橡膠樹乳管細(xì)胞GPPS基因的克隆與表達(dá)分析

鄧小敏 于潔 陳瑩 晁金泉 張世鑫 田維敏

摘要：【目的】克隆橡膠樹乳管細(xì)胞短鏈異戊烯基合酶（GPPS）基因，分析其表達(dá)特性和編碼蛋白的相互作用，為解析該類基因在天然橡膠和萜類合成中的作用提供理論參考?！痉椒ā坎捎媚孓D(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）和cDNA末端快速克?。≧ACE）從橡膠樹乳管細(xì)胞膠乳中克隆GPPS基因（HbGPPS1和HbGPPS2），利用生物信息學(xué)分析其編碼蛋白的特性;采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測HbGPPS1和HbGPPS2在樹皮和膠乳中的組織表達(dá)特異性、在不同橡膠樹品系中的表達(dá)模式及其對割膠和外源茉莉酸甲酯（MeJA）處理的響應(yīng)模式，并在原核細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)分析;通過酵母雙雜交技術(shù)檢測HbGPPS1和HbGPPS2蛋白的相互作用關(guān)系。【結(jié)果】從橡膠樹乳管細(xì)胞乳膠中克隆獲得HbGPPS1和HbGPPS2基因，其中HbGPPS1基因編碼框長度為1248 bp，編碼415個氨基酸，蛋白分子量為45.9 kD，理論等電點為6.77;HbGPPS2基因編碼框長度為1239 bp，編碼412個氨基酸，蛋白分子量為45.6 kD，理論等電點為6.77。二者的核苷酸序列相似性為89%，且編碼蛋白均含有2個典型的異戊烯基轉(zhuǎn)移酶活性結(jié)構(gòu)域DDXXD（D），定位于葉綠體和線粒體。HbGPPS1蛋白自身及其與HbGPPS2蛋白均能形成較弱相互作用的二聚體。qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，HbGPPS1和HbGPPS2基因在膠乳中的表達(dá)量高于樹皮，但均以HbGPPS2基因表達(dá)量較高，表明二者表達(dá)存在組織特異性。經(jīng)MeJA處理后橡膠樹膠乳中HbGPPS1和HbGPPS2基因表達(dá)量較對照高，即外源MeJA可促進(jìn)內(nèi)源茉莉酸的合成，激活乳管細(xì)胞內(nèi)的茉莉酸信號從而上調(diào)HbGPPS1和HbGPPS2基因表達(dá)。在5個橡膠樹栽培品系中，HbGPPS2基因的表達(dá)量均明顯高于HbGPPS1基因，且與PR107、熱研7-20-59、RRIM600和熱研7-33-97干膠含量趨勢一致，但二者僅在熱研8-79和熱研7-33-97的表達(dá)模式存在差異。HbGPPS2基因能在大腸桿菌中成功表達(dá)。【結(jié)論】HbGPPS2基因可能是乳管細(xì)胞中參與天然橡膠和萜類合成的主效基因，而HbGPPS1基因可能是功能冗余基因。HbGPPS2和HbGPPS1基因在不同橡膠樹品系中的表達(dá)模式與各品系干膠含量呈正相關(guān)，可用作為干膠含量評估的篩選標(biāo)記。

關(guān)鍵詞： 橡膠樹;乳管細(xì)胞;短鏈異戊烯基合酶（GPPS）;基因克隆;表達(dá)水平;蛋白相互作用

中圖分類號： S794.1? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：2095-1191（2018）11-2117-12

Cloning and expression analysis of GPPS genes from the

laticifer cells of Hevea brasiliensis

DENG Xiao-min1， YU Jie2， CHEN Ying2， CHAO Jin-quan1，

ZHANG Shi-xin1， TIAN Wei-min1*

（1Rubber Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences/Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of Rubber Biology， Ministry of Agriculture and Rural Affairs/Hainan Key Laboratory for Cultivation and Physiology of Tropical Crops， Danzhou， Hainan? 571737， China; 2Institute of Tropical Agriculture and Forestry，

Hainan University， Danzhou，Hainan? 571737， China）

Abstract：【Objective】The short-chain isopentenyl synthase（GPPS） genes from the laticifer cells of Hevea brasiliensis were cloned and interaction between their expression patterns and encoding proteins were further analyzed in this study for dissecting the function of the GPPS genes in the biosynthesis of natural rubber and terpenoids. 【Method】Reverse transcription-PCR（RT-PCR） and rapid amplification of cDNA ends（RACE） methods were performed to clone the GPPS genes from the laticifer cells of H. brasiliensis. The character of GPPS genes encoding proteins were analyzed by bioinformatics. Moreover， real-time fluorescence quantitative PCR（qRT-PCR） was used to assess tissue-specific expression of GPPS genes from H. brasiliensis in the bark and latex and expression pattern of GPPS genes in different clones of H. brasiliensis. qRT-PCR was also used to detect response models of GPPS genes to tapping and exogenous methyl jasmonate（MeJA） treatment. And expression analysis of GPPS-encoding genes was done in prokaryotic cells. The protein interactions of HbGPPS1 and HbGPPS2 proteins were detected by using yeast two-hybrid technique. 【Result】Genes HbGPPS1 and HbGPPS2 were successfully cloned from the latex of laticifers cells in H. brasiliensis. HbGPPS1 gene harboured a coding frame of 1248 bp in length that encoded 415 amino acids with the protein molecular weight of 45.9 kD and the theo-retical isoelectric point（pI） of 6.77. While the gene HbGPPS2 harboured a coding frame of 1239 bp in length that enco-ded 412 amino acids with the protein molecular weight of 45.6 kD and the pI of 6.77. The similarity of their nucleotide sequence was up to 89%. The encoding proteins harbored two active prenyl transferase domain DDXXD（D） which were located in chloroplast and mitochondria. Protein interaction assay demonstrated that HbGPPS1 protein harbored relatively weak interaction with itself or with HbGPPS2 protein. Detection results of qRT-PCR revealed that both HbGPPS1 and HbGPPS2 had higher expression levels in latex than that in the bark， and the HbGPPS2 gene had higher expression levels than HbGPPS1 gene in both latex and bark，indicating their tissue-specific expression patterns. The expression levels of HbGPPS1 and HbGPPS2 genes after MeJA treatment were higher than control，suggesting that exogenous MeJA treatment could promote the biosynthesis of endogenous jasmonate acid and activate jasmonate acid signaling in laticifer cells， then up-regulate expression levels of HbGPPS1 and HbGPPS2 genes. Among the five H. brasiliensis cultivated clones，the relative expression level of HbGPPS2 gene was largely higher than that of HbGPPS1. And the expression levels of HbGPPS1 and HbGPPS2 genes were consistent with the dry rubber content tendency of PR107， CATAS7-20-59， RRIM600 and CATAS7-33-97， while showed little differences in expression pattern between CATAS8-79 and CATAS7-33-97. And HbGPPS2 gene was successfully expressed in Escherichia coli. 【Conclusion】HbGPPS2 gene may be the major gene in the biosynthesis of natural rubber and terpenoids in laticifer cells， while the HbGPPS1 gene may be the functionally redundant gene. The expression patterns of HbGPPS2 and HbGPPS1 genes show a positive correlation with the dry rubber content in different clones of H. brasiliensis， so they could be used as the selective molecular marks for evaluating the dry rubber content of H. brasiliensis.

Key words： Hevea brasiliensis; laticifer cells; short-chain isopentenyl synthase（GPPS）; gene cloning;expression level; protein interaction

0 引言

【研究意義】橡膠樹乳管細(xì)胞是天然橡膠的主要合成場所，由形成層紡錘狀原始細(xì)胞分化而成，不同乳管細(xì)胞相互連通形成橡膠樹網(wǎng)狀的特化組織，將其割破即可獲得膠乳用于提取天然橡膠（Hao and Wu，2000）。我國南方熱帶地區(qū)的植膠區(qū)為非傳統(tǒng)植膠區(qū)，天然橡膠產(chǎn)量無法滿足國內(nèi)市場需求，其原因是天然橡膠的合成與調(diào)控機理尚不清楚，制約了我國植膠區(qū)高產(chǎn)橡膠樹品種的選育（鞠巖峰等，2014）。據(jù)研究報道，天然橡膠是由橡膠樹乳管細(xì)胞中發(fā)生特異的類異戊二烯代謝而合成，即在橡膠樹乳管細(xì)胞中短鏈異戊烯基合酶（GPPS）能將1分子的異戊烯基焦磷酸（IPP）和二甲基丙烯基焦磷酸（DMAPP）催化合成1分子的牻牛兒基焦磷酸（GPP），進(jìn)而形成天然橡膠合成的起始化合物法尼基焦磷酸（FPP）（Cornish and Siler，1995;Chow et al.，2012）。因此，克隆橡膠樹乳管細(xì)胞GPPS基因，研究其編碼蛋白生物學(xué)信息及表達(dá)特性，對高產(chǎn)橡膠樹品種選育具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】GPPS廣泛存在于植物中，主要參與組織特異單萜和倍半萜物質(zhì)的合成。目前，已從擬南芥（Bouvier et al.，2000）、金魚草（Tholl et al.，2004）、葡萄（Martin et al.，2012）、長春花（Rai et al.，2013）、薄荷（于盱等，2013）、滇龍膽（王彩云等，2014）和雷公藤（屠李嬋等，2017）等植物中克隆獲得GPPS基因。大量研究證實，該基因參與調(diào)控薄荷醇（Burke et al.，1999）、黃酮（Bouvier et al.，2000）和單萜吲哚生物堿（Rai et al.，2013）等萜類物質(zhì)的合成，其調(diào)控機理受基因表達(dá)水平、蛋白翻譯水平、亞細(xì)胞器特異分布和蛋白聚合形式等影響（Burke et al.，1999;Bouvier et al.，2000;Wang and Dixon，2009;Rai et al.，2013）。GPPS分布在葉綠體、線粒體和過氧化物酶體等亞細(xì)胞器中，參與特異的生化過程（Bouvier et al.，2000;Wang and Dixon，2009;Rai et al.，2013）。在生化過程中，GPPS通過形成同源二聚體（同聚肽）或異源二聚體（雜聚肽）調(diào)控GPP的代謝方向（Rai et al.，2013），但不同植物存在差異，如擬南芥（Bouvier et al.，2000）、冷杉（Buke and Croteau，2002）和番茄（van Schie et al.，2007）等植物GPPS蛋白以同源二聚體形式發(fā)揮作用，而薄荷（Burke and Croteau，1999）、金魚草（Tholl et al.，2004）和啤酒花（Wang and Dixon，2009）的GPPS蛋白以雜聚肽形式發(fā)揮作用，長春花GPPS蛋白同時存在同聚肽（CrGPPS）和雜聚肽（CrGPPS.LSU和CrGPPS.SSU）的結(jié)構(gòu)，其中雜聚肽小亞基CrGPPS.SSU能結(jié)合大亞基CrGPPS.LSU并改變其對底物的親和力，進(jìn)而改變產(chǎn)物的合成途徑（Rai et al.，2013）?！颈狙芯壳腥朦c】雖然橡膠樹基因組測序已完成（Tang et al.，2016），為研究MVA和MEP代謝通路基因及其功能打下了基礎(chǔ)，但乳管細(xì)胞中天然橡膠的合成機理尚不清楚。由于天然橡膠合成的原料是IPP和DMAPP，與萜類物質(zhì)合成前體相同，而GPPS為膠乳中重要內(nèi)含物天然橡膠和角鯊烯的形成提供所需的GPP前體物，因此克隆橡膠樹乳管細(xì)胞GPPS基因，研究其表達(dá)水平變化與編碼蛋白間相互作用的性質(zhì)有助于解析其在天然橡膠和活性萜類合成機制。但至今鮮見有關(guān)系統(tǒng)研究橡膠樹乳管細(xì)胞的GPPS基因功能的文獻(xiàn)報道。【擬解決的關(guān)鍵問題】從橡膠樹乳管細(xì)胞的膠乳cDNA中克隆GPPS基因，對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測其在樹皮和膠乳中的組織表達(dá)特異性及不同橡膠樹品系中的表達(dá)模式，并分析其對割膠和外源茉莉酸甲酯（MeJA）處理的響應(yīng)模式及在原核細(xì)胞中的表達(dá)情況，檢測GPPS蛋白間的相互作用，為揭示橡膠樹GPPS基因在乳管細(xì)胞中天然橡膠和活性萜類物質(zhì)所需GPP前體合成的分子機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試橡膠樹品系為PR107、RRIM600、熱研7-20-59、熱研8-79和熱研7-33-97，均為我國植膠區(qū)的常規(guī)品種，種植于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗場，其中熱研7-33-97的基因組序列已測序完成。植物總RNA提取試劑盒和質(zhì)粒小量提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司;cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒和蛋白預(yù)染Marker購自Thermal Fisher scientific公司;DNA膠回收試劑盒和SYBR? Premix Ex Taq?熒光定量PCR試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司;大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞Trans1-T1和pEASY-Blunt克隆載體試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司;限制性內(nèi)切酶和T4 DNA連接酶購自NEB（北京）公司;IPTG和LB培養(yǎng)基購自生工生物工程（上海）股份有限公司;大腸桿菌BL21（DE3）由海南省熱帶作物栽培生理學(xué)重點實驗室保存提供。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 樣品處理及采集 分別采集10棵7年生成熟熱研7-33-97品系的未開割樹和新開割（割制陽刀1/2樹圍，4天一刀，即S/2 d/4）1年的樹皮和膠乳樣品，將每棵樹的膠乳樣品進(jìn)行等體積混合，每棵樹的樹皮樣品進(jìn)行等質(zhì)量混合（割膠面樹皮樣品在稱量之前先去掉外皮層附著的真菌、苔蘚層及內(nèi)層殘留的膠乳），用于檢測GPPS基因在樹皮和膠乳中的表達(dá)水平。

選取新開割的不同橡膠樹品系PR107、RRIM600、熱研7-20-59、熱研8-79和熱研7-33-97各10棵，用離心管收集每棵樹前5 min流出的膠乳樣品，置于冰上保存，再將各品系的10棵樹膠乳樣品進(jìn)行等體積混合，用于檢測GPPS基因在不同橡膠樹品系膠乳中的表達(dá)水平。

參照Zhang等（2015）的方法，利用0.07%茉莉酸甲酯（MeJA，3.19 mmol/L）處理熱研7-33-97的1年生萌條4、12和24 h，其中每個時間點處理10棵，然后采集膠乳進(jìn)行等體積混合。以未處理的熱研7-33-97的1年生萌條作為對照（CK）。

1. 2. 2 總RNA提取及cDNA合成 利用植物總RNA提取試劑盒分別提取樹皮和膠乳混合樣品總RNA，并利用cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。

1. 2. 3 引物設(shè)計及合成 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中的一個橡膠樹GPPS基因序列（GenBank登錄號XM_021798994），使用Primer Premier 5.0設(shè)計該基因的特異擴增引物，在膠乳cDNA模板中克隆該基因，命名為HbGPPS1基因。

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中的另一個GPPS基因?qū)?yīng)8個轉(zhuǎn)錄本，GenBank登錄號分別是XM_021820794、XM_021820787、XM_021820793、XM_021820792、XM_021820790、XM_021820788、XM_021820789和XM_021820776，由于這些轉(zhuǎn)錄本3'端不一致，因此難以確定該GPPS基因的編碼框序列。為從膠乳cDNA中克隆該基因編碼框序列全長，通過Primer Premier 5.0設(shè)計其3'RACE引物（表1），利用巢式PCR克隆其3'末端序列，具體方法參照SMARTTM RACE cDNA Amplication Kit（PT3269-1）說明。利用Primer Premier 5.0設(shè)計其引物以克隆編碼框序列全長，將克隆獲得的GPPS基因命名為HbGPPS2基因。最后，設(shè)計HbGPPS1基因和HbGPPS2基因的特異熒光定量引物（表1）檢測其相對表達(dá)量。引物委托英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成。

1. 2. 4 PCR擴增及測序分析 PCR反應(yīng)體系20.0 μL：2×PrimerSTAR Max Permix 10.0 μL，10 μmol/L正、反向基因擴增引物（HbGPPS1-F/HbGPPS1-R、HbGPPS2-F/HbGPPS2-R）各1.0 μL，cDNA模板1.0 μL，滅菌去離子水補足至20.0 μL。擴增程序：94 ℃預(yù)變性5 min;98 ℃ 10 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 2 min，進(jìn)行35個循環(huán)。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。切割目的條帶進(jìn)行膠回收純化，連接至pEASY-Blunt載體（25 ℃連接20 min）后轉(zhuǎn)化Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞，涂布在含50 mg/L氨芐青霉素的LA培養(yǎng)基上，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱進(jìn)行過夜培養(yǎng)。挑取培養(yǎng)基上的菌落進(jìn)行PCR驗證，將陽性克隆送至英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司測序。

1. 2. 5 實時熒光定量PCR檢測 利用實時熒光定量PCR檢測HbGPPS1和HbGPPS2基因在樹皮和膠乳中的相對表達(dá)量及其對割膠和茉莉酸的響應(yīng)模式（鄧小敏等，2016）。反應(yīng)體系10.0 μL：SYBR Premix Ex Taq II 5.0 μL，正、反向熒光定量PCR引物（qRT-HbGPPS1-F/qRT-HbGPPS1-R、qRT-HbGPPS2-F/qRT-HbGPPS2-R）各0.5 μL，cDNA模板1.0 μL，滅菌去離子水補足至10.0 μL。將其置于CFX384 Real-time PCR System上進(jìn)行擴增。擴增程序：95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃ 10 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s，進(jìn)行40個循環(huán)。以橡膠樹18S基因為內(nèi)參基因?；虻南鄬Ρ磉_(dá)量采用2-△△Ct法進(jìn)行計算

1. 2. 6 生物信息學(xué)分析 基于HbGPPS1和HbGPPS2基因的核苷酸序列推導(dǎo)其編碼蛋白的氨基酸序列，利用DNAMAN 2.0對二者的氨基酸序列進(jìn)行比對分析，并利用ClusterW 2.0和MEGA 5.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹以分析二者與其他植物GPPS蛋白的親緣關(guān)系。此外，使用SMART對HbGPPS1和HbGPPS2蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)域預(yù)測，采用TMHMM Server 2.0、WOLF PSORT和TargetP 1.1預(yù)測HbGPPS1和HbGPPS2蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域和亞細(xì)胞定位。

1. 2. 7 原核表達(dá)分析 分別利用pMAL-HbGPPS1-F/pMAL-HbGPPS1-R和pMAL-HbGPPS2-F/pMAL-HbGPPS2-R引物PCR擴增HbGPPS1和HbGPPS2基因的編碼框序列，PCR反應(yīng)體系和擴增程序與1.2.4相同，將目的片段分別連接至pEASY克隆載體并轉(zhuǎn)化Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞，具體方法同1.2.4。從測序正確的陽性菌中提取重組質(zhì)粒（pEASY-HbGPPS1和pEASY-HbGPPS2），用Nde I和EcoR I雙酶切pEASY-HbGPPS1和原核表達(dá)載體pMAL[攜帶麥芽糖結(jié)合蛋白（MBP）標(biāo)簽];同時用Sal I和EcoR I雙酶切pEASY-HbGPPS2和原核表達(dá)載體pMAL。切膠回收純化后用T4 DNA連接酶分別將HbGPPS1和HbGPPS2與原核表達(dá)載體pMAL連接，并轉(zhuǎn)化Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含50 mg/L氨芐青霉素的LA培養(yǎng)基上，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱進(jìn)行過夜培養(yǎng)。菌落PCR鑒定后送陽性克隆至英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司測序。

參照鄧小敏等（2017）的方法，以重組質(zhì)粒pMAL-HbGPPS1和pMAL-HbGPPS2轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3），經(jīng)菌落PCR鑒定陽性克隆后，挑取單克隆培養(yǎng)至OD600 nm為0.5后添加1 mmol/L IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)16 ℃誘導(dǎo)表達(dá)過夜后超聲破碎細(xì)胞，20000 r/min離心10 min，收集上清液和包涵體沉淀。利用SDS-PAGE檢測HbGPPS1-MBP和HbGPPS2-MBP重組蛋白的表達(dá)情況（Shi et al.，2016）。

1. 2. 8 蛋白相互作用分析 參照鄧小敏等（2018）的方法進(jìn)行酵母雙雜交試驗以檢測橡膠樹HbGPPS1與HbGPPS1蛋白間，HbGPPS1與HbGPPS2蛋白間及HbGPPS2與HbGPPS2蛋白間的相互作用關(guān)系。分別將克隆獲得的HbGPPS1和HbGPPS2基因編碼區(qū)序列連接至pGADT7和pGBKT7載體上，以構(gòu)建pGADT7-HbGPPS1、pGADT7-HbGPPS2、pGBKT7-HbGPPS1和pGBKT7-HbGPPS2酵母表達(dá)載體，具體構(gòu)建方法參照1.2.7。分別將pGADT7-HbGPPS1和pGBKT7空載體，pGADT7-HbGPPS2和pGBKT7空載體，pGBKT7-HbGPPS1和pGADT7空載體及pGBKT7-HbGPPS2和pGADT7空載體成對共轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞（王靖等，2016），轉(zhuǎn)化的酵母涂布在未加X-α-gal的二缺篩選培養(yǎng)基（SD/-Trp-Leu）和添加40 μg/mL X-α-gal的四缺篩選培養(yǎng)基（SD/-Ade-His-Trp-Leu）上，30 ℃培養(yǎng)7 d后拍照記錄。以pGBKT7-p53和pGADT7-SV40-T共轉(zhuǎn)化的酵母菌為陽性對照，以pGBKT7-Lam和pGADT7-SV40-T共轉(zhuǎn)化的酵母菌為陰性對照。四缺篩選培養(yǎng)基（SD/-Ade-His-Trp-Leu）上酵母菌的生長狀況和顯色程度可反映待檢測蛋白間相互作用的強弱。

1. 3 統(tǒng)計分析

采用Student檢驗方法分析HbGPPS1和HbGPPS2基因在不同組織、不同割膠處理或MeJA處理下相對表達(dá)量的差異顯著性。利用SPASS 17.0的Duncans檢驗分析HbGPPS1和HbGPPS2基因在橡膠樹不同品系中的表達(dá)水平差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2. 1 GPPS基因的PCR擴增結(jié)果

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中的一個橡膠樹GPPS基因（GenBank登錄號XM_021798994）設(shè)計特異性擴增引物，從基因組已測序的熱研7-33-97品系乳管細(xì)胞膠乳cDNA中克隆得到1519 bp的特異條帶，測序結(jié)果顯示，該基因編碼框長度為1248 bp，編碼415個氨基酸，蛋白分子量為45.9 kD，理論等電點為6.77，命名為HbGPPS1基因。

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中的另一個橡膠樹GPPS基因?qū)?yīng)到8個3'端存在差異的轉(zhuǎn)錄本，利用3'RACE引物從熱研7-33-97品系乳管細(xì)胞膠乳cDNA中克隆獲得其3'端序列，再根據(jù)5'端和3'端序列設(shè)計引物克隆其編碼框全長，結(jié)果顯示，該基因全長為1603 bp，包含一個完整的編碼框（1239 bp），編碼412個氨基酸，蛋白分子量為45.6 kD，理論等電點為6.77，命名為HbGPPS2基因，將其序列提交至NCBI數(shù)據(jù)庫，獲得新的GenBank登錄號MH636812（圖1）。序列比對分析結(jié)果表明，HbGPPS1和HbGPPS2基因的核苷酸序列相似性為89%。

2. 2 GPPS蛋白的生物信息學(xué)分析結(jié)果

由圖2可知，HbGPPS1和HbGPPS2蛋白的氨基酸序列相似性為92%。由圖3可知，HbGPPS1和HbGPPS2蛋白與同為大戟科的木薯（Manihot esculenta L.）、麻風(fēng)樹（Jatropha curcas L.）和蓖麻（Ricinus communis L.）GPPS蛋白同源性較高，其中HbGPPS1與MeGPPS1（XP_021608363.1）、MeGPPS2（XP_0216 08364.1）、JcGPPS1（XP_012072828.1）和RcGPPS1（XP_002530137.1）的同源性分別為95%、96%、91%和92%，但與菊科的橡膠草（Taraxacum kok-saghyz L.）TkGPPS1（AMB19718.1）同源性較低，為82%，與長春花（Catharanthus roseus L.）CrGPPS2（AGL91647.1）和CrGPPS.LSU（AGL91645.1）的同源性分別為84%和46%;HbGPPS2與MeGPPS1、MeGPPS2、JcGPPS1和RcGPPS1的同源性分別為89%、89%、87%和88%，與橡膠草TkGPPS1的同源性僅75%，而與CrGPPS2和CrGPPS.LSU的同源性分別為81%和49%。

結(jié)構(gòu)域預(yù)測結(jié)果顯示，HbGPPS1和HbGPPS2蛋白含有2個富含天冬氨酸（Asp，簡寫為D）的基序FARM（First aspartate-rich motif，DDXXDD）和SARM（Second aspartate-rich motif，DDXXD），是典型的異戊烯基轉(zhuǎn)移酶活性結(jié)構(gòu)域，主要負(fù)責(zé)底物結(jié)合和轉(zhuǎn)化（Bouvier et al.，2000;Rai et al.，2013）。

TMHMM預(yù)測結(jié)果顯示，HbGPPS1和HbGPPS2蛋白不含有跨膜螺旋結(jié)構(gòu)。WOLF PSORT預(yù)測結(jié)果顯示，HbGPPS1和HbGPPS2蛋白定位在葉綠體（定位系數(shù)chlo：8.0）和線粒體（定位系數(shù)mito：4）。TargetP 1.1預(yù)測結(jié)果顯示，HbGPPS1定位在線粒體和葉綠體，定位系數(shù)為0.868和0.110，可信等級為2級;而HbGPPS2定位在線粒體和葉綠體，定位系數(shù)為0.942和0.049，可信等級為1級。

2. 3 橡膠樹GPPS基因的表達(dá)分析結(jié)果

由圖4可知，HbGPPS1和HbGPPS2基因在膠乳中的表達(dá)量均極顯著高于在樹皮中的表達(dá)量（P<0.01，下同），且HbGPPS2基因在膠乳中的表達(dá)量高于HbGPPS1基因，但HbGPPS1基因在樹皮中的表達(dá)量高于HbGPPS2基因，說明二者的表達(dá)存在組織特異性。

由圖5可知，HbGPPS1和HbGPPS2基因在開割樹膠乳中的表達(dá)量顯著（P<0.05）或極顯著高于未開割樹膠乳，表明割膠處理能上調(diào)HbGPPS1和HbGPPS2基因的轉(zhuǎn)錄水平。

由圖6可知，MeJA處理12和24 h時橡膠樹膠乳中HbGPPS1基因和HbGPPS2基因表達(dá)量極顯著高于CK，但HbGPPS1基因的表達(dá)量在12 h達(dá)最高，HbGPPS2基因在24 h達(dá)最高，表明通過外施MeJA可激活內(nèi)源茉莉酸的合成，進(jìn)而激活乳管細(xì)胞內(nèi)的茉莉酸信號。

由圖7可知，HbGPPS1基因和HbGPPS2基因在PR107、RRIM600和熱研7-20-59、熱研8-79和熱研7-33-97膠乳中的表達(dá)水平存在明顯差異，HbGPPS1基因的表達(dá)量排序為PR107>熱研7-20-59>RRIM600>熱研8-79>熱研7-33-97。HbGPPS2基因的表達(dá)量排序為PR107 >熱研7-20-59>RRIM600>熱研7-33-97>熱研8-79，表明HbGPPS1和HbGPPS2基因在熱研8-79和熱研7-33-97的表達(dá)模式存在差異，在其他3個品系中表達(dá)模式一致。在5個橡膠樹栽培品系中，HbGPPS2基因的表達(dá)量均高于HbGPPS1基因，表明HbGPPS2基因可能是參與異戊二烯代謝途徑的主效基因，而HbGPPS1基因可能為功能冗余基因。

2. 4 GPPS基因的原核表達(dá)分析結(jié)果

將構(gòu)建的pMAL-HbGPPS1和pMAL-HbGPPS2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化原核表達(dá)菌株BL21（DE3）后進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，蛋白表達(dá)情況用SDS-PAGE進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖8所示。由于MBP標(biāo)簽蛋白約48.0 kD，HbGPPS1和HbGPPS2蛋白約46.0 kD，因此，重組蛋白HbGPPS1-MBP和HbGPPS2-MBP約94.0 kD。在上清液和包涵體沉淀均檢測到重組蛋白，其中紅色箭頭表示HbGPPS1-MBP重組蛋白條帶（圖8-A），綠色箭頭表示HbGPPS2-MBP重組蛋白條帶（圖8-B），說明HbGPPS1和HbGPPS2蛋白在原核細(xì)胞中成功表達(dá)。

2. 5 GPPS蛋白的相互作用分析結(jié)果

GPPS蛋白能通過形成不同的同源或異源二聚體來行使生物學(xué)功能（Rai et al.，2013）。本研究通過酵母雙雜交試驗檢測HbGPPS1和HbGPPS2能否形成同源或異源二聚體，結(jié)果如圖9所示。pGADT7-HbGPPS1和pGBKT7共轉(zhuǎn)化的酵母菌、 pGBKT7-HbGPPS1和pGADT7共轉(zhuǎn)化的酵母菌、pGADT7-HbGPPS2和pGBKT7共轉(zhuǎn)化的酵母菌及pGBKT7-HbGPPS2和pGADT7共轉(zhuǎn)化的酵母菌均能在SD/-Trp-Leu培養(yǎng)基上生長，但不能在SD/-Ade-His-Trp-Leu培養(yǎng)基（含X-α-gal）上生長，表明HbGPPS1和HbGPPS2本身不具有激活報告基因表達(dá)的活性。

pGADT7-HbGPPS1和pGBKT7-HbGPPS1共轉(zhuǎn)化的酵母菌、pGADT7-HbGPPS1和pGBKT7-HbGPPS2共轉(zhuǎn)化的酵母菌，pGADT7-HbGPPS2和pGBKT7-HbGPPS2共轉(zhuǎn)化的酵母菌及陽性對照（pGADT7-SV40-T和pGBKT7-p53共轉(zhuǎn)化的酵母菌）和陰性對照（pGADT7-SV40和pGBKT7-Lam共轉(zhuǎn)化的酵母菌）均能在SD/-Trp-Leu培養(yǎng)基上生長，但僅pGADT7-HbGPPS1和pGBKT7-HbGPPS1共轉(zhuǎn)化的酵母，pGADT7-HbGPPS1和pGBKT7-HbGPPS2共轉(zhuǎn)化的酵母菌及陽性對照能不同程度地在SD/-Ade-His-Trp-Leu培養(yǎng)基（含X-α-gal）上生長并顯色，而pGADT7-HbGPPS2和pGBKT7-HbGPPS2共轉(zhuǎn)化的酵母菌和陰性對照無法在SD/-Ade-His-Trp-Leu培養(yǎng)基（含X-α-gal）上生長并顯色，表明HbGPPS1自身及其與HbGPPS2蛋白均能形成較弱相互作用的二聚體，而HbGPPS2蛋白自身不能形成二聚體。

3 討論

橡膠樹的乳管細(xì)胞是能夠特異合成順式天然高分子橡膠的特化組織細(xì)胞，其內(nèi)含物膠乳中含有大量的高分子天然橡膠和角鯊烯、γ-谷甾醇、β-豆甾醇、τ-杜松醇和（Z）-合金歡醇等小分子活性萜類物質(zhì)，這些物質(zhì)的合成均依賴于GPP前體的供應(yīng)（Hao and Wu，2000;梅志剛等，2011），而GPP在GPPS催化作用下合成，即GPPS基因成為研究熱點。目前，已從模式植物和非模式植物中克隆獲得GPPS基因（Bouvier et al.，2000;于盱等，2013;Rai et al.，2013;王彩云等，2014;屠李嬋等，2017）。本研究發(fā)現(xiàn)，HbGPPS1和HbGPPS2蛋白與大戟科木薯、麻風(fēng)樹和蓖麻GPPS蛋白的同源性較高，親緣關(guān)系較近，與橡膠草TkGPPS1和長春花CrGPPS2同源性亦較高，推測其具有相似功能。據(jù)前人研究報道，很多植物GPPS含有典型的異戊烯基轉(zhuǎn)移酶活性結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域含有2個富含Asp的基序FARM（DDXXDD）和SARM（DDXXD）（Rai et al.，2013），推測HbGPPS1和HbGPPS2蛋白具有異戊烯基轉(zhuǎn)移酶活性，屬于植物GPPS家族成員。已有研究表明，GPPS具有多細(xì)胞器分布的特性，其在線粒體、葉綠體、過氧化物酶體和胞質(zhì)中均有分布（Bouvier et al.，2000;Rai et al.，2013）。本研究亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示，HbGPPS1和HbGPPS2蛋白定位在葉綠體和線粒體，與擬南芥（Bouvier et al.，2000）和長春花（Rai et al.，2013）的GPPS亞細(xì)胞定位結(jié)果相同。但該預(yù)測結(jié)果未揭示GPPS是否能定位在橡膠粒子上，可能是由于WOLF PSORT和TargetP 1.1中缺乏橡膠粒子等特化亞細(xì)胞器的定位數(shù)據(jù)，因此，該預(yù)測結(jié)果仍需進(jìn)一步驗證。此外，本研究通過酵母雙雜交試驗發(fā)現(xiàn)，HbGPPS1自身及其與HbGPPS2間能形成較弱相互作用的二聚體，與其他植物的GPPS形成的二聚體類似（Bouvier et al.，2000;Buke and Croteau，2002;van Schie et al.，2007;Rai et al.，2013），表明橡膠樹HbGPPS1和HbGPPS2可能在蛋白質(zhì)水平上相互調(diào)控，但具體調(diào)控機制仍需進(jìn)一步研究。

本研究qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，HbGPPS1和HbGPPS2基因在樹皮和膠乳中高豐度差異性表達(dá)，說明HbGPPS1和HbGPPS2基因的功能被精細(xì)調(diào)控，可能與其在膠乳和樹皮中參與調(diào)控GPP合成的功能相適應(yīng)。橡膠樹乳管細(xì)胞被割破后釋放部分膠乳，促進(jìn)其內(nèi)含物天然橡膠和萜類等活性物質(zhì)的重新合成，在該再生過程中，HbGPPS1和HbGPPS2基因在開割樹膠乳中的表達(dá)量較未開割樹高，說明HbGPPS1和HbGPPS2基因的上調(diào)表達(dá)有助于促進(jìn)天然橡膠與萜類物質(zhì)的合成。據(jù)文獻(xiàn)報道，割膠可激活乳管細(xì)胞內(nèi)源茉莉酸信號從而促進(jìn)天然橡膠生物合成（Deng et al.，2018）。本研究發(fā)現(xiàn)，橡膠樹1年生萌條被MeJA處理后，HbGPPS1和HbGPPS2基因呈上調(diào)表達(dá)，表明外源MeJA可促進(jìn)內(nèi)源茉莉酸的合成，激活乳管細(xì)胞內(nèi)的茉莉酸信號從而上調(diào)HbGPPS1和HbGPPS2基因表達(dá)，促進(jìn)內(nèi)源茉莉酸的合成。雖然乳管細(xì)胞茉莉酸信號組分COI1-JAZ3-MYC2已被分離鑒定（Deng et al.，2018），但HbGPPS1和HbGPPS2基因是否是該組分的直接靶標(biāo)有待進(jìn)一步驗證。

已有研究表明，不同橡膠樹品系間存在明顯的生理差異，在正常割膠條件下（未進(jìn)行乙烯利刺激），不同橡膠樹品系干膠含量依次為：PR107>熱研7-20-59>RRIM600>熱研7-33-97（魏芳和?，F(xiàn)周，2008;吳明等，2013）。本研究發(fā)現(xiàn)，不同品系的HbGPPS2基因表達(dá)水平排序為：PR107>熱研7-20-59>RRIM600>熱研7-33-97>熱研8-79，與黃德寶等（2010）的研究結(jié)論即熱研7-33-97的總固形物含量（包括大量干膠和少量固形物質(zhì)）高于熱研8-79相對應(yīng)，說明HbGPPS2基因的表達(dá)水平可能與干膠含量正相關(guān)。本研究還發(fā)現(xiàn)，不同品系膠乳中的HbGPPS2基因表達(dá)量顯著高于HbGPPS1基因，說明HbGPPS2基因可能是參與GPP合成的主效基因，而HbGPPS1基因可能是參與GPP合成的功能冗余基因?，F(xiàn)實生產(chǎn)中，橡膠總產(chǎn)量不僅與品系的干膠含量相關(guān)，還與其排膠量相關(guān)，雖然HbGPPS1和HbGPPS2基因在PR107中的表達(dá)量最高，但PR107的排膠量較低，橡膠總產(chǎn)量低于其他品系。熱研7-33-97的干膠含量低于PR107，但其排膠量高于PR107，最終導(dǎo)致橡膠產(chǎn)量高于PR107。因此，HbGPPS2和HbGPPS1基因若用作橡膠樹早期橡膠產(chǎn)量評價的分子標(biāo)記，其表達(dá)量的高低只可能與橡膠干膠含量相關(guān)，用于橡膠產(chǎn)量評價時還需綜合考慮特定品種的排膠量特性。

4 結(jié)論

橡膠樹HbGPPS2基因可能是乳管細(xì)胞中參與天然橡膠和萜類合成的主效基因，而HbGPPS1可能是功能冗余基因。HbGPPS2基因可用作不同橡膠樹品系干膠含量評價的篩選標(biāo)記。

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