尼羅羅非魚CRTC2基因克隆及其表達規(guī)律分析

鐘藝文 褚武英 許友卿 丁兆坤 張建社 李玉瓏 成嘉 陳亨德 安曉玲 王利香

摘要：【目的】掌握尼羅羅非魚活化環(huán)磷酸腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄共激活因子2（CRTC2）基因的表達變化規(guī)律，并探究饑餓對其表達的影響，為研究尼羅羅非魚CRTC2基因功能打下基礎(chǔ)?！痉椒ā坎捎肦ACE-PCR從尼羅羅非魚肌肉組織中克隆CRTC2基因，對其進行生物信息學(xué)分析，并采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）分析不同組織/器官中CRTC2基因的表達量?！窘Y(jié)果】尼羅羅非魚CRTC2基因全長6927 bp，其開放閱讀框（ORF）2388 bp，5'端非編碼區(qū)（5'UTR）343 bp，3'端非編碼區(qū)（3'UTR）4196 bp，編碼795個氨基酸，具有保守的CORC-N、CORC-M和CORC-C結(jié)構(gòu)域。由基于CRTC2氨基酸序列同源性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進化樹可知，尼羅羅非魚與紅鰭東方鲀的親緣關(guān)系最近。尼羅羅非魚的白肌、紅肌、心臟、脾臟、肝臟、腎臟、腦組織和腸道等8個不同組織/器官中均有CRTC2基因表達，但以腦組織和白肌中的表達量較高;與正常投喂的尼羅羅非魚相比，饑餓7 d的尼羅羅非魚白肌CRTC2基因表達無顯著變化（P>0.05），但饑餓15 d后CRTC2基因表達顯著上調(diào)（P<0.05）?！窘Y(jié)論】尼羅羅非魚各組織/器官中CRTC2基因的表達具有一定規(guī)律性，長期饑餓會影響CRTC2基因表達，即CRTC2可能與糖代謝密切相關(guān)，直接或間接影響尼羅羅非魚的能量吸收和代謝。因此，尼羅羅非魚CRTC2基因可作為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控糖代謝的候選基因。

關(guān)鍵詞： 尼羅羅非魚;CRTC2 基因;表達規(guī)律;饑餓;糖代謝

中圖分類號： S965.125? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標(biāo)志碼： A 文章編號：2095-1191（2018）12-2539-06

Cloning and expression features of CRTC2 gene in Nile tilapia

ZHONG Yi-wen1， CHU Wu-ying2， XU You-qing1*， DING Zhao-kun1*， ZHANG Jian-she2， LI Yu-long2， CHENG Jia2， CHEN Heng-de1， AN Xiao-ling1， WANG Li-xiang1

（1Institute for Fishery Sciences， Guangxi University， Nanning? 530004， China; 2Changsha University，

Changsha? 410000， China）

Abstract：【Objective】The purpose of this study was to clone cyclic adenosine monophosphate responsive element-binding protein regulated transcription coactivator 2（CRTC2） gene from Nile tilapia and analyze its variation regulation. And effects of starvation on the gene expression were also studied to provide references for studying CRTC2 gene function in Nile tilapia. 【Method】The RACE-PCR technique was used to clone the CRTC2 gene from Nile tilapia muscle tissue， and bioinformatics analysis was conducted. The expression of CRTC2 gene in Nile tilapia tissues was analyzed by real-time fluorescent quantitative PCR（qRT-PCR） technique. 【Result】The full-length of CRTC2 gene of Nile tilapia was 6927 bp. Its open reading frame（ORF） region was 2388 bp， encoding 795 amino acids， 5' noncoding region（UTR） 343 bp and 3' UTR 4196 bp. It contained conserved CORC-N， CORC-M and CORC-C domains. Phylogenetic tree analysis based on CRTC2 amino acid sequence homology showed that the relationship between Nile tilapia and red fin oriental oyster was the closest. CRTC2 gene was expressed in the white muscle， red muscle， heart， spleen， liver， kidney， brain and intestine of Nile tilapia， and the expression level was the highest in brain and white muscle. There was no significant difference in the expression of white muscle CRTC2 gene in 7 d of starvation group compared with non-starved group（P>0.05）. The expression of CRTC2 gene of white muscle increased significantly after starvation for 15 d（P<0.05）. 【Conclusion】 The expression of CRTC2 gene in all tissues/organs of Nile tilapia has? certain regularity. Long-term starvation treatment can affect the expression of CRTC2 gene， indicating that CRTC2 may be closely related to glucose metabolism， directly or indirectly affecting the Nile Tilapia energy absorption and metabolism. Therefore，the CRTC2 gene of Nile tilapia can be used as one of the candidate genes for signal transduction regulation of glucose metabolism.

Key words： Nile tilapia; CRTC2 gene; expression regularity; starvation; glucose metabolism

0 引言

【研究意義】活化環(huán)磷酸腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄共激活因子（CRTCs）是2003年利用基因組高通量篩選技術(shù)發(fā)現(xiàn)的一個調(diào)節(jié)環(huán)磷酸腺苷應(yīng)答元件結(jié)合蛋白（CREB）轉(zhuǎn)錄因子活性的真核蛋白家族（Iourgenko et al.，2003），高度保守的卷曲—螺旋結(jié)構(gòu)域是CRTCs家族的結(jié)構(gòu)特征，能與CREB的堿性亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域（bZIP）相結(jié)合，從而增加CREB的活性（Conkright et al.，2003）。哺乳動物CRTCs家族基因由CRTC1、CRTC2和CRTC3組成，其中，CRTC1基因主要存在于小鼠的腦組織中，CRTC2和CRTC3基因在多個組織中普遍分布（徐懷超，2016）。CRTC2是CREB的轉(zhuǎn)錄共激活因子，也是cAMP應(yīng)答中糖異生基因表達的中樞調(diào)控因子（Cheng and Saltiel，2006）。羅非魚是我國的主要養(yǎng)殖水產(chǎn)品，蛋白質(zhì)含量高，且富含人體所需的8種必需氨基酸，尤其是谷氨酸和甘氨酸含量特別高（郝淑賢等，2006;郝志明等，2006），但有關(guān)羅非魚糖代謝的分子途徑尚未清楚，因此明確CRTC2基因在羅非魚組織/器官中的表達規(guī)律，可為研究羅非魚糖代謝的分子機制提供參考依據(jù)?！厩叭搜芯窟M展】CRTC2是調(diào)節(jié)糖異生相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵因子，在小鼠肌肉組織中的表達量最高，而在肝臟組織中的表達量最低（徐懷超，2016）。在饑餓狀態(tài)下，CRTC2基因去磷酸化能促進小鼠空腹葡萄糖的生成;但恢復(fù)喂食后其磷酸化加速糖異生的發(fā)生，說明CRTC2在小鼠葡萄糖穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用（Koo et al.，2005）。CRTC2是空腹與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的雙傳感器，通過防止肝糖原異生過度增加，而有效預(yù)防肥胖癥的慢性高血糖癥發(fā)生（Wang et al.，2009）;敲除CRTC2基因的小鼠經(jīng)饑餓處理后有效降低了循環(huán)血糖濃度，進而提高喂食導(dǎo)致肥胖的胰島素敏感性（Wang et al.，2010）。說明CRTC2基因不僅在甘油三酯動態(tài)平衡中發(fā)揮作用，還是空腹葡萄糖代謝的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑（Saberi et al.，2009;Han et al.，2015）。韓錦鉑等（2015）研究證實，CRTC2介導(dǎo)mTOR調(diào)控且依賴于COPII復(fù)合物的固醇調(diào)控元件結(jié)合蛋白1（SREBP1）的成熟，揭示了CRTC2介導(dǎo)的信號通路在調(diào)控肝臟脂肪代謝過程中的重要作用。此外，Epstein-Barr病毒通過CRTC2與BZLF1蛋白間的相互作用而從潛伏期重新激活（Murata et al.，2009），表明CRTC2有望開發(fā)成病毒的激活劑?！颈狙芯壳腥朦c】目前，有關(guān)CRTC2基因的研究主要集中在人類和小鼠上，在魚類中鮮有報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】采用RACE-PCR從尼羅羅非魚肌肉組織中克隆CRTC2基因，對其進行生物信息學(xué)分析;采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）分析不同組織/器官中CRTC2基因的表達量，掌握CRTC2基因的表達變化規(guī)律，并探究饑餓對CRTC2基因表達的影響，以期為研究尼羅羅非魚CRTC2基因功能打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

成年尼羅羅非魚由湖南省水產(chǎn)科學(xué)研究所提供，共18尾，規(guī)格500±10 g/尾。每尾魚均采集白肌、紅肌、心臟、脾臟、肝臟、腎臟、腦組織和腸道等8個樣品，采集后立即放入液氮中迅速冷凍，-80 ℃保存?zhèn)溆?。Oligotex mRNA提取試劑盒購自QIAGEN公司，瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒購自O(shè)MEGA公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒及DNA酶試劑盒購自Fermentas公司，pMD19-T載體、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞及LA Taq@購自TaKaRa公司。

1. 2 尼羅羅非魚CRTC2基因克隆

1. 2. 1 提取總RNA及反轉(zhuǎn)錄 肌肉總RNA采用Trizol試劑進行提取，利用超微量紫外分光光度計測定OD，再以1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測其濃度和純度?？俁NA樣品的OD260/OD280在1.8～2.0時，使用Oligotex mRNA提取試劑盒分離純化mRNA，然后以獲得的mRNA為模板，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒Super Script?Ⅱ-RT合成cDNA第一鏈。

1. 2. 2 引物設(shè)計與合成 從GenBank下載與尼羅羅非魚親緣關(guān)系最近的紅鰭東方鲀CRTC2基因全序列，與本課題組前期克隆獲得的CRTC2部分基因序列進行保守性分析，采用Primer Premer 5.0在其保守性較高的區(qū)域設(shè)計CRTC2基因的3'端和5'端克隆引物及通用引物（表1）。所有引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1. 2. 3 CRTC2基因片段克隆與測序分析 以cDNA為模板進行RACE-PCR擴增（趙獻芝等，2009），擴增產(chǎn)物采用1.2%瓊脂糖凝膠電泳進行濃度和純度分析，然后與pMD19-T載體連接過夜后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，先37 ℃正置培養(yǎng)1 h再倒置培養(yǎng)過夜，挑取白色菌斑進行培養(yǎng)液擴大培養(yǎng)，以1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測是否成功插入目的片段。獲得的目的產(chǎn)物送至鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司測序，測序結(jié)果進行BLAST比對分析，待全部目的基因片段確定后，將所有基因片段序列拼接在一起即得到目的基因。

1. 2. 4 CRTC2基因生物信息學(xué)分析 利用DNAMAN對克隆獲得的CRTC2基因序列進行氨基酸推導(dǎo)和核苷酸序列分析，使用ProtParam推測其蛋白質(zhì)的理論等電點、分子量及氨基酸組成，運用PROSITE進行蛋白功能區(qū)預(yù)測，同時采用ClustalW進行氨基酸序列比對分析，以MEGA 7.0構(gòu)建基于氨基酸序列同源性的系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

1. 3 尼羅羅非魚CRTC2基因表達規(guī)律分析

1. 3. 1 不同組織/器官總RNA提取及cDNA第一鏈合成 采用Trizol試劑提取正常投喂（對照組）尼羅羅非魚白肌、紅肌、心臟、脾臟、肝臟、腎臟、腦組織和腸道的總RNA及饑餓7和15 d后的白肌總RNA，測定其OD，同時采用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測其濃度和純度。cDNA單鏈由加入poly（T）引物和Super Script Ⅱ陰性逆轉(zhuǎn)錄酶的反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成。

1. 3. 2 引物設(shè)計與合成 依據(jù)測序獲得的目的基因開放閱讀框（ORF）序列，設(shè)計CRTC2基因的qRT-PCR引物，以β-actin內(nèi)參基因為管家基因，所有引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1. 3. 3 qRT-PCR 選用SYBR GreenⅠ染料法，在qRT-PCR儀上進行擴增分析。以最高熒光值及最小Ct為標(biāo)準(zhǔn)，分別優(yōu)化引物濃度、退火溫度和循環(huán)條件。反應(yīng)體系25.0 μL：SYBR? Premix Ex TaqTM 12.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，cDNA模板2.0 μL，以ddH2O補足至25.0 μL。擴增程序：95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃ 5 s，58 ℃ 30 s，進行40次循環(huán);72 ℃延伸15 s。同時繪制熔解曲線：設(shè)65～95 ℃，每隔0.05 ℃讀1次板;反應(yīng)結(jié)束后對試驗結(jié)果進行觀察及數(shù)據(jù)處理分析。

1. 3. 4 數(shù)據(jù)處理 依據(jù)內(nèi)參基因及目的基因的Ct，利用2?△△Ct計算目的基因的相對表達量（Livak and Schmittgen，2001）?；虮磉_豐度采用SPSS 17.0進行單因素方差分析（One-way ANOVA），并利用最小顯著差數(shù)法（LSD）進行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2. 1 尼羅羅非魚CRTC2基因序列分析結(jié)果

將CRTC2基因的3'端、5'端及編碼區(qū)重疊區(qū)域間拼接即獲得目的基因全長序列。測序結(jié)果表明，CRTC2基因全長6927 bp，GenBank登錄號為MH279546，包括ORF 2388 bp，5'端非編碼區(qū)（5'UTR）343 bp，3'端非編碼區(qū)（3'UTR）4196 bp，編碼795個氨基酸，分子量約84.69 kD，理論等電點6.86。使用http：//www.molbiol-tools.ca/Motifs.htm分析其結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn)CRTC2基因具有保守的CORC-N、CORC-M和CORC-C結(jié)構(gòu)域（圖1）。

2. 2 氨基酸序列比對及系統(tǒng)發(fā)育進化樹分析結(jié)果

參照物種的CRTC2基因序列（表2）在NCBI中搜索，使用BioEdit比對分析CRTC2氨基酸序列的同源性，再以MEGA 7.0構(gòu)建基于CRTC2氨基酸序列同源性的系統(tǒng)發(fā)育進化樹（圖2），結(jié)果顯示，尼羅羅非魚與紅鰭東方鲀（Takifugu rubripes）聚在同一分支上，表明二者的親緣關(guān)系最近;然后與其他大部分魚類構(gòu)成一個大的分支，爬行綱、鳥綱和哺乳綱等物種則形成另一個分支，可能是在進化過程不同物種所含的氨基酸數(shù)目差異化所致。

2. 3 不同組織/器官中CRTC2基因表達分析結(jié)果

采用qRT-PCR檢測分析尼羅羅非魚白肌、紅肌、心臟、脾臟、肝臟、腎臟、腦組織和腸道中CRTC2基因mRNA的表達情況，結(jié)果表明，CRTC2基因在腦組織中的表達最高（圖3），在白肌、腸道、脾臟、紅肌和心臟組織也有較高的表達，但在肝臟和腎臟等組織的表達相對較弱，顯著低于在腦組織和白肌中的表達量（P<0.05，下同），說明CRTC2基因在尼羅羅非魚的各組織/器官中均有表達，且有可能參與調(diào)節(jié)其攝食機能。

2. 4 饑餓脅迫對尼羅羅非魚白肌CRTC2基因表達的影響

采用qRT-PCR檢測分析正常投喂及饑餓7和15 d后尼羅羅非魚白肌中CRTC2基因mRNA的表達情況，結(jié)果（圖4）表明，與正常投喂的尼羅羅非魚相比，饑餓7 d的尼羅羅非魚白肌CRTC2基因表達無顯著變化（P>0.05），但饑餓15 d后CRTC2基因mRNA的表達顯著上調(diào)，因此推測CRTC2基因參與調(diào)節(jié)尼羅羅非魚的能量代謝。

3 討論

CRTC2在哺乳動物中的研究較多，尤其在人類和小鼠中。有關(guān)小鼠的研究主要探討CRTC2是否與糖代謝和脂肪代謝等生理功能有關(guān)（Dentin et al.，2008;Altarejos and Montminy，2011;Sun et al.，2015）。李慧閣和傅力（2016）研究認為，CRTC2基因是小鼠空腹饑餓狀態(tài)下血糖代謝的調(diào)控因子。而在針對人類的相關(guān)研究中，主要探析CRTC2基因與癌癥的關(guān)系（張雅雅等，2010;Han et al.，2014;Li et al.，2017）。本研究采用RACE結(jié)合常規(guī)PCR克隆獲得尼羅羅非魚CRTC2基因的全長序列為6927 bp，包括ORF 2388 bp，5'UTR 343 bp，3'UTR 4196 bp，編碼795個氨基酸。利用BioEdit和MEGA 7.0分別進行氨基酸序列比對分析及構(gòu)建基于CRTC2氨基酸序列同源性的系統(tǒng)發(fā)育進化樹，結(jié)果顯示28個物種分別歸屬于四大類（哺乳綱、爬行綱、鳥綱和硬骨魚綱），表明CRTC2氨基酸序列在不同種屬間高度保守，其中尼羅羅非魚與紅鰭東方鲀的親緣關(guān)系最近。

為掌握尼羅羅非魚CRTC2基因的表達規(guī)律，本研究首先用qRT-PCR檢測正常投喂尼羅羅非魚白肌、紅肌、心臟、脾臟、肝臟、腎臟、腦組織和腸道等8個不同組織/器官中CRTC2基因mRNA的表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CRTC2基因在尼羅羅非魚的各組織/器官中均有表達，但以腦組織和白肌的表達量較高;同時對比分析正常投喂及饑餓7和15 d后尼羅羅非魚白肌中CRTC2基因的表達量，結(jié)果顯示饑餓7 d的尼羅羅非魚白肌CRTC2基因表達量與正常投喂尼羅羅非魚無顯著差異，但饑餓15 d后CRTC2基因的mRNA表達顯著上調(diào)，表明長期饑餓會增強CRTC2基因在尼羅羅非魚中的表達，推測CRTC2基因通過影響尼羅羅非魚攝食而調(diào)節(jié)糖代謝和脂肪代謝，直接或間接影響其能量吸收和代謝，但具體機理有待進一步探究。

4 結(jié)論

尼羅羅非魚各組織/器官中CRTC2基因的表達具有一定規(guī)律性，長期饑餓會影響CRTC2基因表達，即CRTC2可能與糖代謝密切相關(guān)，直接或間接影響尼羅羅非魚的能量吸收和代謝。因此，尼羅羅非魚CRTC2基因可作為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控糖代謝的候選基因。

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