響應(yīng)面法優(yōu)化冰蘋(píng)果梨發(fā)酵酒工藝

孟祥敏，南海龍，丁鑫，郝建宇，薛海，文連奎

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130118）

蘋(píng)果梨為薔薇科（Rosaceae）梨屬果樹(shù)的果實(shí)[1]，為白梨（Pyrus bretschneideri Rehd）系統(tǒng)中優(yōu)質(zhì)品種之一，產(chǎn)于我國(guó)吉林省延邊朝鮮族自治州，果肉白色，脆嫩多汁，酸甜適口[2]。鮮梨果實(shí)中富含氨基酸、黃酮、碳水化合物、鈣、磷、鐵、胡蘿卜素、維生素 B1、維生素 B2、維生素PP、維生素C等多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。現(xiàn)代研究表明蘋(píng)果梨還具有潤(rùn)肺健脾、軟化血管、和胃止嘔止瀉、消痰止咳等保鍵功能[3-5]。

蘋(píng)果梨主要用于鮮食，因貯藏方式單一，貯藏量?jī)H占產(chǎn)量3%[2]。目前有關(guān)蘋(píng)果梨深加工的報(bào)道主要有蘋(píng)果梨酒、蘋(píng)果梨果凍、蘋(píng)果梨果醋、蘋(píng)果梨飲料、蘋(píng)果梨脆片[6-10]等。蘋(píng)果梨在加工過(guò)程中容易發(fā)生褐變，影響其風(fēng)味、色澤。因此，當(dāng)?shù)厝藗儗⑵淅鋬鰹楸婧笫秤茫粌H風(fēng)味獨(dú)特，而且易貯藏。本研究以冰蘋(píng)果梨為原料，研究其發(fā)酵酒工藝，為蘋(píng)果梨深加工產(chǎn)品開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 原料與輔料

蘋(píng)果梨：延邊地區(qū)；白砂糖（食品級(jí)）：吉林省鴻海有限公司；安琪葡萄酒高活性干酵母（食品級(jí)）：湖北安琪酵母有限公司；檸檬酸（食品級(jí)）：長(zhǎng)春健鷹食品添加劑公司。

1.1.2 藥品與試劑

氫氧化鈉、鹽酸、酚酞：天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；偏重亞硫酸鉀、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品：北京紅星化工廠；硫酸銅、次甲基藍(lán)等（分析純）：北京化工廠。

1.1.3 儀器與設(shè)備

電子分析天平（AUY220）：Shimadzu Philippines公司；生化培養(yǎng)箱（SPX-250B-Z）：上海市博訊事業(yè)有限公司；電熱恒溫水浴鍋（KW-1000DC）：金壇市科儀器有限公司；手持糖度計(jì)（WYT-4）：上海精密儀器儀表有限公司；酒精計(jì)：河間市儀器廠；pH計(jì)（PHS-3C）：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 冰蘋(píng)果梨發(fā)酵酒工藝流程

蘋(píng)果梨→冷凍→解凍→壓榨→加SO2抑菌→糖度調(diào)整→干酵母活化→發(fā)酵→過(guò)濾→陳釀→澄清→原酒

1.2.2 操作要點(diǎn)

蘋(píng)果梨：果實(shí)中等大小，完全成熟且無(wú)蟲(chóng)害潰爛。

冷凍：采取室外陰涼處分散放置自然冷凍，從11月中旬至次年2月中旬，期間平均最高氣溫為-5℃，最低氣溫為-18℃，平均溫差為13℃。

解凍：將蘋(píng)果梨切塊，在20℃下解凍30 min。

壓榨：半解凍狀態(tài)下壓榨，丟掉殘?jiān)捅?，留取含糖量較高的冰蘋(píng)果梨汁。

加SO2抑菌：加入50 mg/L的SO2。

調(diào)糖度：蘋(píng)果梨自身含糖量在9 g/L～10 g/L，半解凍壓榨后糖度為17 g/L～18 g/L，最終糖調(diào)整可溶性固形物為22 g/L。

干酵母活化：將酵母與2%的糖水以1∶10（質(zhì)量體積比）的比例混勻，在38℃的溫度下活化30 min，菌液活菌數(shù)約為8.2×107cfu/mL。

接種：按試驗(yàn)設(shè)計(jì)接種發(fā)酵。

發(fā)酵：將活化好的酵母菌加到調(diào)整好的蘋(píng)果梨汁中，留少量空氣提供酵母生長(zhǎng)，按試驗(yàn)設(shè)計(jì)的溫度和時(shí)間進(jìn)行發(fā)酵，前期適度攪拌，后期保持無(wú)氧發(fā)酵。

過(guò)濾：將發(fā)酵殘?jiān)?、沉淀物分離除去。

陳釀：在10℃～15℃下陳釀2個(gè)月。

澄清：12℃～15℃下放置6個(gè)月。

1.2.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以酒精度為指標(biāo)，研究發(fā)酵溫度、時(shí)間、pH值和酵母添加量對(duì)冰蘋(píng)果梨發(fā)酵酒發(fā)酵效果的影響，進(jìn)行單因素及響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

1.2.3.1 冰蘋(píng)果梨酒發(fā)酵單因素試驗(yàn)

發(fā)酵時(shí)間：pH值調(diào)至4.0，接入0.5 g/L的活性酵母，在 18 ℃下分別發(fā)酵 16、18、20、22、24 d，確定最佳發(fā)酵時(shí)間。

發(fā)酵溫度：pH值調(diào)至4.0，接入0.5 g/L的活性酵母，分別在 14、16、18、20、22 ℃的溫度下進(jìn)行發(fā)酵 22 d。

酵母添加量：pH值調(diào)至4.0，分別接入0.40、0.45、0.50、0.55、0.6g/L的活性酵母，在18℃下恒溫發(fā)酵22 d。

pH值：接入0.5 g/L的活性酵母，將pH值分別調(diào)至3.6、3.8、4.0、4.2、4.4，在 18℃下恒溫發(fā)酵 22 d。每組試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。1.2.3.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

根據(jù)單因素的試驗(yàn)結(jié)果，利用響應(yīng)面法選取發(fā)酵的pH值A(chǔ)（℃）、酵母菌接入量B（g/L）、發(fā)酵的溫度C為3個(gè)因素，以酒精度為響應(yīng)值，利用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)。

1.2.4 冰蘋(píng)果梨發(fā)酵酒的理化指標(biāo)

酒精度的測(cè)定：酒精計(jì)法；總糖、殘?zhí)堑臏y(cè)定：斐林試劑直接滴定法；總酸、揮發(fā)酸的測(cè)定：酸堿中和滴定法；干浸出物的測(cè)定：密度瓶法[11]；pH值的測(cè)定：pH計(jì)法；可溶性固形物的測(cè)定：手持糖度計(jì)法；總二氧化硫、游離二氧化硫的測(cè)定：直接碘量法。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)冰蘋(píng)果梨發(fā)酵酒的影響

發(fā)酵時(shí)間對(duì)冰蘋(píng)果梨發(fā)酵酒的影響見(jiàn)圖1。

由圖1可知，酒精度隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而增加到某一終點(diǎn)，由于發(fā)酵溫度較低導(dǎo)致發(fā)酵速度緩慢，在發(fā)酵第22天時(shí)酒精度達(dá)到最高且保持穩(wěn)定。因此發(fā)酵時(shí)間確定為22 d。

圖1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)冰蘋(píng)果梨發(fā)酵酒的影響Fig.1 Effects of fermentation time amount on ice-pingguoli pears pall fermented wine

2.1.2 發(fā)酵pH值對(duì)冰蘋(píng)果梨發(fā)酵酒的影響

發(fā)酵液的pH值直接影響著冰蘋(píng)果梨發(fā)酵酒的品質(zhì)，當(dāng)pH值過(guò)低時(shí)會(huì)抑制酵母菌的活性，且影響發(fā)酵速度，而當(dāng)pH值過(guò)高時(shí)，導(dǎo)致代謝酶系的活力降低[12]，pH值對(duì)冰蘋(píng)果梨發(fā)酵酒的影響見(jiàn)圖2。

圖2 pH值對(duì)冰蘋(píng)果梨發(fā)酵酒的影響Fig.2 Effects of pH on ice-pingguoli pears pall fermented wine

由圖2可知，當(dāng)pH值為3.8時(shí)，酵母代謝最旺盛，酒精度值達(dá)到最高，并隨著pH值增大而降低，故選取pH值3.6、3.8、4.0繼續(xù)進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

2.1.3 酵母添加量對(duì)冰蘋(píng)果梨發(fā)酵酒的影響

酒精是酵母菌利用糖發(fā)酵而產(chǎn)生的，酵母菌的添加量直接影響酒精度的變化，活性酵母菌的添加量對(duì)冰蘋(píng)果梨發(fā)酵酒的影響見(jiàn)圖3。

圖3 活性酵母菌的添加量對(duì)冰蘋(píng)果梨發(fā)酵酒的影響Fig.3 Effects of yeast addition amount on ice-pingguoli pears pall fermented wine

由圖3可知，當(dāng)酵母添加量為0.5 g/L時(shí)剛好能夠代謝完全，酒精度達(dá)到最高，當(dāng)添加量超過(guò)0.5 g/L時(shí)，酵母自身消耗的糖分及其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)增多，代謝的副產(chǎn)物也隨之增多，會(huì)使其活性過(guò)早衰退。而當(dāng)接種量過(guò)低時(shí)，糖分得不到充分轉(zhuǎn)化，影響酒體發(fā)酵，故選取接種量0.45、0.5、0.55 g/L進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

2.1.4 發(fā)酵溫度對(duì)冰蘋(píng)果梨發(fā)酵酒的影響

發(fā)酵溫度對(duì)冰蘋(píng)果梨發(fā)酵酒的影響也很大，考慮到冰蘋(píng)果梨香氣本身較淡，所以發(fā)酵溫度采用低溫，發(fā)酵溫度對(duì)冰蘋(píng)果梨發(fā)酵酒的影響見(jiàn)圖4。

圖4 發(fā)酵溫度對(duì)冰蘋(píng)果梨發(fā)酵酒的影響Fig.4 Effects of temperature on ice-pingguoli pears pall fermented wine

由圖4可知，發(fā)酵溫度低導(dǎo)致發(fā)酵速度緩慢[13]，但是當(dāng)溫度在20℃時(shí)，酒精度達(dá)到最高12.2%vol，溫度在18℃時(shí)，酒精度為11.9℃，為更多的保存原汁果香，故選取溫度值18、20、22℃進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析

2.2.1 回歸模型的建立及顯著性檢驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取發(fā)酵的pH值A(chǔ)（℃）、酵母菌接入量B（g/L）、發(fā)酵的溫度C為3個(gè)因素，以酒精度為響應(yīng)值通過(guò)Design Expert 8.0.6進(jìn)行三因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，確定最佳發(fā)酵工藝。響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表見(jiàn)表1，響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)數(shù)據(jù)見(jiàn)表2，回歸模型方差分析見(jiàn)表3[14-16]。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素和編碼水平Table 1 Factors and levels of response surface

表2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)數(shù)據(jù)Table 2 Experimental design and results of response surface

續(xù)表2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)數(shù)據(jù)Continue table 2 Experimental design and results of response surface

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Analysis of variance in regression model

利用Design Expert 8.0程序軟件對(duì)表2中的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸分析，對(duì)各因素回歸擬合后，得到酒精度對(duì)冰蘋(píng)果梨發(fā)酵 pH（A）、酵母添加量（B）、溫度（C）的二次多項(xiàng)回歸方程：

對(duì)回歸方程進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn)結(jié)果如表3可知，回歸項(xiàng)中P＜0.000 1，說(shuō)明所選模型差異極顯著。失擬項(xiàng)P=0.332 9＞0.05，即失擬項(xiàng)差異不顯著，表明該二次回歸模型能夠較顯著擬合冰蘋(píng)果梨發(fā)酵酒pH值、酵母添加量、溫度對(duì)酒精度的影響，該模型能夠代替試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.981 3，校正決定系數(shù)R2Adj（0.961 9＞0.80）且變異系數(shù)（CV）為1.31%，說(shuō)明該模型只有3.81%的變異不能由該模型解釋。說(shuō)明模型擬合優(yōu)度較好，可用來(lái)對(duì)酒精度的變化進(jìn)行解釋并對(duì)其進(jìn)行預(yù)測(cè)。當(dāng)P＜0.000 1時(shí)，說(shuō)明對(duì)應(yīng)的所對(duì)應(yīng)的試驗(yàn)條件對(duì)酒精度的影響是極顯著的；P＜0.05時(shí)，則對(duì)應(yīng)試驗(yàn)條件為顯著。由表3可得回歸方程系數(shù)的顯著性，酵母添加量（B）、pH值的二次項(xiàng)A、酵母添加量的二次項(xiàng)B對(duì)冰蘋(píng)果梨發(fā)酵酒的酒精度具有極顯著影響；溫度（C）、pH（A）和酵母添加量（B）的交互項(xiàng) AB、酵母添加量（B）和溫度（C）的交互項(xiàng)BC、溫度的二次項(xiàng)C對(duì)冰蘋(píng)果梨發(fā)酵酒的酒精度有顯著影響。

2.2.2 冰蘋(píng)果梨發(fā)酵酒酒精度的響應(yīng)面分析

利用Design Expert軟件，得到相應(yīng)的二次回歸方程的等高線及其響應(yīng)面圖。響應(yīng)面的曲面圖代表著兩個(gè)試驗(yàn)的交互作用，通過(guò)坡度的大小即可判斷因素對(duì)響應(yīng)值的影響程度。如圖5～圖7所示。根據(jù)模型所做的響應(yīng)曲面及其相應(yīng)的等高線圖可評(píng)估各因素對(duì)冰蘋(píng)果梨發(fā)酵酒酒精度的交互作用關(guān)系，其中酵母添加量對(duì)響應(yīng)值酒精度的影響最大，溫度次之，最后是pH值。

圖5 pH值和酵母添加量交互作用對(duì)酒精度的影響Fig.5 pH and yeast addition amount interactions on alcohol content

圖6 pH值和溫度交互作用對(duì)酒精度的影響Fig.6 pH and temperature interactions on alcohol content

圖7 酵母添加量和溫度交互作用對(duì)酒精的影響Fig.7 Yeast addition amount and temperature interactions on alcohol content

由圖5可知，當(dāng)溫度為18℃時(shí)，pH值在3.6～4.0、酵母添加量在0.45 g/L～0.55 g/L時(shí)，酒精度保持先升高后降低的趨勢(shì)，酵母添加量對(duì)酒精度作用顯著，發(fā)酵pH值對(duì)酒精度影響較小，pH值與酵母添加量交互作用顯著，當(dāng)pH值在3.8～3.9，酵母添加量在0.5 g/L～0.53 g/L時(shí)酶系活力增強(qiáng)，酵母菌生長(zhǎng)最旺盛，發(fā)酵效果最好，酒精度達(dá)到最高值。

由圖6可知，當(dāng)酵母添加量為0.5 g/L時(shí)，隨著pH值的增加和溫度的提升，酒精度也逐漸增加，發(fā)酵溫度對(duì)酒精度作用顯著，pH值在3.8～3.9、溫度在20℃～21℃時(shí)，發(fā)酵效果最佳，酒精度達(dá)到最高值，而隨著pH值的升高，酒精度下降。

由圖7可知，當(dāng)pH為3.8時(shí)，隨著酵母添加量的增加和溫度的提升，酒精度也逐漸增加，酵母添加量對(duì)酒精度的影響較大，此時(shí)糖分得到充分的轉(zhuǎn)化，酵母添加量在0.50 g/L～0.53 g/L時(shí)酒精度達(dá)到最高，溫度對(duì)酒精度影響也很大，在20℃～21℃時(shí)，發(fā)酵效果最佳，酒精度達(dá)到最高值。

最優(yōu)工藝條件的預(yù)測(cè)及驗(yàn)證運(yùn)用Design Expert 8.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行優(yōu)化預(yù)測(cè)，即對(duì)回歸方程取一階偏導(dǎo)數(shù)等于0，得到冰蘋(píng)果梨發(fā)酵酒的最佳發(fā)酵工藝為：溫度20.25℃，酵母添加量0.52 g/L，pH值3.79，在此條件下冰蘋(píng)果梨發(fā)酵酒的酒精度為12.385 9%vol。根據(jù)實(shí)際試驗(yàn)可操作性，將冰蘋(píng)果梨發(fā)酵酒加工工藝參數(shù)改為：溫度為20℃，酵母添加量為0.5 g/L，pH值為3.8。在此條件下對(duì)模型的預(yù)測(cè)參數(shù)進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到冰蘋(píng)果梨發(fā)酵酒酒精度為12.4%vol，與模型預(yù)測(cè)值較接近，表明采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化得到的冰蘋(píng)果梨發(fā)酵酒發(fā)酵工藝參數(shù)可靠。

2.2.3 冰蘋(píng)果梨發(fā)酵酒的理化指標(biāo)

經(jīng)對(duì)發(fā)酵后的冰蘋(píng)果梨酒的理化指標(biāo)分析，其酒精度 12.4%vol；總糖（以葡萄糖計(jì)）＜7 g/L；總酸（以檸檬酸計(jì)）3 g/L；揮發(fā)酸（以檸檬酸計(jì)）1 g/L；總二氧化硫＜250 mg/L；游離=氧化硫＜50 mg/L；干浸出物20.1 g/L。

2.2.4 冰蘋(píng)果梨發(fā)酵酒的感官指標(biāo)

冰蘋(píng)果酒體呈淺紅棕色，澄清、無(wú)懸浮物，有蘋(píng)果梨獨(dú)特的清爽香氣和酒香，入口醇厚，微酸爽口。

3 結(jié)論

通過(guò)單因素試驗(yàn)和中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)，采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化冰蘋(píng)果梨發(fā)酵酒的發(fā)酵工藝條件，建立冰蘋(píng)果梨酒發(fā)酵工藝的二次多項(xiàng)數(shù)學(xué)模型。該模型極顯著，擬合情況好，可用來(lái)預(yù)測(cè)設(shè)定條件范圍內(nèi)及其周?chē)谋O(píng)果梨發(fā)酵酒發(fā)酵工藝參數(shù)，有一定實(shí)用價(jià)值。各因素對(duì)冰蘋(píng)果梨發(fā)酵酒發(fā)酵工藝的影響次序?yàn)榻湍柑砑恿浚景l(fā)酵溫度＞pH值，優(yōu)化后工藝條件參數(shù)為溫度為20℃，酵母添加量為0.5 g/L，pH值為3.8，發(fā)酵時(shí)間為22 d，在此條件下酒精度為12.4%vol，發(fā)酵所得的冰蘋(píng)果梨發(fā)酵酒清香可口，具有獨(dú)特的冰蘋(píng)果梨風(fēng)味。