洗脫3.5 BV，洗脫液經(jīng)減壓濃縮后真空冷凍干燥得樣品粉末，裝于棕色瓶保存在干燥器中。

1. 3 樣品溶液配制

1. 3. 1 樣品儲(chǔ)備液配制 精確稱取各樣品浸膏置于4 mL離心管中，加入適量水復(fù)溶，配制成母液質(zhì)量濃度40 mg/mL的儲(chǔ)備液，存放于-20 ℃，使用時(shí)稀釋。

1. 3. 2 HPLC供試品溶液制備 準(zhǔn)確量取各樣品儲(chǔ)備液，加入適量純水，稀釋后冷卻至室溫，HPLC進(jìn)樣前用0.45 μm水相微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得HPLC供試品溶液。

1. 3. 3 對(duì)照品溶液制備 準(zhǔn)確稱取矢車菊素-3-O-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品4.47 mg，加入適量純水溶解，冷卻至室溫，定容至5 mL，配制所得對(duì)照品質(zhì)量濃度為0.897 mg/mL，上樣前通過(guò)0.45 μm水相微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得對(duì)照品溶液。

1. 4 色譜條件

色譜柱Hypersil GOLD C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相A為1%甲酸，B為乙腈，柱溫35 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)290 nm，進(jìn)樣量20.0 μL，梯度洗脫程序見表1。

1. 5 方法學(xué)考察

通過(guò)預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，山東產(chǎn)地的巨峰葡萄花青素含量相對(duì)較高，且圖譜情況效果較佳，故以山東巨峰葡萄為HPLC指紋圖譜方法學(xué)考察的試驗(yàn)對(duì)象。

1. 5. 1 精密度考察 取80.00 mg山東巨峰葡萄樣品，加入4 mL純水溶解，制成供試品溶液進(jìn)行分析，按1.4的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣5次，檢測(cè)得到液相色譜圖，計(jì)算主要色譜峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD，%），以確保儀器的精密度。

1. 5. 2 穩(wěn)定性考察 取80.00 mg山東巨峰葡萄樣品，加入4 mL純水溶解，制成供試品溶液進(jìn)行分析，分別在0、3、6、12和24 h進(jìn)樣，檢測(cè)得到液相色譜圖，計(jì)算主要色譜峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD，測(cè)定該樣品的穩(wěn)定性。

1. 5. 3 重復(fù)性考察 準(zhǔn)確稱取80.00 mg山東巨峰葡萄樣品5份，分別加入4 mL純凈水溶解，制成供試品溶液進(jìn)行分析，檢測(cè)得到液相色譜圖，計(jì)算主要色譜峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD，測(cè)定分析方法重復(fù)性。

1. 6 樣品指紋圖譜測(cè)定

按照1.3制備供試品溶液，于Agilent 1260高效液相色譜儀精密上樣20 μL，以1.4的條件測(cè)定，得到不同樣品的液相色譜圖。將11個(gè)產(chǎn)地（因湖北產(chǎn)地的花青素含量太低，故舍去其指紋圖譜研究）巨峰葡萄HPLC圖譜的數(shù)據(jù)導(dǎo)入中藥色譜特征圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2004A版），設(shè)置參比峰、時(shí)間窗后進(jìn)行自動(dòng)化匹配及相似度計(jì)算，得到各產(chǎn)地樣品測(cè)定的指紋圖譜。

1. 7 特征圖譜構(gòu)建

通過(guò)中藥色譜特征圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2004A版）確定各樣品的共有特征峰，構(gòu)建各樣品的花青素高效液相特征圖譜。

1. 8 相似度評(píng)價(jià)

通過(guò)中藥色譜特征圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2004A版）進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)。

1. 9 花青素含量測(cè)定

采用鹽酸—甲醇法測(cè)定花青素含量。取1 mL花青素樣品溶液（以溶劑為空白）加入到10 mL比色管中，再加入5 mL 1%鹽酸甲醇溶液使其顯色，充分振蕩搖勻，50 ℃水浴10 min，取出冷卻至室溫，于530 nm處測(cè)定其吸光值。按上述條件以矢車菊-3-O-葡萄糖苷為對(duì)照品，測(cè)定對(duì)照品530 nm處吸光值。根據(jù)計(jì)算公式計(jì)算樣品中的花青素含量。

Cs=[AsAc]×Cc

式中，Cs表示樣品質(zhì)量濃度，As表示樣品吸光值，Cc表示對(duì)照品質(zhì)量濃度，Ac表示對(duì)照品吸光值。

1. 10 抗氧化活性能力測(cè)試

1. 10. 1 ABTS自由基清除能力測(cè)試 ABTS自由基溶液由14 mmol/L ABTS溶液和5 mmol/L過(guò)硫酸鉀水溶液以1∶1混合避光反應(yīng)12～16 h后使用，使用時(shí)20倍稀釋。樣品溶液（Ai）的制備，分別取50 μL不同產(chǎn)地的相同濃度樣品溶液加至酶標(biāo)板中，復(fù)孔3次，再加入200 μL ABTS自由基溶液混合均勻，室溫避光反應(yīng)6 min，于734 nm處測(cè)定吸光值。以200 μL純凈水代替ABTS溶液為對(duì)照（Aj）測(cè)定吸光值，空白（A0）以相同體積純水代替樣品溶液，以維生素C為對(duì)照品，根據(jù)計(jì)算公式計(jì)算樣品ABTS自由基清除率。

清除率（%）=[（A0-Ai-Aj）A0]×100

以維生素C質(zhì)量濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)、ABTS自由基清除率（%）為縱坐標(biāo)，得到線性回歸方程：y=1.2006x-0.3016（R2=0.9965）。

1. 10. 2 DPPH自由基清除能力測(cè)試 參考Kim等（2003）的方法略有改動(dòng)進(jìn)行DPPH自由基清除試驗(yàn)。稱取9.86 mg DPPH溶于無(wú)水乙醇溶液，定容至100 mL，現(xiàn)配現(xiàn)用。取40 μL不同產(chǎn)地的相同濃度樣品溶液加至酶標(biāo)板中，復(fù)孔3次，再加入160 μL DPPH溶液，于37 ℃避光反應(yīng)30 min，以乙醇為對(duì)照，在波長(zhǎng)517 nm處測(cè)定吸光值，空白溶液以相同體積純水代替樣品溶液，計(jì)算樣品DPPH自由基清除率（清除率計(jì)算公式參照ABTS自由基清除率計(jì)算公式）。以維生素C為對(duì)照品，維生素C質(zhì)量濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，以DPPH自由基清除率（%）為縱坐標(biāo)，得到線性回歸方程：y=1.2042x+1.7233（R2=0.9993）。

1. 11 AChE抑制活性測(cè)試

采用改良的Ellman法（Ellman et al.，1961）對(duì)富含花青素巨峰葡萄提取物進(jìn)行AChE活性抑制研究。整個(gè)反應(yīng)在酶標(biāo)板中進(jìn)行，反應(yīng)體系中各加入20 μL樣液、140 μL 0.1 mol/L磷酸緩沖液（pH 7.2）、20 μL AChE（0.64 μg/mL）和10 μL 75 mmol/L ATCI溶液，在37 ℃保溫30 min后加入10 μL DTNB溶液，室溫下避光放置20 min后立即在波長(zhǎng)405 nm處測(cè)定吸光值（AUS）。52%乙醇代替樣品溶液測(cè)得空白值（AUb）;磷酸緩沖液代替酶溶液的空白溶液吸光值（AU0），磷酸緩沖液代替酶溶液測(cè)定樣品溶液的吸光值（AU0），以氫溴酸加蘭他敏為陽(yáng)性對(duì)照，試驗(yàn)重復(fù)3次，求平均值。AChE活性抑制率計(jì)算公式如下：

AChE抑制率（%）=[（AUb-AU0）-（AUS-AU0）AUb-AU0]×

100

1. 12 α-淀粉酶抑制活性測(cè)試

參考Marcia等（2009）的方法略作修改，取100 μL相同濃度、不同產(chǎn)地的巨峰葡萄供試品溶液置于4 mL離心管中，然后加入200 μL 1 mg/mL α-淀粉酶溶液，于恒溫箱37 ℃保溫10 min后加入400 μL 1%可溶性淀粉溶液，再于恒溫箱37 ℃保溫10 min，加入50 μL DNS溶液沸水浴5 min，置于冷水中迅速冷卻至室溫，于540 nm處測(cè)定吸光值，其中空白溶液以純水代替樣品。

α-淀粉酶抑制率（%）=[A0-ASA0]×100

式中，AS為樣品組吸光值，A0為空白組吸光值，樣品組與空白組均扣除相應(yīng)的本底吸收值。

1. 13 譜—效關(guān)系分析

1. 13. 1 Pearson相關(guān)分析 根據(jù)不同產(chǎn)地提取物的特征圖譜共有峰峰面積、花青素含量、ABTS自由基清除率、DPPH自由基清除率、AChE抑制活性和α-淀粉酶抑制活性，通過(guò)Pearson相關(guān)系數(shù)法建立6個(gè)變量間的關(guān)系，結(jié)果用Pearson系數(shù)表示。

1. 13. 2 灰色關(guān)聯(lián)度分析 采用灰色關(guān)聯(lián)度對(duì)不同產(chǎn)地樣品的特征色譜峰峰面積和抗氧化活性、α-淀粉酶抑制活性、AChE抑制活性結(jié)果進(jìn)行綜合分析，揭示不同樣品花青素與其生物活性的規(guī)律。

1. 13. 3 偏最小二乘法 采用偏最小二乘法對(duì)樣品特征圖譜峰面積與生物活性（特別是抗氧化活性）的相關(guān)性進(jìn)行研究，分析特征圖譜色譜峰與抗氧化作用的相互關(guān)系。

1. 14 統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2016、SPSS 21.0、DPS V15.10和SIMCA 14.1對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 方法學(xué)考察結(jié)果

2. 1. 1 精密度考察 對(duì)山東巨峰葡萄供試品溶液檢測(cè)分析后發(fā)現(xiàn)，其主要共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.10%～0.21%，主要共有峰相對(duì)峰面積的RSD為0.76%～2.34%，均小于3.00%，符合指紋圖譜要求，表明儀器精密度良好。

2. 1. 2 穩(wěn)定性考察 對(duì)山東巨峰葡萄供試品溶液檢測(cè)分析后發(fā)現(xiàn)，其主要共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.26%～0.32%，主要共有峰相對(duì)峰面積的RSD為0.73%～2.94%，符合指紋圖譜要求，表明該供試品溶液在24 h內(nèi)化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定。

2. 1. 3 重復(fù)性考察 對(duì)山東巨峰葡萄供試品溶液檢測(cè)分析后發(fā)現(xiàn)，其共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.11%～0.19%，相對(duì)峰面積的RSD為0.51%～1.76%，均符合指紋圖譜要求，表明該方法重現(xiàn)性良好。

2. 2 樣品指紋圖譜測(cè)定結(jié)果

以北京巨峰葡萄（S1）為參照?qǐng)D譜，采用中藥色譜特征圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件（2004A版），按照平均值生成對(duì)照?qǐng)D譜并設(shè)置時(shí)間窗為0.5進(jìn)行自動(dòng)匹配后生成指紋圖譜（圖1）。通過(guò)指紋圖譜可比較出11個(gè)產(chǎn)地中巨峰葡萄含有的共有峰，以確定不同產(chǎn)地巨峰葡萄中可能含有的相同物質(zhì)。

2. 3 特征圖譜的構(gòu)建

依照植物資源指紋圖譜研究的技術(shù)要求及相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)構(gòu)建巨峰葡萄提取物的特征圖譜（圖2），通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)，在11個(gè)產(chǎn)地巨峰葡萄提取物指紋圖譜中，9、12、21、50和55號(hào)峰為共有且相對(duì)較高的峰，因此，最終選擇這5個(gè)峰作為巨峰葡萄的指紋特征峰，峰面積及保留時(shí)間見表2。

2. 4 相似度評(píng)價(jià)結(jié)果

由表3可知，11個(gè)產(chǎn)地的巨峰葡萄提取物色譜圖與對(duì)照指紋譜圖的相似度為0.868～0.980，符合指紋圖譜要求。

2. 5 花青素含量測(cè)定結(jié)果

如圖3所示，經(jīng)測(cè)定后發(fā)現(xiàn)，12個(gè)產(chǎn)地的巨峰葡萄中花青素含量整體較低，平均為1.51 mg/g，其中山東產(chǎn)地的含量最高（3.93 mg/g），最低的是湖北產(chǎn)地，含量?jī)H為0.13 mg/g;12個(gè)產(chǎn)地的巨峰葡萄中花青素含量排序?yàn)樯綎|>內(nèi)蒙古>四川>江西>廣東>新疆>福建>貴州>北京>浙江>重慶>湖北，各產(chǎn)地的含量間均存在顯著差異（P<0.05，下同）。

2. 6 抗氧化活性能力測(cè)試結(jié)果

如圖4和圖5所示，12個(gè)產(chǎn)地富含花青素的巨峰葡萄提取物（濃度均為1 mg/mL）對(duì)DPPH和ABTS自由基的清除率趨勢(shì)基本相同。對(duì)DPPH自由基的清除能力，以福建產(chǎn)地的巨峰葡萄提取物最強(qiáng)，清除率為60.69%，顯著高于其他產(chǎn)地，貴州、內(nèi)蒙古、新疆和四川4個(gè)產(chǎn)地的清除率均在30.00%以上，其中內(nèi)蒙古、新疆和四川產(chǎn)地間的DPPH自由基清除率無(wú)顯著差異（P>0.05，下同），浙江、廣東、山東、重慶、北京、湖北和江西7個(gè)產(chǎn)地的清除率在20.00%～30.00%，山東、重慶、北京和湖北產(chǎn)地間的DPPH自由基清除率無(wú)顯著差異;對(duì)ABTS自由基的清除能力，同樣以福建產(chǎn)地的巨峰葡萄提取物最強(qiáng)，清除率為57.67%，也顯著高于其他產(chǎn)地，四川與浙江產(chǎn)地、廣東與山東產(chǎn)地、北京與湖北及江西產(chǎn)地間的ABTS自由基清除率無(wú)顯著差異。

2. 7 AChE抑制活性測(cè)試結(jié)果

如圖6所示，12個(gè)產(chǎn)地富含花青素的巨峰葡萄提取物（濃度5 mg/mL）對(duì)AChE的抑制率以山東產(chǎn)地的最高（33.6%），其次是福建（28.8%），兩個(gè)產(chǎn)地的AChE抑制率顯著高于其他10個(gè)產(chǎn)地，其他10個(gè)產(chǎn)地巨峰葡萄提取物對(duì)AChE的抑制率在10.0%～20.0%內(nèi)浮動(dòng);除浙江與湖北產(chǎn)地間的AChE抑制率無(wú)顯著差異外，其余產(chǎn)地間均存在顯著差異。

2. 8 α-淀粉酶抑制活性測(cè)試結(jié)果

由圖7可知，富含花青素巨峰葡萄提取物對(duì)α-淀粉酶的抑制率相對(duì)較高，在相同濃度下以浙江產(chǎn)地巨峰葡萄的抑制率最高（由于保證各產(chǎn)地樣品濃度相同，浙江產(chǎn)地的巨峰葡萄花青素提取物對(duì)α-淀粉酶完全抑制），內(nèi)蒙古、北京、四川和山東產(chǎn)地的抑制率均低于50.0%，分別為27.8%、32.0%、46.2%和46.7%，其余產(chǎn)地的抑制率排序?yàn)樾陆?福建>廣東>貴州>重慶>湖北>江西，其中福建與廣東產(chǎn)地、四川與山東產(chǎn)地間的α-淀粉酶抑制能力無(wú)顯著差異。

2. 9 譜—效關(guān)系分析結(jié)果

2. 9. 1 Pearson相關(guān)分析 由表4可知，ABTS自由基清除率與DPPH自由基清除率呈極顯著正相關(guān)（P<0.01，下同），相關(guān)系數(shù)為0.994，說(shuō)明兩種方法評(píng)價(jià)抗氧化能力結(jié)果一致，且抗氧化能力與12、21、50號(hào)峰均呈顯著或極顯著正相關(guān)，但與9和55號(hào)峰的相關(guān)性不顯著，可能由于12、21和50號(hào)峰是影響巨峰葡萄提取物抗氧化能力的主要因素。α-淀粉酶抑制活性與花青素含量呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.599，說(shuō)明巨峰葡萄提取物對(duì)α-淀粉酶抑制活性起主要作用的是花青素。12、21和50號(hào)峰與AChE抑制活性的相關(guān)系數(shù)均大于0.500，表明這3種物質(zhì)對(duì)AChE活性具有一定的抑制作用。

2. 9. 2 灰色關(guān)聯(lián)度分析 由表5可知，DPPH自由基清除率與巨峰葡萄提取物的5個(gè)共有特征峰的關(guān)聯(lián)順序?yàn)閄4>X2>X5>X1>X3，ABTS自由基清除率與5個(gè)共有特征峰的關(guān)聯(lián)順序?yàn)閄2>X4>X5>X3>X1，花青素含量與5個(gè)共有特征峰的關(guān)聯(lián)順序?yàn)閄4>X5>X2>X3=X1，α-淀粉酶抑制活性與5個(gè)共有特征峰的關(guān)聯(lián)順序?yàn)閄5>X1>X4>X2>X3，AChE抑制活性與5個(gè)共有特征峰的關(guān)聯(lián)順序?yàn)閄4>X5>X2>X3>X1。所測(cè)4種生物活性和花青素含量與各共有峰的關(guān)聯(lián)系數(shù)在0.5963～0.7371，處于中等關(guān)聯(lián)度范圍，其中DPPH和ABTS自由基清除率與共有峰的關(guān)聯(lián)順序基本一致，與相關(guān)性分析結(jié)果吻合，對(duì)抗氧化活性影響最大的為12和50號(hào)峰，同時(shí)50號(hào)峰是影響花青素含量和AChE抑制活性的主要色譜峰，55號(hào)峰對(duì)α-淀粉酶抑制活性的關(guān)聯(lián)性最強(qiáng)。

2. 9. 3 偏最小二乘法 將樣品特征圖譜的共有峰峰面積分別與DPPH自由基清除率、ABTS自由基清除率、花青素含量、α-淀粉酶抑制活性和AChE抑制活性各指標(biāo)結(jié)果錄入SIMCA 14.1進(jìn)行分析，獲得回歸方程系數(shù)圖和回歸線性圖（圖8）。由圖8可知，巨峰葡萄提取物的5個(gè)共有峰與DPPH自由基清除率、ABTS自由基清除率、AChE抑制活性有一定線性關(guān)系，與花青素含量和α-淀粉酶抑制活性無(wú)線性關(guān)系。除9號(hào)峰外，12、21、50和55號(hào)峰與DPPH、ABTS自由基清除率的回歸系數(shù)均為正值，且50號(hào)峰最大，55、21和12號(hào)峰次之。12、21和50號(hào)峰對(duì)花青素含量有貢獻(xiàn)，9和55號(hào)峰對(duì)其回歸系數(shù)為負(fù)數(shù);9、21和55號(hào)峰對(duì)α-淀粉酶抑制活性有一定貢獻(xiàn)，12和50號(hào)峰對(duì)其回歸系數(shù)為負(fù)值;12、21和50號(hào)峰對(duì)AChE抑制活性有較大貢獻(xiàn)，9和55號(hào)峰對(duì)AChE抑制活性回歸系數(shù)為負(fù)值，與Pearson相關(guān)分析結(jié)果一致。

3 討論

花青素因具有抗氧化、改善血液循環(huán)、抗炎癥、抗過(guò)敏、抗腫瘤等多種生物活性而備受相關(guān)食品行業(yè)及醫(yī)藥領(lǐng)域的重視。本研究采用微波提取法對(duì)12個(gè)不同產(chǎn)地的巨峰葡萄進(jìn)行花青素提取，并測(cè)定其含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地樣品中的花青素含量存在顯著差異，究其原因可能與樣品的生長(zhǎng)環(huán)境、采摘季節(jié)等因素有關(guān)。對(duì)不同產(chǎn)地巨峰葡萄樣品的抗氧化活性進(jìn)行評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)巨峰葡萄表現(xiàn)出較強(qiáng)抗氧化活性，且呈較穩(wěn)定趨勢(shì)，個(gè)別產(chǎn)地的樣品出現(xiàn)極低或極高的自由基清除率，說(shuō)明同種樣品仍會(huì)因?yàn)樯L(zhǎng)環(huán)境的差異導(dǎo)致其活性不同，但相對(duì)穩(wěn)定，與高璐等（2014）、葛艷琳（2018）研究發(fā)現(xiàn)葡萄花青素具有抗氧化活性的結(jié)論一致。此外，劉學(xué)銘等（2014）、張玲艷和王宏權(quán)（2014）、陳月英等（2016）、馮貴濤（2016）分別對(duì)桑葚、荔枝殼、紫心紅薯、葡萄籽、黑枸杞、葡萄皮渣和藍(lán)莓進(jìn)行花青素抗氧化活性評(píng)價(jià)，證實(shí)來(lái)自不同植物資源的花青素均具有抗氧化活性。

本研究采用改良的Ellman法測(cè)定12個(gè)產(chǎn)地富含花青素巨峰葡萄提取物的AChE抑制活性，結(jié)果表明，不同產(chǎn)地巨峰葡萄的AChE抑制活性存在明顯差異，以山東產(chǎn)地巨峰葡萄提取物對(duì)AChE活性的抑制效果最佳。花青素通過(guò)對(duì)AChE活性的抑制可阻斷神經(jīng)元間傳導(dǎo)質(zhì)乙酰膽堿的分解，有效預(yù)防和緩解阿爾茨海默?。ㄖx榮源，2014），但具體入藥效果還需進(jìn)一步體內(nèi)研究證明。本研究還發(fā)現(xiàn)巨峰葡萄花青素提取物對(duì)α-淀粉酶活性具有良好的抑制作用，與楊雪娜（2016）、郭雅靖等（2017）研究發(fā)現(xiàn)葡萄籽、高粱麩皮、冷撒果皮及龍眼皮花青素具有良好α-淀粉酶抑制活性的結(jié)論一致，但本研究的內(nèi)容與形式相對(duì)更具針對(duì)性和全面性。α-淀粉酶是調(diào)節(jié)血糖的關(guān)鍵酶，其抑制劑可特異性抑制α-淀粉酶水解，通過(guò)影響葡萄糖的吸收和釋放來(lái)調(diào)節(jié)餐后血糖，臨床醫(yī)學(xué)可用于防治糖尿病、高血糖、高血脂、肥胖癥等疾病，葡萄花青素作為天然的α-淀粉酶抑制劑具有良好前景。

本研究通過(guò)Pearson相關(guān)、灰色關(guān)聯(lián)度和偏最小二乘3種分析方法對(duì)樣品的各指標(biāo)進(jìn)行譜—效關(guān)系探究，結(jié)果表明，DPPH和ABTS兩種方法均可用于評(píng)價(jià)巨峰葡萄提取物的抗氧化活性能力。在巨峰葡萄提取物特征圖譜的5個(gè)共有特征峰中，21和50號(hào)峰對(duì)其抗氧化活性起主要作用;50號(hào)峰與花青素含量相關(guān)性較強(qiáng);9、21和55號(hào)峰對(duì)α-淀粉酶抑制活性具有一定貢獻(xiàn);12、21和50號(hào)峰與AChE抑制活性相關(guān)性強(qiáng)，具有較大貢獻(xiàn)。

本研究選取12個(gè)不同產(chǎn)地的巨峰葡萄為研究對(duì)象，較傳統(tǒng)分析方法的研究?jī)?nèi)容與形式更嚴(yán)謹(jǐn)，研究結(jié)果也更具可比性、系統(tǒng)性和科學(xué)性，對(duì)AChE抑制活性和α-淀粉酶抑制活性及各指標(biāo)間的譜—效關(guān)系的研究為葡萄花青素生物活性的深入研究提供了可靠參考依據(jù)和新思路。但花青素在人體內(nèi)的藥用效果還需進(jìn)一步驗(yàn)證，花青素結(jié)構(gòu)與各生物活性間的深入關(guān)系及相關(guān)機(jī)理機(jī)制是今后研究的重點(diǎn)方向。

4 結(jié)論

12個(gè)不同產(chǎn)地富含花青素的巨峰葡萄均具有良好的抗氧化活性、α-淀粉酶抑制活性及AChE抑制活性，可作為抗氧化、預(yù)防治療高血糖和阿爾茨海默病的潛在物質(zhì)，有良好的功能食品開發(fā)前景;對(duì)各試驗(yàn)指標(biāo)進(jìn)行譜—效關(guān)系分析，找到各成分對(duì)生物活性藥效的貢獻(xiàn)率，為富含花青素植物資源的相關(guān)活性與譜—效關(guān)系研究提供了新的研究模式和方向。

參考文獻(xiàn)：

陳華國(guó)，周潔，周欣. 2018. 響應(yīng)面法優(yōu)化紅布林中花青素提取工藝研究[J]. 貴州師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），36（3）：23-28. [Chen H G，Zhou J，Zhou X. 2018. Optimization extraction of anthocyanin from red plum by response surface methodology[J]. Journal of Guizhou Normal University（Natural Sciences），36（3）：23-28.]

陳月英，王彥平，孫瑞琳，楊會(huì)會(huì)，謝克英，古洋. 2016. 葡萄皮渣原花青素酶法提取工藝優(yōu)化及抗氧化性研究[J]. 北方園藝，（16）：129-132. [Chen Y Y，Wang Y P，Sun R L，Yang H H，Xie K Y，Gu Y. 2016. Study on optimization of enzyme-assisted extraction of proanthocyanidins from grape residues and its antioxidant activity[J]. Northern Horticulture，（16）：129-132.]

杜月嬌，賀陽(yáng)，文連奎. 2017. 山葡萄花青素超高壓提取工藝優(yōu)化及其組分分析[J]. 食品科學(xué)，38（10）：258-263. [Du Y J，He Y，Wen L K. 2017. Optimization of ultra-high pressure extraction of anthocyanins from Vitis amurensis Rupr. and analysis of its anthocyanin composition[J]. Food Science，38（10）：258-263.]

馮貴濤. 2016. 藍(lán)莓花青素提取、純化、成分鑒定及抗氧化活性的研究[D]. 貴陽(yáng)：貴州大學(xué). [Feng G T. 2016. Extraction，purification，component identification and antioxidant of blueberry anthocyanins[D]. Guiyang：Guizhou University.]

高璐，王瀅，饒勝其，楊振泉，黃阿根，胡博然. 2014. 葡萄籽原花青素提取物對(duì)衰老模型小鼠抗氧化作用[J]. 食品科學(xué)，35（23）：253-256. [Gao L，Wang Y，Rao S Q，Yang Z Q，Huang A G，Hu B R. 2014. Antioxidant activity of grape seed proanthocyanidin extract in aging mouse mo-del[J]. Food Science，35（23）：253-256.]

葛艷琳. 2018. 山葡萄皮花青素超聲波輔助提取及抗氧化活性研究[J]. 食品研究與開發(fā)，39（10）：48-55. [Ge Y L. 2018. Ultrasonic assisted extraction technology and its antioxidant activity of Vitis amurensis Rupr skin antho-cyanin[J]. Food Research and Development，39（10）：48-55.]

郭雅靖，顏夢(mèng)婷，林圣楠，楊雪娜，付才力，黃德建. 2017. 幾種原花青素的降血糖作用及與常見食品原料的結(jié)合研究[J]. 食品科學(xué)，38（19）：156-163. [Guo Y J，Yan M T，Lin S N，Yang X N，F(xiàn)u C L，Huang D J. 2017. Binding interaction of selected proanthocyanidins possessing hypoglycemic activity with common food raw materials[J]. Food Science，38（19）：156-163.]

劉學(xué)銘，黃小霞，廖森泰，楊榮玲，陳智毅，鄒宇曉. 2014. 3種富含花青素植物提取物抗氧化和降血脂活性比較研究[J]. 中國(guó)食品學(xué)報(bào)，14（1）：20-27. [Liu X M，Huang X X，Liao S T，Yang R L，Chen Z Y，Zou Y X. 2014. Antioxidant activities and hypolipidemic effects of three di-fferent anthocyanin-enriched extracts[J]. Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology，14（1）：20-27.]

孫建霞，張燕，胡小松，吳繼紅，廖小軍. 2008. 花青素的提取、分離以及純化方法研究進(jìn)展[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè)，34（8）：111-117. [Sun J X，Zhang Y， Hu X S，Wu J H，Liao X J. 2008. Review on the methods of extraction，isolation and purification of anthocyanins[J]. Food and Fermentation Industries，34（8）：111-117.]

謝榮源. 2014. 阿爾茨海默病藥物治療的研究進(jìn)展[J]. 常州大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），26（3）：56-63. [Xie R Y. 2014. Recent research progress on medical treatment for alzheimers disease[J]. Journal of Changzhou University（Natural Science Edition），26（3）：56-63.]

徐春明，龐高陽(yáng)，李婷. 2013. 花青素的生理活性研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)食品添加劑，（3）：205-210. [Xu C M，Pang G Y，Li T. 2013. Progress in the research on physiological activities of anthocyanin[J]. China Food Additives，（3）：205-210.]

楊慧，賈文婷，吳宏，吳洪斌，金新文. 2015. 超聲波輔助乙醇法浸提無(wú)核紫葡萄花青素工藝研究[J]. 中國(guó)釀造，34（5）：106-109. [Yang H，Jia W T，Wu H，Wu H B，Jin X W. 2015. Ultrasound-assisted ethanol extraction technology of anthocyanin from monukka grapes[J]. China Bre-wing，34（5）：106-109.]

楊雪娜. 2016. 不同來(lái)源原花青素的α-淀粉酶抑制活性及應(yīng)用研究[D]. 福州：福州大學(xué). [Yang X N. 2016. Sudies on the α-amylase inhibition activities and applications of proanthocyanidins from plants[D]. Fuzhou：Fuzhou University.]

張玲艷，王宏權(quán). 2014. 黑枸杞花青素的提取及其抗氧化活性研究[J]. 食品工業(yè)，35（12）：88-91. [Zhang L Y，Wang H Q. 2014. Extraction of anthocyanin from Lycium ruthenicum Murr and its antioxidation[J]. Food Industry，35（12）：88-91.]

Cassidy A，Mukamal K J，Liu L，F(xiàn)ranz M，Eliassen A H，Rimm E B. 2013. A high anthocyanin intake is associa-ted with a reduced risk of myocardial infarction in young and middle-aged women[J]. Circulation，127（2）：188-196.

Ellman G L，Courtney K D，Jr A V，F(xiàn)eatherstone R M. 1961. A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity[J]. Biochemical Pharmacology，7（2）：88-95.

Frenich A G，Aguilera-Luiz M M，Vidal J L M，Romero-González R. 2010. Comparison of several extraction techniques for multiclass analysis of veterinary drugs in eggs using ultra-high pressure liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Analytica Chimica Acta，661（2）：150-160.

Kharadze M，Japaridze I，Kalandia A，Vanidze M. 2018. Anthocyanins and antioxidant activity of red wines made from endemic grape varieties[J]. Annals of Agrarian Scien-ces，16（2）：181-184.

Kim D O，Jeong S W，Lee C Y. 2003. Antioxidant capacity of phenolic phytochemicals from various cultivars of plums[J]. Food Chemistry，81：321-326.

Marcia D S P，Kwon Y I，Apostolidis E，Lajolo F M，Genovese M I，Shetty K. 2009. Potential of Ginkgo biloba L. leaves in the management of hyperglycemia and hypertension using in vitro models[J]. Bioresource Technology，100（24）：6599-6609.

MohdMaidin N，Oruna-Concha M J，Jauregi P. 2018. Surfactant TWEEN20 provides stabilisation effect on anthocyanins extracted from red grape pomace[J]. Food Chemistry，271：224-231.

Wen Y，Chen H G，Zhou X，Deng Q F，Zhao Y，Zhao C，Gong X J. 2015. Optimization of the microwave-assisted extraction and antioxidant activities of anthocyanins from blackberry using a response surface methodology[J]. Rsc Advances. doi：10.1039/c4ra16396f.

Wen Y，Chen H G，Zhou X，Deng Q F，Zhao Y，Zhao C，Gong X J. 2016. A polyamide resin based method for adsorption of anthocyanins from blackberries[J]. New Journal of Chemistry，40（4）：3773-3780.